CN113957116B - 基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测l-丝氨酸的方法 - Google Patents

基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测l-丝氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L‑丝氨酸的方法，属于氨基酸检测技术领域。包括：待测样品与含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质，根据所述大肠杆菌活细胞红色物质的颜色变化定性或半定量检测所述待测样品中L‑丝氨酸的含量，或者通过测定所述大肠杆菌活细胞裂解液的吸光度定量检测样品中L‑丝氨酸的含量。本发明公开的检测方法工艺简便、反应步骤少，活细胞内酶活性稳定，既能直观定性又能精确定量，还能有效的防止D‑丝氨酸、环‑丝氨酸、丝氨酸类似物以及其它氨基酸的干扰，为各行业快速对L‑丝氨酸定性或定量检测提供科学的方法。

Description

基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及氨基酸检测技术领域，涉及基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法。
背景技术
L-丝氨酸是一类极性氨基酸，属于人体非必需氨基酸，参与人体蛋白质、嘌呤、嘧啶、磷脂的生物合成，在人类免疫调节和肿瘤代谢等过程发挥重要的功能，有研究认为尿液中L-丝氨酸的含量有望成为部分癌症的肿瘤标志物，用于辅助诊断肿瘤或者判断预后。另外，L-丝氨酸还广泛应用于氨基酸输液和营养添加剂和高级化妆品中。因此提供一种快速简便测定混合氨基酸中L-丝氨酸的含量的检测方法，尤其能排除D-丝氨酸、环丝氨酸、丝氨酸类似物和丝氨酸衍生物干扰的检测技术，对L-丝氨酸的开发利用具有极其重要的意义。
目前，国内外用来检测氨基酸含量的方法主要分为仪器法、显色法、化学发光法和酶反应法等，仪器检测方法通常有HPLC、GC-MS、LC-MS、NMR和氨基酸自动分析仪等，显色法有变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法以及茚三酮显色法，化学发光法主要是毛细管电泳-电致化学发光法，酶法有丝氨酸氨基转移酶法和胱硫醚裂解酶法等。
其中液相色谱法、气相色谱法以及色谱质谱联用等仪器法灵敏度好，准确度高，但需要昂贵的仪器设备、专门实验室、受专业培训的实验人员以及高昂的费用维护成本和较高的实验耗材。茚三酮显色法作为最基本和最传统的检测方法，其操作简便、反应快速，但是其对反应条件的要求较高，需要对反应温度、pH、时间进行精确控制，并且对不同种类的氨基酸具有不同的灵敏度，不适合分析对精确性要求较高的样品。荧光猝灭法可以避免大部分氨基酸的干扰，但是样品需要经过复杂的磷酰化预处理，并且检测结果误差较大。纸层析-分光光度法操作简便，但是其稳定性差，不适用大批量样品的分析检测。变色酸-分光光度法反应速度快，操作简单，准确度高，但抗干扰能力差。
酶反应法具有良好的专属性和精准性，但目前所用的酶法反应步骤多，影响测定因素多，检测信号往往不能直接观察或者不能直接测定，另外酶的稳定性差，不易于储存。因此非常有必要发展一种反应简便且反应后可以直接肉眼观察的活细胞酶法测定L-丝氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，通过用含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞与L-丝氨酸孵育，开发一种新的L-丝氨酸的活细胞检测方法，实现裸眼直观定性或者半定量检测，以及定量检测L-丝氨酸的含量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，包括：待测样品与含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质，根据所述大肠杆菌活细胞红色物质的颜色变化定性或半定量检测所述待测样品中L-丝氨酸的含量，或者通过测定所述大肠杆菌活细胞裂解液的吸光度定量检测样品中L-丝氨酸的含量。
优选的是，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞按照体积比1:5-10混合孵育。
优选的是，孵育条件为：32-37℃，200-250rpm震荡培养2-12h。
优选的是，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质后，裸眼直接观察红色产生与否定性判断待测样品是否含有L-丝氨酸，并且将所产生红色的颜色深浅与L-丝氨酸标准液构建的比色卡对比，半定量判断待测样品中L-丝氨酸的含量范围。
优选的是，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质后，破碎离心，收集上清液，测定所述上清液的吸光度，然后将所述吸光度代入L-丝氨酸标准液构建的标准曲线中，定量测定所述待测样品中的L-丝氨酸含量。
优选的是，含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞的制备方法包括：
将含有半胱氨酸脱硫酶IscS的pBAD表达载体pBISCS转化入大肠杆菌MC4100中，构建pBISCS/MC4100菌株；
将所述pBISCS/MC4100菌株接种含于有氨苄青霉素的LB液体培养基，获取OD600为0.6-0.8的菌液，然后用L-***糖诱导2-3h，收获菌体；
用M9缓冲液洗涤1-2次，再重悬于含有氯霉素和氨苄青霉素的M9缓冲液中，得到所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞。
优选的是，编码所述半胱氨酸脱硫酶IscS的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明公开了以下技术效果：
发明人在前期的研究中发现大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶在一种IscA/SufA双蛋白缺陷的细菌中表达，肉眼观察该酶变成了红色，紫外可见分光光度计扫描在528nm处具有稳定的特征性吸收峰，但是红色物质在细胞内生成的机制并不清楚。而通过进一步深入研究发现该稳定红色物质的在细胞内的生成的一个主要因素是L-丝氨酸，更为重要的是红色的深浅，以及528nm处的吸收峰的高低与培养基中添加的L-丝氨酸呈现剂量依赖关系。基于此原创性的发现，发明人优化了L-丝氨酸酶法检测技术，研发了本申请基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法。
具体的，本发明是将L-丝氨酸样品与含有半胱氨酸脱硫酶的大肠杆菌活细胞孵育后生成红色物质，通过红色物质的颜色深浅，或者通过测定细菌细胞裂解液在528nm处的吸光度，对样品中的L-丝氨酸进行定性和定量测定。本发明所设计的工艺简便、反应步骤少，活细胞内酶活性稳定，既能直观定性又能精确定量，还能有效的防止D-丝氨酸、环-丝氨酸、丝氨酸类似物以及其它氨基酸的干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同氨基酸与全细胞反应结果，其中IscS为不加氨基酸的对照，“+”后的大写英文字母为氨基酸种类的缩写，其构型均为L型；
图2为最佳孵育时间和线性范围的确定，A为最佳孵育时间的确定，加入过量L-丝氨酸浓度(4mM)，反应不同的时间取出进行528nm吸光度测定，并与时间绘制曲线；B为最佳线性范围确定，不同浓度氨基酸与活细胞均反应3h，后测定528nm吸光度，绘制浓度依赖曲线。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞定量检测L-丝氨酸的方法
1、反应活细胞准备：
将含有半胱氨酸脱硫酶IscS(编码IscS的基因序列如SEQ ID NO：1所示)的pBAD表达载体pBISCS转化入大肠杆菌MC4100中，即pBISCS/MC4100菌株，命名为WMU-013。
将保存的大肠杆菌WMU-013接种在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，250rpm条件下震荡过夜培养12-16h，将培养过夜的菌液以1:100的比例稀释到500mL新鲜准备的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，同样的条件，继续培养OD600nm至0.6，再用0.02％L-***糖诱导3h，离心收集菌体，并用50mL M9缓冲液(12.8g/LNa2HPO4·7H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl)洗涤1次后，重悬于含有34mg/mL氯霉素和100mg/mL氨苄青霉素的相同缓冲液中(250mL)，以50mL/份进行分装，待用。
SEQ ID NO：1：
ATGGAATTACCGATTTATCTCGACTACTCCGCAACCACGCCGGTGGACCCGCGTGTTGCCGAGAAAATGATGCAGTTTATGACGATGGACGGAACCTTTGGTAACCCGGCCTCCCGTTCTCACCGTTTCGGCTGGCAGGCTGAAGAAGCGGTAGATATCGCCCGTAATCAGATTGCCGATCTGGTCGGCGCTGATCCGCGTGAAATCGTCTTTACCTCTGGTGCAACCGAATCTGACAACCTGGCGATCAAAGGTGCAGCCAACTTTTATCAGAAAAAAGGCAAGCACATCATCACCAGCAAAACCGAACACAAAGCGGTACTGGATACCTGCCGTCAGCTGGAGCGCGAAGGTTTTGAAGTCACCTACCTGGCACCGCAGCGTAACGGCATTATCGACCTGAAAGAACTTGAAGCAGCGATGCGTGACGACACCATCCTCGTGTCCATCATGCACGTAAATAACGAAATCGGCGTGGTGCAGGATATCGCGGCTATCGGCGAAATGTGCCGTGCTCGTGGCATTATCTATCACGTTGATGCAACCCAGAGCGTGGGTAAACTGCCTATCGACCTGAGCCAGTTGAAAGTTGACCTGATGTCTTTCTCCGGTCACAAAATCTATGGCCCGAAAGGTATCGGTGCGCTGTATGTACGTCGTAAATCGCGCGTACGCATCGAAGCGCAAATGCACGGCGGCGGTCACGAGCGCGGTATGCGTTCCGGCACTCTGCCTGTTCACCAGATCGTCGGAATGGGCGAGGCCTATCGCATCGCAAAAGAAGAGATGGCGACCGAGATGGAACGTCTGCGCGGCCTGCGTAACCGTCTGTGGAACGGCATCAAAGATATCGAAGAAGTTTACCTGAACGGTGACCTGGAACACGGTGCGCCGAACATTCTCAACGTCAGCTTCAACTACGTTGAAGGTGAGTCGCTGATTATGGCGCTGAAAGACCTCGCAGTTTCTTCAGGTTCCGCCTGTACGTCAGCAAGCCTCGAACCGTCCTACGTGCTGCGCGCGCTGGGGCTGAACGACGAGCTGGCACATAGCTCTATCCGTTTCTCTTTAGGTCGTTTTACTACTGAAGAAGAGATCGACTACACCATCGAGTTAGTTCGTAAATCCATCGGTCGTCTGCGTGACCTTTCTCCGCTGTGGGAAATGTACAAGCAGGGCGTGGATCTGAACAGCATCGAATGGGCTCATCATCATCATCATCATTGA
2、制备1M L-丝氨酸标准液
3、最佳孵育时间和线性范围的确定
A、确定孵育时间
将待测L-丝氨酸(4mM)与活细胞悬液按照1:10混合，37℃，250rpm震荡培养不同时间，破碎细胞离心取上清，测定上清液528nm吸光度，以时间为横轴，以528nm吸光度值为纵轴绘制曲线。
B、确定线性范围
将系列浓度的L-丝氨酸标准液与活细胞悬液混合，37℃，250rpm震荡培养3h，裸眼观察颜色深浅并拍照建立比色卡后，破碎细胞离心取上清，测定上清液528nm吸光度，以浓度为横轴，以528nm吸光度值为纵轴绘制浓度依赖曲线。
4、绘制标准曲线
以标准液浓度为横坐标，528nm吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合，获得曲线方程和R2值
5、定量待测样品的浓度
根据方程和待测样品管的吸光度值可以求得待测样品中L-丝氨酸浓度。
6、结果与分析
裸眼观察以及比色卡结果显示，标准的L-丝氨酸在0-1mM浓度范围与活细胞悬液反应后的颜色由淡黄色变为淡粉色并逐渐加强变为红色。通过裸眼观察颜色的变化具备很好的区分度，不同的颜色及颜色的深浅能很好的反映L-丝氨酸的有和无，以及浓度的高低。由此可知，此发明定性/半定量检测L-丝氨酸的实验方法可行，其方便快捷。
如图2A所示，L-丝氨酸与活细胞悬液孵育后很快有响应，在0-3h内呈现线性增加，之后趋于平缓稳定，12h后下降，为了减少测定时间，选择3h作为最佳孵育时间。
如图2B所示，不同浓度L-丝氨酸与活细胞悬液孵育3h，上清液代表红色的528nm吸光度值随着L-丝氨酸浓度的增加逐渐升高，在0-1mM浓度范围内呈线性增加，之后趋于平缓，由此可见检测L-丝氨酸的线性范围在0-1mM。
实施例2抗其它氨基酸干扰能力的检测
将待测L-丝氨酸和其它L型氨基酸(4mM)各500μL分别与500μL活细胞悬液混合，37℃，250rpm震荡培养3h，裸眼观察颜色深浅并拍照。
如图1所示，只有L-丝氨酸与活细胞悬液孵育后呈现红色，其它氨基酸及不加氨基酸的对照都呈现浅黄色，表明该方法可以直接肉眼观察红色的产生与否判断是否含有L-丝氨酸，同时也不难分析出本方法具备较好的抗其它氨基酸干扰的能力，具有较好的特异性；另外用该方法还检测了其他类型氨基酸，实验结果证实，该检测方法对D-丝氨酸、环丝氨酸和丝氨酸的衍生物均具有较好的抗干扰能力。上述结果表明利用本方法定性检测L-丝氨酸可行，简便易行，且具备较好的特异性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaattac cgatttatct cgactactcc gcaaccacgc cggtggaccc gcgtgttgcc 60
gagaaaatga tgcagtttat gacgatggac ggaacctttg gtaacccggc ctcccgttct 120
caccgtttcg gctggcaggc tgaagaagcg gtagatatcg cccgtaatca gattgccgat 180
ctggtcggcg ctgatccgcg tgaaatcgtc tttacctctg gtgcaaccga atctgacaac 240
ctggcgatca aaggtgcagc caacttttat cagaaaaaag gcaagcacat catcaccagc 300
aaaaccgaac acaaagcggt actggatacc tgccgtcagc tggagcgcga aggttttgaa 360
gtcacctacc tggcaccgca gcgtaacggc attatcgacc tgaaagaact tgaagcagcg 420
atgcgtgacg acaccatcct cgtgtccatc atgcacgtaa ataacgaaat cggcgtggtg 480
caggatatcg cggctatcgg cgaaatgtgc cgtgctcgtg gcattatcta tcacgttgat 540
gcaacccaga gcgtgggtaa actgcctatc gacctgagcc agttgaaagt tgacctgatg 600
tctttctccg gtcacaaaat ctatggcccg aaaggtatcg gtgcgctgta tgtacgtcgt 660
aaatcgcgcg tacgcatcga agcgcaaatg cacggcggcg gtcacgagcg cggtatgcgt 720
tccggcactc tgcctgttca ccagatcgtc ggaatgggcg aggcctatcg catcgcaaaa 780
gaagagatgg cgaccgagat ggaacgtctg cgcggcctgc gtaaccgtct gtggaacggc 840
atcaaagata tcgaagaagt ttacctgaac ggtgacctgg aacacggtgc gccgaacatt 900
ctcaacgtca gcttcaacta cgttgaaggt gagtcgctga ttatggcgct gaaagacctc 960
gcagtttctt caggttccgc ctgtacgtca gcaagcctcg aaccgtccta cgtgctgcgc 1020
gcgctggggc tgaacgacga gctggcacat agctctatcc gtttctcttt aggtcgtttt 1080
actactgaag aagagatcga ctacaccatc gagttagttc gtaaatccat cggtcgtctg 1140
cgtgaccttt ctccgctgtg ggaaatgtac aagcagggcg tggatctgaa cagcatcgaa 1200
tgggctcatc atcatcatca tcattga 1227

Claims (6)

1.一种基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，包括：待测样品与含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育，直接肉眼观察红色的产生与否判断是否含有L-丝氨酸，或通过上清液528nm吸光度进行测定检测样品中L-丝氨酸的含量；
编码所述半胱氨酸脱硫酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞按照体积比1:5-10混合孵育。
3.如权利要求1所述的基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，孵育条件为：32-37℃，200-250rpm震荡培养2-12h。
4.如权利要求1所述的基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质后，裸眼直接观察红色产生与否定性判断待测样品是否含有L-丝氨酸，并且将所产生红色的颜色深浅与L-丝氨酸标准液构建的比色卡对比，半定量判断待测样品中L-丝氨酸的含量范围。
5.如权利要求1所述的基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，所述待测样品与所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞孵育生成红色物质后，破碎离心，收集上清液，测定所述上清液的吸光度，然后将所述吸光度代入L-丝氨酸标准液构建的标准曲线中，定量测定所述待测样品中的L-丝氨酸含量。
6.如权利要求1所述的基于含半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞的制备方法包括：将含有半胱氨酸脱硫酶IscS的pBAD表达载体pBISCS转化入大肠杆菌MC4100中，构建pBISCS/MC4100菌株；
将所述pBISCS/MC4100菌株接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，获取OD600为0.6-0.8的菌液，然后用L-***糖诱导2-3h，收获菌体；
用M9缓冲液洗涤1-2次，再重悬于含有氯霉素和氨苄青霉素的M9缓冲液中，得到所述含有半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌活细胞。
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