CN105884806B - 荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法，通过对氟硼荧光染料母环进行结构修饰，合成了一种水溶性较强的荧光探针，基于土霉素对该探针具有很好的，高灵敏度的荧光猝灭作用，根据加入土霉素标准溶液前后荧光探针的荧光强度的变化值和酸土霉素的浓度建立线性公式，再在相同条件下检测加入含土霉素样品前后探针的荧光强度，即可根据荧光强度的变化推算出样品中土霉素的含量。本发明避免使用相关的毒性试剂，无需使用昂贵仪器，同时缩短了检测时间，提高了检测灵敏度和特异性，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法。
背景技术
抗生素是一类特殊药品,可用于人类疾病的感染治疗，或作为兽药以防止牲畜的细菌感染和增加它们的增长率。土霉素(Oxytetlacycline,OTC)，别名地霉素，地灵霉素，氧四环素，四环素等，属于四环素类抗生素，广泛用于动物感染性疾病的治疗。在动物饲料中，其经常作为兽药抗生素和生产促进剂而广泛使用，已经导致它在食品，如肉，奶和蛋制品积累，并已经对人体健康造成了严重威胁。我国是抗生素的生产和使用大国，仅2003年我国仅土霉素产量就达到了一万吨，占世界土霉素生产总量的65％。随着环境中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检测就越来越重要，而抗生素的检测方法成为相关研究的重要因素。
用于探测土霉素的传统方法主要有以下几种：酶联免疫吸附法，色谱法和毛细管电泳法，包括色谱质谱连用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。然而这些方法，要么是步骤繁琐，且所用的试剂多是一些环境不友好型试剂；要么需要使用到复杂而昂贵的仪器和较长的检测时间，实用性差。因此，发展一种高效快速的土霉素检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于客服现有技术的不足，提供一种合成简单、成本较低、反应条件温和的荧光探针的制备方法，并利用该探针对食品、环境、生物样品等中的土霉素进行荧光检测。该检测方法具有灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强等诸多优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N2保护下，用滴液漏斗向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼***络合物，于常温下充分搅拌，反应8-9小时；
所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼***络合物的摩尔比为2：1：6-8；
(2)在冰浴的环境下，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌3.5-4小时后停止反应；
所加入的三乙胺与三氟化硼***络合物的摩尔比为1：1-1.25；
(3)将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下层极性较大的二氯甲烷层(黄绿色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2-2.5:1；
(4)将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩至干，收集固体，所述固体用二氯甲烷溶解后，用硅胶柱层析分离，收集中间一段亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到红棕色固体，即荧光探针。
所述硅胶柱层析分离采用的淋洗剂为甲醇和二氯甲烷的混合液，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:3-4。
本发明的另一目的在于提供一种基于本发明所述荧光探针的土霉素检测方法，包括以下步骤：
(1)绘制标准工作曲线：制备系列不同浓度的土霉素标准溶液，取若干支试管，分为空白荧光对照组和实验组，所有试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向实验组的试管中加入不同浓度的土霉素标准溶液，空白荧光对照组不加土霉素标准溶液，测定所有试管中溶液的荧光强度；
空白荧光对照组的荧光强度为F0，实验组的荧光强度为F，计算减弱的荧光强度△FI＝F0-F，以不同的土霉素的浓度C0与对应减弱的荧光强度△FI作图，绘制标准工作曲线；
(2)测定样品中土霉素浓度：按照步骤(1)的方法，向试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向试管中加入待检测样品，测定试管中加入样品前后溶液的荧光强度并计算变化值，将检测结果与标准工作曲线对比，推算出待检测样品中土霉素含量。
所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，荧光探针的摩尔浓度为1.0×10- 5mol/L。
所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为10-15mmol/L，pH＝7.0。
所述荧光强度测定参数为：激发光狭缝为1.5nm，发射光狭缝为1.5nm，激发光波长为358nm。
进一步，为确保荧光检测的准确性，加入土霉素标准溶液或待检测样品8-10min后再测定荧光强度。
本发明采用以上技术方案，使用荧光法检测土霉素，以氟硼荧光染料(BODIPY)为荧光团，其结构如下：
所采用的荧光探针的合成路线如下：
利用本发明的荧光探针检测样品中土霉素含量的原理为：在激发波长为358nm的条件下，荧光探针分子溶解于缓冲溶液(PBS,pH＝7.0)中，在502nm左右有很强的发射峰。当加入土霉素时，由于荧光探针可以在土霉素的作用下发生反应，使荧光大幅降低直至猝灭，因此探针分子在502nm处的发射峰明显降低，荧光强度减弱明显，溶液由亮绿色逐渐变为无色，肉眼即可观察到。
本发明所述的荧光探针合成简单，成本较低，对土霉素的选择性好、抗干扰能力强、响应速度快，使得该荧光探针在生物化学，食品科学等领域具有实际的应用价值。利用本发明的荧光探针检测土霉素具有灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强等诸多优点。
附图说明
图1是荧光探针检测土霉素的机理图；
图2为本发明的荧光探针与不同浓度土霉素溶液作用前后，荧光强度的变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；从a至n方向，土霉素溶液浓度依次增大；
图3为本发明的荧光探针的荧光强度变化值与土霉素浓度的线性关系，横坐标为土霉素浓度，纵坐标为荧光强度；
图4为本发明的荧光探针在不同pH值缓冲溶液中，与土霉素作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度；
图5为本发明荧光探针在PBS缓冲溶液中，与不同离子作用后的荧光强度，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图6为本发明的荧光探针与土霉素作用过程中，荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
以下实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。
一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N2保护下，用滴液漏斗向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼***络合物，于常温下充分搅拌，反应8-9小时；
所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼***络合物的摩尔比为2：1：6-8；
(2)在冰浴的环境下，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌3.5-4小时后停止反应；
所加入的三乙胺与三氟化硼***络合物的摩尔比为1：1-1.25；
(3)将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下层极性较大的二氯甲烷层(黄绿色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2-2.5:1；
(4)将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩至干，收集固体，所述固体用二氯甲烷溶解后，用硅胶柱层析分离，使用体积比为1:3-4的甲醇和二氯甲烷的混合液作为淋洗剂，收集中间一段亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到红棕色固体，即荧光探针。
一种基于本发明所述荧光探针的土霉素检测方法，包括以下步骤：
(1)绘制标准工作曲线：制备系列不同浓度的土霉素标准溶液，取若干支试管，分为空白荧光对照组和实验组，所有试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向实验组的试管中加入不同浓度的土霉素标准溶液，空白荧光对照组不加土霉素标准溶液，测定所有试管中溶液的荧光强度；
空白荧光对照组的荧光强度为F0，实验组的荧光强度为F，计算减弱的荧光强度△FI＝F0-F，以不同的土霉素的浓度C0与对应减弱的荧光强度△FI作图，绘制标准工作曲线；
(2)测定样品中土霉素浓度：按照步骤(1)的方法，向试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向试管中加入待检测样品，测定试管中加入样品前后溶液的荧光强度并计算变化值，将检测结果与标准工作曲线对比，推算出待检测样品中土霉素含量；
所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的体系中，荧光探针的摩尔浓度为1.0×10- 5mol/L，磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为10-15mmol/L，pH＝7.0；
本发明涉及到的荧光强度测定参数为：激发光狭缝为1.5nm，发射光狭缝为1.5nm，激发光波长为358nm，另外，为确保荧光检测的准确性，加入土霉素标准溶液或待检测样品8-10min后再测定荧光强度。
实施例1
一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N2保护下，用滴液漏斗向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼***络合物，于常温下充分搅拌，反应8小时；
所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼***络合物的摩尔比为2：1：6；
(2)在冰浴的环境下，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌3.5小时后停止反应；
所加入的三乙胺与三氟化硼***络合物的摩尔比为1：1；
(3)将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下层极性较大的二氯甲烷层(黄绿色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2:1；
(4)将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩至干，收集固体，所述固体用二氯甲烷溶解后，用硅胶柱层析分离，使用体积比为1:3的甲醇和二氯甲烷的混合液作为淋洗剂，收集中间一段亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到红棕色固体，即荧光探针。
实施例2
一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N2保护下，用滴液漏斗向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼***络合物，于常温下充分搅拌，反应9小时；
所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼***络合物的摩尔比为2：1：8；
(2)在冰浴的环境下，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌4小时后停止反应；
所加入的三乙胺与三氟化硼***络合物的摩尔比为1：1.25；
(3)将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下层极性较大的二氯甲烷层(黄绿色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2.5:1；
(4)将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩至干，收集固体，所述固体用二氯甲烷溶解后，用硅胶柱层析分离，使用体积比为1:4的甲醇和二氯甲烷的混合液作为淋洗剂，收集中间一段亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到红棕色固体，即荧光探针。
实施例3
一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)探针分子的合成：准确称取0.6701g吡咯和0.5031g戊二酸酐和25m无水二氯甲烷，迅速加入到100mL三口烧瓶中，在N2保护下，于室温下充分搅拌。3小时后，用滴液漏斗缓慢的向瓶中逐滴加入6.0mL的三氟化硼***络合物，控制滴加速度，滴完大约2h，再让其搅拌3h。随后，在冰浴条件下，用滴液漏斗缓慢的向三口烧瓶反应液中逐滴加入5mL的三乙胺，约1个半小时滴完。此时反应剧烈，反应液逐渐变为深棕色带少许墨绿的的混合溶液，再搅拌2h，停止反应。
(2)探针分子的纯化：用石油醚:二氯甲烷(体积比2:1)萃取上述反应液得黄绿色溶液，旋转蒸发后得橘黄色固体结晶，将固体结晶溶于少量CH2Cl2后，直接上样，硅胶柱层析分离(淋洗剂：V甲醇/V二氯甲烷＝1/4)，收集中间一段浅绿色部分，旋蒸后真空干燥5h，得到橘黄色固体纯品，即荧光探针。
实施例4：
土霉素含量的检测方法
绘制标准曲线：在5mL干净的具塞试管中，将荧光探针(1.0×10-5mol/L)溶于PBS缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中，再加入不同浓度的土霉素标准溶液(0到135uM)，分别测定加入土霉素标准溶液前后荧光探针的荧光强度，根据加入土霉素前后体系的发射峰处荧光强度的变化值和土霉素的浓度建立线性公式，绘制标准曲线(图3)。建立的线性公式如下:y＝7.35x-5.208(R2＝0.9929)，其中y为加入土霉素前后体系的荧光强度的减少值，即△FI,x为盐酸土霉素的浓度C0。
测定样品溶液中土霉素含量：在5mL干净的具塞试管中，将荧光探针(1.0×10- 5mol/L)溶于PBS缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中，再加入待测样品溶液(0到135uM)，分别测定加入待测样品溶液前后荧光探针的荧光强度，计算加入样品溶液后体系的发射峰处荧光强度的变化值，与标准曲线对比，推算出样品溶液中土霉素的含量。
实施例5：
荧光探针在不同pH值缓冲溶液中，与土霉素作用前后的荧光强度
将荧光探针(1.0×10-5mol/L)溶解在不同pH缓冲溶液中(pH＝3,4,5,6,7,8,9,10)，记录10min后，荧光探针的荧光强度随pH的变化，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。实验结果如图4所示，当pH值大于7时，探针的荧光强度直线下降。而pH小于7时，探针的荧光强度基本上能保持在一个稳定值。因此，该探针荧光强度在酸性条件下较稳定。故在实际测量中，可通过使用缓冲溶液或维持溶液的酸度以保持较为稳定的荧光强度。
实施例6：
荧光探针在PBS缓冲溶液中，与不同离子作用后的荧光强度
将荧光探针溶于缓冲溶液(PBS,pH＝7.0)中配制成1.5×10-5mol/L的溶液，向溶液中加入Ca2+,Hg2+,Cd2+,Mg2+,Na+,K+,Al3+,Sn2+,Co2+,Ni2+，Cu2+离子后，没有明显的荧光变化，但加入土霉素后引起了极为明显的荧光淬灭现象，该荧光探针对土霉素表现出高灵敏度、高选择性的识别，当土霉素分别与干扰物质Ca2+,Hg2+,Cd2+,Mg2+,Na+,K+,Al3+,Sn2+,Co2+,Ni2 +，Cu2+离子共存时，荧光探针不受干扰因素的影响，表现出来很好的抗干扰能力，如图5所示。
实施例7：
荧光探针与土霉素作用过程中荧光强度随时间的变化
测定本发明的荧光探针(1.0×10-5mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中，与土霉素作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，并设空白对照组(不加土霉素的荧光探针随时间的变化)。如图6所示，探针在一定时间内相对稳定，加入土霉素5min后，探针的荧光强度几乎已保持不变。
Claims (7)
1.一种基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：所述荧光探针由以下方法制备而成：
（1）称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N2保护下，向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼***络合物，于常温下充分搅拌，反应8-9小时；
所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼***络合物的摩尔比为2：1：6-8；
（2）在冰浴的环境下，向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌3.5-4小时后停止反应；
所加入的三乙胺与三氟化硼***络合物的摩尔比为1：1-1.25；
（3）将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集黄绿色溶液，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2-2.5:1；
（4）将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩，收集固体，所述固体用硅胶柱层析分离，收集亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到荧光探针；
基于所述荧光探针的土霉素检测方法包括以下步骤：
1）绘制标准工作曲线：制备系列不同浓度的土霉素标准溶液，取若干支试管，分为空白荧光对照组和实验组，所有试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向实验组的试管中加入不同浓度的土霉素标准溶液，空白荧光对照组不加土霉素标准溶液，测定所有试管中溶液的荧光强度；
空白荧光对照组的荧光强度为F0，实验组的荧光强度为F，计算减弱的荧光强度△FI=F0- F，以不同的土霉素的浓度C0与对应减弱的荧光强度△FI作图，绘制标准工作曲线；
2）测定样品中土霉素浓度：按照步骤1）的方法，向试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向试管中加入待检测样品，测定试管中加入样品前后溶液的荧光强度并计算变化值，将检测结果与标准工作曲线对比，推算出待检测样品中土霉素含量。
2.根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：荧光探针制备过程，所述硅胶柱层析分离采用的淋洗剂为甲醇和二氯甲烷的混合液，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:3-4。
3.根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：荧光探针制备过程，所述步骤（4）的干燥方法为真空干燥。
4.根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：土霉素检测过程，荧光强度测定参数为：激发光狭缝为1.5nm，发射光狭缝为1.5nm，激发光波长为358nm。
5.根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：土霉素检测过程，加入土霉素标准溶液或待检测样品8-10min后再测定荧光强度。
6. 根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：土霉素检测过程，所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，荧光探针的摩尔浓度为1. 0×10- 5mol /L。
7.根据权利要求1所述的基于荧光探针的土霉素检测方法，其特征在于：土霉素检测过程，所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为10-15mmol/L，pH=7.0。
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