CN112500382B - 一种可逆检测二氧化硫/甲醛的比率荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents
一种可逆检测二氧化硫/甲醛的比率荧光探针、制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可逆检测二氧化硫/甲醛的比率荧光探针、制备方法与应用,具体地,本发明可用于测量、检测或筛选二氧化硫/甲醛及活细胞荧光成像,尤其是其可逆的比色比率检测二氧化硫/甲醛,这类探针可实现如下技术效果中的至少一个:可逆检测二氧化硫/甲醛、比色比率检测、高选择性识别二氧化硫/甲醛、可以快速对二氧化硫/甲醛实现响应、可以实现对二氧化硫/甲醛灵敏分析、可生理水平条件下检测二氧化硫/甲醛、合成简单以及性质稳定。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域,具体涉及一种基于香豆素类化合物的可逆检测二氧化硫/甲醛荧光探针及其在测量、检测或筛选二氧化硫/甲醛及活细胞荧光成像方法中的应用;本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
在生命***中,甲醛作为一种活性羰基类物质在维持碳循环代谢的过程中发挥着重要的作用,甲醛是由去甲基酶、氧化酶内生生成,如赖氨酸特异性去甲基酶、氨基敏感胺氧化酶等。生物体内甲醛的浓度水平与空间记忆和认知能力相关,然而,甲醛的异常积累可能会引起蛋白质和DNA损伤,进而引发多种疾病,包括阿尔茨海默病、胚胎畸形、呼吸疾病、心脏病和癌症。据报道,甲醛也自然地存在于人类细胞和不同的生物体中,在正常生理条件下,甲醛在细胞内以相对高浓度存在时,某些特定的细胞器内最高可达0.5mM,并且人体血液中甲醛的正常水平约为0.06-0.08mM,由于甲醛的危害性和在生物***中的重要性,所以需要探寻一种灵敏的检测甲醛的方法,以期实现对生命体内甲醛的原位检测。
生命体内,SO2和甲醛之间存在微妙的平衡,来维持内稳态。尽管如此,潜在的相互作用由于缺乏现场监测SO2和甲醛之间动态变化的方法,复杂生物***中的SO2和甲醛的相互影响仍然是未知的。因此,开发强有力的化学工具来研究SO2和甲醛之间可能的动态变化是非常迫切和重要的。在生命***中。这些分子工具对于了解SO2和甲醛在生物体中的作用和关系的病理生理学方面是极其重要的。
由于高灵敏度和显著的时空分辨率,荧光探针作为一种非侵入性工具应用于生物成像中分析物测定。到目前为止,用于生物体中二氧化硫/甲醛检测的可逆比率的荧光探针相对缺乏,探索一种新型高效荧光探针快速检测环境和活细胞中的甲醛和二氧化硫仍然是一个热点问题。因此,发展快速高灵敏高选择性荧光探针,尤其是能够可逆的比色比率荧光探针,成为本领域技术人员亟需解决的课题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是在于提供一类制备简单的快速高灵敏高选择性的可逆的比色比率的二氧化硫/甲醛荧光探针,以及它们的制备方法和用途,具有合成简单、选择性好、灵敏度高、响应迅速的特点,并且能够在生理水平条件下对二氧化硫/甲醛进行有效测量、检测或筛选,尤其是其能够比色比率的对二氧化硫/甲醛进行定性和定量分析。
具体而言,本发明提供了一种化合物,具有式(Ⅰ)所示的结构:
式(I)中,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8和R9为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组;且其中的R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8和R9可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的化合物是R1,R2,R3,R4,R5, R6,R7,R8和R9均为氢原子的式(I)化合物,其结构式如下:
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法,包括如下步骤:使式(III)化合物与水合肼反应制备得式(I)化合物,其反应式如下:
式(Ⅰ)、(Ⅳ)和(Ⅲ)中:R1,R2,R3,R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组;且其中的R1,R2,R3,R4和R5可以相同或不同。
具体而言,将式(III)化合物与式(Ⅳ)化合物溶于甲烷磺酸中,回流反应,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到纯净的式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中,所述式(III)化合物与水合肼的摩尔比为1:1-1:5。
在本发明的一些具体实施方案中,所述反应时间为0.5-24小时。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选二氧化硫/甲醛的荧光探针组合物,其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中,所述式(I)化合物具有以下结构:
在本发明的一些具体实施方案中,所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中二氧化硫/甲醛的存在或测定样品中的二氧化硫/甲醛含量的方法,其包括:
a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光变化的化合物;
b)测定所述荧光变化的化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中,所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中,所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中二氧化硫/甲醛的存在或测定样品中的二氧化硫 /甲醛含量的试剂盒,其包含所述式(I)或式(II)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(II)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果:
(1)可逆比率检测二氧化硫/甲醛
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针能够同时有效的检测二氧化硫/甲醛的含量,并且可以比率检测二氧化硫和甲醛,有效减少背景干扰。
(2)比色检测二氧化硫/甲醛
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针二氧化硫/甲醛,方便定性分析。
(3)选择性高,抗干扰能力强
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针可选择性的与二氧化硫/甲醛发生特异性反应,生成荧光变化的产物,相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质,包括但不限于空白、氯化钠、氯化钾、氯化钙、甲醛、硫酸镁、硝酸锌、硫酸铁、硫酸镍、硫酸铜、硫酸铬、溴化钠、氟化钾、硝酸钠、亚硝酸钠、半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、羟基自由基、过氧化亚硝酸盐、硫氢化钠、乙醛等,本发明荧光探针显示出了较高的选择性,并且抗干扰能力强。
(4)灵敏度高,响应快速
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针与二氧化硫/甲醛反应非常灵敏,并且响应快速,从而有利于对二氧化硫/甲醛的检测。
(5)可生理水平条件下应用
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针可在生理水平条件下应用,并且,生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小,可以应用于活细胞荧光成像。
(6)稳定性好
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针的稳定性好,进而能够长期保存使用。
(7)合成简单
本发明的二氧化硫/甲醛荧光探针合成简单,有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a是探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(10μM)后在485nm处的响应时间。
图1b是探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(10μM)后在685nm处的响应时间。
图2a是探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液中加入甲醛(200 μM)后在485nm处的响应时间。
图2b是探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液中加入甲醛(200 μM)后在685nm处的响应时间。
图3是荧光探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(0-5μM)的荧光光谱变化图。
图4是不同浓度亚硫酸氢钠(0-5μM)对探针(5μM)的线性关系图。
图5是荧光探针(5μM)和亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液加入甲醛(0-50μM)的荧光光谱变化图。
图6是不同浓度甲醛(0-50μM)对探针(5μM)和亚硫酸氢钠(10μM)反应溶液的线性关系图。
图7是不同离子分析物对探针(5μM)的荧光强度。分析物分别空白、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硝酸锌、硫酸铁、硫酸镍、硫酸铜、硫酸铬、溴化钠、氟化钾、硝酸钠、亚硝酸钠、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(1mM)、过氧化氢、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、羟基自由基、过氧化亚硝酸盐、硫氢化钠、乙醛(200μM)、甲醛(200μM)和亚硫酸氢钠(5μM)(除特殊标明外,其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在F485/F685 nm的荧光强度比值。
图8是不同离子分析物对探针(5μM)和亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液的荧光强度。分析物分别空白、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硝酸锌、硫酸铁、硫酸镍、硫酸铜、硫酸铬、溴化钠、氟化钾、硝酸钠、亚硝酸钠、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(1mM)、过氧化氢、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、羟基自由基、过氧化亚硝酸盐、硫氢化钠、乙醛 (200μM)和甲醛(200μM)(除特殊标明外,其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在F685/F485 nm的荧光强度比值。
图9是探针(10μM)被成功应用于斑马鱼中的甲醛的检测。a1-a2是斑马鱼孵育探针(10μM),b1-b2是斑马鱼孵育探针(10μM),然后再孵育亚硫酸氢钠(100 μM),c1-c2是斑马鱼孵育探针(10μM),然后再孵育亚硫酸氢钠(100μM),最后再孵育甲醛(200μM)。
图10是荧光探针比色性能测试结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例,本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1:式(II)化合物的合成
合成设计路线如下:
实施方案1:将式204mg(1mmol)(Ⅴ)化合物与193mg(1mmol)4- (二乙氨基)水杨醛溶于5mL甲烷磺酸中,90℃回流6h,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入6mL高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到蓝色产物258mg,产率为 56%。
实施方案2:将式204mg(1mmol)(Ⅴ)化合物与386mg(2mmol)4- (二乙氨基)水杨醛溶于5mL甲烷磺酸中,90℃回流6h,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入6mL高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到蓝色产物295mg,产率为 64%。
实施方案3:将式204mg(1mmol)(Ⅴ)化合物与579mg(3mmol)4- (二乙氨基)水杨醛溶于5mL甲烷磺酸中,90℃回流6h,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入6mL高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到蓝色产物313mg,产率为 68%。
实施方案4:将式204mg(1mmol)(Ⅴ)化合物与772mg(4mmol)4- (二乙氨基)水杨醛溶于5mL甲烷磺酸中,90℃回流6h,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入6mL高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到蓝色产物368mg,产率为 80%。
实施方案5:将式204mg(1mmol)(Ⅴ)化合物与772mg(4mmol)4- (二乙氨基)水杨醛溶于5mL甲烷磺酸中,90℃回流2h,待反应完毕后,冷却至室温后,倒入冰水中,并加入6mL高氯酸,抽滤得到粗产品;粗产品进一步通过色谱柱进行分离,二氯甲烷为洗脱剂,可得到蓝色产物239mg,产率为 52%。
实施例2:测试荧光探针对于亚硫酸钠的时间动力学
从探针母液中取出25μL置于5mL的测试体系,然后将10μM的亚硫酸氢钠加入到测试体系中,摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(20mM PBS,pH 7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
测试结果如图1a和1b所示,30s左右,485nm处和685nm处的荧光强度值分别达到最大值和最小值并保持不变,这说明该探针与亚硫酸氢钠反应迅速,能够为亚硫酸氢钠的测定提供快速的分析方法。
实施例3:测试荧光探针和亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液对于甲醛的时间动力学
将探针和亚硫酸氢钠反应后溶液置于5mL的测试体系,然后将200μM的甲醛加入到测试体系中,摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(20mM PBS,pH 7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
测试结果如图2a和2b所示,当甲醛计入后3min后,485nm处和685nm 处的荧光强度值分别达到最小值和最大值并保持不变,这说明该探针与甲醛反应迅速,能够为亚甲醛的测定提供快速的分析方法。
实施例4:测试荧光探针对于亚硫酸氢钠的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中,然后将不同浓度的亚硫酸氢钠加入到测试体系中,摇晃均匀后静置1分钟。上述测定是在PBS 缓冲溶液(20mM PBS,pH7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1 中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
用荧光光谱仪测试其荧光强度变化,从图3可以清晰的看出,随着加入亚硫酸氢钠浓度的增加,485nm处的荧光强度逐渐增强,685nm处的荧光强度逐渐减弱。并且,由图4可以看出,在比率F485/F685处,荧光探针(5μM)加入亚硫酸氢钠(0-5μM)之后荧光强度呈现了良好的线性关系,这证明借助于该荧光探针能够对亚硫酸氢钠进行定量分析。
实施例4:测试荧光探针和亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液加入甲醛的浓度梯度
配置多个亚硫酸氢钠(10μM)和探针(5μM)反应后的的平行样品于10 mL比色管中,然后将不同浓度的甲醛加入到测试体系中,摇晃均匀后静置3分钟。上述测定是在PBS缓冲溶液(20mM PBS,pH 7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
用荧光光谱仪测试其荧光强度变化,从图5可以清晰的看出,随着加入甲醛浓度的增加,485nm处的荧光强度逐渐减弱,685nm处的荧光强度逐渐增强,荧光强度得到恢复。并且,由图6可以看出,在比率F685/F485处,荧光探针(5 μM)和亚硫酸氢钠(10μM)反应溶液加入甲醛(0-50μM)之后荧光强度呈现了良好的线性关系,这证明借助于该荧光探针能够对甲醛进行定量分析。
实施例5:测试荧光探针对亚硫酸氢钠识别的选择性
分析物分别为空白、氯化钠、氯化钾、氯化钙、甲醛、硫酸镁、硝酸锌、硫酸铁、硫酸镍、硫酸铜、硫酸铬、溴化钠、氟化钾、硝酸钠、亚硝酸钠、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(1mM)、过氧化氢、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、羟基自由基、过氧化亚硝酸盐、硫氢化钠、乙醛(200μM)、甲醛(200μM)和亚硫酸氢钠(10μM)(除特殊标明外,其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在F485/F685 nm的荧光强度比值。上述测定是在纯水(20mM PBS,pH 7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。具体地,配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中,然后加入一定量的分析物,摇匀,待1分钟后测定。
从图7可以看出,生物体内存在的常见离子不会明显干扰探针对亚硫酸氢钠的荧光强度,因此探针具有良好的选择性。
实施例6:测试荧光探针和亚硫酸氢钠(10μM)反应后的溶液对甲醛识别的选择性
分析物分别为空白、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硝酸锌、硫酸铁、硫酸镍、硫酸铜、硫酸铬、溴化钠、氟化钾、硝酸钠、亚硝酸钠、半胱氨酸(500 μM)、谷胱甘肽(1mM)、过氧化氢、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、羟基自由基、过氧化亚硝酸盐、硫氢化钠、乙醛(200μM) 和甲醛(200μM)(除特殊标明外,其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在F685/F485 nm的荧光强度比值。上述测定是在纯水(20mM PBS,pH 7.4,10%EtOH)中进行的,所使用的探针是实施例1中所制备的探针,且所有光谱测试都是在25℃下测得的。具体地,配置多个亚硫酸氢钠(10μM)和探针(5μM)反应后的的平行样品于10mL比色管中,然后加入一定量的分析物,摇匀,待5分钟后测定。
从图8可以看出,生物体内存在的常见离子不会明显干扰探针对甲醛的荧光强度,因此探针具有良好的选择性。
实施例7:荧光探针对斑马鱼细胞中甲醛检测的荧光成像
首先将探针(10μM)孵育斑马鱼20分钟,去除培养液,并用养鱼水洗涤3 次,采集蓝色通道和红色通道的荧光。另外,在孵育完探针后的斑马鱼培养液中加入亚硫酸氢钠(100μM)孵育斑马鱼30分钟,红色荧光减弱,蓝色荧光增强。另一方面,在孵育完探针和亚硫酸氢钠后的斑马鱼培养液中加入甲醛(200 μM)孵育30分钟,探针荧光恢复,即红色荧光增强,蓝色荧光减弱。最后用共聚焦荧光显微镜对细胞进行荧光成像。结果参见图9。
实施例8:荧光探针比色性能测试
从探针母液中取出25μL置于5mL的测试体系,溶液颜色呈现蓝色,然后将10μM的亚硫酸氢钠加入到测试体系中,摇晃均匀后溶液颜色变为黄色。结果如图10所示。
虽然用上述实施方式描述了本发明,应当理解的是,在不背离本发明的精神的前提下,本发明可进行进一步的修饰和变动,且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
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