CN113912591B - 联芳基化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了联芳基化合物，具体公开了式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐。

Description

联芳基化合物
本申请主张如下优先权：
CN202010652149.3，申请日2020年07月08日。
PCT/CN2020/133933，申请日2020年12月04日。
技术领域
本发明公开了作为Pan-RAF激酶抑制剂的联芳基化合物、其药学上可接受的盐，以及它们在治疗与癌症相关疾病中的应用。
背景技术
丝***原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是细胞内一条重要的信号转导通路，该通路通过RAS/RAF/MEK/ERK的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内，最终导致特定基因的激活，引起细胞增殖、凋亡或分化。该通路过度激活与多种肿瘤的发生密切相关。RAF是RAS/RAF/MEK/ERK信号通路中一个非常重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，位于RAS的下游，可以被RAS激活。RAF家族包括ARAF、BRAF、CRAF(RAF-1)三种亚型，具有高度的同源性和相似的结构域。野生型RAF能够产生三种亚型的同源或异源二聚体。ARAF和CRAF突变较少发生，BRAF突变率较高。约5％～10％的恶性肿瘤，包括66％的黑色素瘤患者存在BRAF突变。RAF激酶作为RAS下游的关键信号蛋白，在RAS突变基因突变肿瘤的治疗中具有重要的研究意义。通过抑制RAF激酶，调控MAPK信号传导，从而对RAS突变肿瘤细胞的增殖发挥作用。因此，RAF激酶已成为临床***的重要靶标。
第一代BRAF激酶抑制剂Vemurafenib和Dabrafenib已经被FDA批准用于发生B-RafV600E突变癌症的治疗。尽管Vemurafenib和Dabrafenib在B-RafV600E突变黑色素瘤的治疗上表现出可喜的疗效，但依然存在一定的局限性。大多数使用这两种药物的患者起初肿瘤缩小，但在一年内复发(获得性耐药性)；产生这一耐药的主要机制是MAPK信号通路被重新激活。研究发现在BRAF发生V600E突变的基础上，NRAS突变能够在抑制剂的存在下导致MAPK通路激活，产生耐药性。突变的N-Ras促进B-RafV600E和C-Raf形成同源或异源二聚体。抑制剂结合在二聚体的某个单体上，可降低药物对另一个单体的亲和力，促进无抑制剂作用的单体磷酸化，导致MEK的激活。目前，临床上克服MAPK通路被重新激活导致耐药性的主要方法是通过联合使用Raf和MEK抑制剂阻断MAPK通路的2个关键位点，以延缓耐药性产生。除此之外，开发新一代pan-Raf抑制剂以克服耐药性以及扩展临床应用范围也正在开发中，pan-RAF抑制剂可以抑制二聚体活性，阻断通路的反常激活(paradoxcal activation)，从而可以减耐药性。处于临床研究的的pan-Raf二聚体抑制剂主要有HM95573、TAK-580、BGB-283、LXH254，以及LY3009120等，这些新型RAF抑制剂的研发，有望克服第一代抑制剂的耐药性，进一步扩大临床应用。
发明内容
本发明提供式(I)化合物N-(3-(2-((1R,5S)-3-氧杂双环[3.1.0]己-1-基)-6-(2-羟基乙氧基)吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)异烟酰胺或其药学上可接受的盐，
本发明还提供下式化合物：
本发明还提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备RAF激酶抑制剂中的应用。
本发明还提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症药物中的应用。
在本发明的一些方案中，上述癌症为结肠癌或肺癌。
技术效果
本发明化合物类药性良好，具有良好的RAF酶抑制活性和多种细胞抗增殖活性，同时具有良好的体内药效以及良好的安全性。有望解决当前BRAFV600E突变癌症治疗的耐药性问题，以及为RAS突变类型癌症提供有效治疗。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。
除非另有说明，术语“顺反异构体”或者“几何异构体”系由因双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而引起。
除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。
除非另有说明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有说明，用楔形实线键和楔形虚线键/>表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键/>和直形虚线键/>表示立体中心的相对构型，用波浪线/>表示楔形实线键/>或楔形虚线键/>或用波浪线/>表示直形实线键/>和直形虚线键/>
除非另有说明，术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指在室温下，不同官能团异构体处于动态平衡，并能很快的相互转化。若互变异构体是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(proton tautomer)(也称质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键异构体(valence tautomer)包括一些成键电子的重组来进行的相互转化。其中酮-烯醇互变异构化的具体实例是戊烷-2,4-二酮与4-羟基戊-3-烯-2-酮两个互变异构体之间的互变。
除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。
除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构体或对映体过量(ee值)为80％。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
术语“保护基”包括但不限于“氨基保护基”、“羟基保护基”或“巯基保护基”。术语“氨基保护基”是指适合用于阻止氨基氮位上副反应的保护基团。代表性的氨基保护基包括但不限于：甲酰基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基、三氯乙酰基或三氟乙酰基)；烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基(Cbz)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基，如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、1,1-二-(4'-甲氧基苯基)甲基；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。术语“羟基保护基”是指适合用于阻止羟基副反应的保护基。代表性羟基保护基包括但不限于：烷基，如甲基、乙基和叔丁基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基)；芳基甲基，如苄基(Bn)，对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基，DPM)；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶X射线衍射法(SXRD)，把培养出的单晶用Bruker D8 venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为CuKα辐射，扫描方式：扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。也可以通过原料的手性结构以及不对称合成的反应机理来确证化合物的绝对构型。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。
本发明采用下述缩略词：HATU代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt代表1-羟基苯并***；T3P代表三正丙基环磷酸酐；Pd2dba3代表三-二苯丙酮-二钯；Ruphos代表2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯；Brettphos代表(2-二环己基膦-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯；TBAF代表四丁基氟化铵；[Ir(COD)OMe]2代表环辛二烯甲氧基铱二聚物；tmphen代表3,4,7,8-四甲基-1,10菲萝啉；dtbpy代表4,4’-二叔丁基-2,2’-联吡啶。Pd(dppf)Cl2代表二苯基膦二茂铁二氯化钯；Pd(dppf)Cl2·DCM代表二苯基膦二茂铁二氯化钯与二氯甲烷复合物；DIAD代表偶氮二羧酸二异丙酯；DIPEA或DIEA代表二异丙基乙基胺；PPh3代表三苯基膦；TFA代表三氟乙酸；THP代表2-四氢吡喃；OTHP代表2-氧代四氢吡喃；TBSCl代表叔丁基二甲基氯硅烷；TBS代表叔丁基二甲基硅；OTBS代表叔丁基二甲基硅氧；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EA代表乙酸乙酯；PE代表石油醚；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；DME代表乙二醇二甲醚；DCM代表二氯甲烷；THF代表四氢呋喃；MeCN代表乙腈；NMP代表N-甲基吡咯烷酮；PE/EA代表石油醚与乙酸乙酯体积比；DCM/MeOH代表二氯甲烷与甲醇体积比；HCOOH-MeCN-H2O代表分离体系为甲酸-乙腈-水；IPA代表异丙醇；Me代表甲基、OMs代表甲烷磺酰基氧基。
附图说明
图1式(I)化合物单晶的晶胞图。
图2为人结肠癌Colo-205细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠肿瘤生长曲线。
图3为人结肠癌Colo-205细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠体重变化曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1：式(I)化合物的制备
合成路线1：
化合物2
-78℃下，向化合物1(10克，51.96毫摩尔)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入正丁基锂(23mL，2.5M)，搅拌30分钟。-78℃下，向该混合液中加入1a(4.92克，57.16毫摩尔)，升温至25℃搅拌0.5小时。向反应混合物中加入饱和氯化铵溶液(40mL)，用二氯甲烷(40mL×2)萃取，合并后的萃取液用无水硫酸钠干燥后浓缩，经柱层析(PE/EA＝10/1至5/1，V/V)分离得化合物2。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(t,J＝7.8Hz,1H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.28(d,J＝7.2Hz,1H),4.35(s,1H),4.24-4.14(m,2H),4.05-4.00(m,1H),3.96-3.92(m,1H),2.45(td,J＝8.8,13.0Hz,1H),2.32-2.22(m,1H)。
化合物3
向化合物2(6克，30.06毫摩尔)的甲苯(80mL)溶液中加入对甲苯磺酸(11.5克，60.46毫摩尔)，升温至110℃搅拌16小时。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠溶液(40mL)和乙酸乙酯(100mL)，分液，有相机用饱和碳酸氢钠溶液(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，经硅胶柱层析(PE/EA＝50/1至20/1，V/V)分离得化合物3。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.23(dd,J＝5.2,7.8Hz,2H),6.68(quin,J＝2.0Hz,1H),5.08(dt,J＝2.0,5.0Hz,2H),4.91(dt,J＝2.0,5.0Hz,2H)。
化合物4
向叔丁醇钾(3.71克，33.04毫摩尔)，化合物2a(7.3克，33.17毫摩尔)的混合物中加入DMSO(50mL)。在氮气保护下，将反应混合物在25℃并搅拌1小时。向反应液中加入3(1克，5.51毫摩尔)的DMSO(5mL)溶液，将反应混合物加热至70℃并搅拌6小时。向反应混合物中加入水(180mL)，用乙酸乙酯(30×3mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，经硅胶柱层析(PE/EA＝20/1，V/V)分离，得化合物4。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(t,J＝7.8Hz,1H),7.05(d,J＝7.8Hz,1H),6.88(d,J＝7.6Hz,1H),4.11-4.04(m,2H),3.89-3.78(m,2H),2.08(ddd,J＝2.8,5.2,8.0Hz,1H),1.32(dd,J＝4.4,8.0Hz,1H),1.07(t,J＝4.6Hz,1H)。
化合物5
将化合物3a(1.08克，4.25毫摩尔)，[Ir(COD)OMe]2(70毫克，105.60微摩尔)和tmphen(50毫克，211.59微摩尔)置于甲基叔丁醚(20mL)中。反应混合物在氮气保护下，加入4(770毫克，3.94毫摩尔)，加热至80℃搅拌3小时。反应液过滤，滤液浓缩，得化合物5粗品。MS(ESI):m/z 240.3[M-84+2H]+。
化合物6
将化合物5(1.2克，3.73毫摩尔)，4a(1.4克，3.90毫摩尔)和Pd(dppf)Cl2·DCM(300毫克，367.36微摩尔)和碳酸钠(800毫克，7.55毫摩尔)置于二氧六环(50mL)和水(10mL)中。反应混合物在氮气保护下，加热至100℃并搅拌3小时。将反应混合物过滤，滤液浓缩后加入乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并后的有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，经硅胶柱层析(PE/EA＝10/1至5/1)分离得化合物6。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(d,J＝5.0Hz,1H),8.20(s,1H),8.11(s,1H),7.94(d,J＝5.0Hz,1H),7.60-7.51(m,2H),7.32(d,J＝7.8Hz,1H),7.10(d,J＝1.2Hz,1H),6.90(d,J＝1.2Hz,1H),4.19-4.14(m,2H),3.95-3.87(m,2H),2.27(s,3H),2.24-2.17(m,1H),1.48-1.41(m,1H),1.20-1.15(m,1H)。
化合物7
向化合物6(900毫克，1.90毫摩尔)和化合物5a(400毫克，2.27毫摩尔)的甲苯(30mL)溶液中，加入Pd2dba3(180毫克，196.57微摩尔)，Brettphos(200毫克，372.60微摩尔)和碳酸铯(1.26克，3.87毫摩尔)。在氮气保护下，将反应混合物加热至110℃并搅拌4小时。将反应液过滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(PE/EA＝20/1至6/1)分离，得化合物7。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.95(d,J＝5.0Hz,1H),8.31(s,1H),8.14(d,J＝4.6Hz,1H),7.70(dd,J＝2.0,8.2Hz,1H),7.59(d,J＝2.2Hz,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,1H),6.68(s,1H),6.49(s,1H),4.31(br d,J＝2.8Hz,1H),4.07-3.97(m,2H),3.90-3.86(m,2H),3.79-3.69(m,2H),2.17(s,3H),2.15-2.09(m,1H),1.33(dd,J＝3.8,7.8Hz,1H),1.13(t,J＝7.2Hz,1H),0.96-0.91(m,1H),0.80(s,9H),0.00(s,6H)。
化合物8
向化合物7(300毫克，488.81微摩尔)的四氢呋喃(10mL)中加入盐酸(1mL，4M)，反应液在25℃下搅拌1小时。将反应液用乙酸乙酯(20mL)稀释后，用碳酸氢钠饱和溶液调pH＝8，用乙酸乙酯(10×3mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，薄层硅胶板(PE/EA＝1/1，V/V)分离，得化合物8。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,1H),9.06-8.95(d,J＝5.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.23-8.18(d,J＝4.2Hz,1H),7.77-7.71(dd,J＝2.2,8.4Hz,1H),7.68-7.64(d,J＝2.2Hz,1H),7.39-7.31(d,J＝8.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.59-6.54(d,J＝1.0Hz,1H),4.86-4.81(t,J＝5.2Hz,1H),4.35-4.30(t,J＝5.2Hz,2H),4.13-4.03(m,2H),3.83-3.70(m,4H),2.24(s,3H),2.22-2.08(ddd,J＝2.4,5.0,7.8Hz,1H),1.40-1.32(dd,J＝3.6,7.8Hz,1H),1.02-0.96(t,J＝4.4Hz,1H)。MS(ESI)m/z:500.4[M+H]+。
式(I)化合物
化合物8经SFC手性分离(手性柱DAICEL CHIRALCEL OJ-H(250mm*30mm,5μm)，流动相A：乙醇(含0.05％二异丙基乙胺)；流动相B：二氧化碳)得到8A(保留时间1.487min)和式(I)化合物(保留时间1.590min)。8A是式(I)化合物的对映异构体。
化合物8A：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,1H),9.06-8.95(d,J＝5.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.23-8.18(d,J＝4.2Hz,1H),7.77-7.71(dd,J＝2.2,8.4Hz,1H),7.68-7.64(d,J＝2.2Hz,1H),7.39-7.31(d,J＝8.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.59-6.54(d,J＝1.0Hz,1H),4.86-4.81(t,J＝5.2Hz,1H),4.35-4.30(t,J＝5.2Hz,2H),4.13-4.03(m,2H),3.83-3.70(m,4H),2.24(s,3H),2.22-2.08(ddd,J＝2.4,5.0,7.8Hz,1H),1.40-1.32(dd,J＝3.6,7.8Hz,1H),1.02-0.96(t,J＝4.4Hz,1H)。MS(ESI)m/z:500.4[M+H]+，100％(ee％)。
式(I)化合物：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,1H),9.06-8.95(d,J＝5.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.23-8.18(d,J＝4.2Hz,1H),7.77-7.71(dd,J＝2.2,8.4Hz,1H),7.68-7.64(d,J＝2.2Hz,1H),7.39-7.31(d,J＝8.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.59-6.54(d,J＝1.0Hz,1H),4.86-4.81(t,J＝5.2Hz,1H),4.35-4.30(t,J＝5.2Hz,2H),4.13-4.03(m,2H),3.83-3.70(m,4H),2.24(s,3H),2.22-2.08(ddd,J＝2.4,5.0,7.8Hz,1H),1.40-1.32(dd,J＝3.6,7.8Hz,1H),1.02-0.96(t,J＝4.4Hz,1H)。MS(ESI)m/z:500.4[M+H]+，99.7％(ee％)。
合成路线2：
步骤1：化合物I-2
室温下，将N,N-二甲基甲酰胺(12.5升)加入到50升反应釜中，加入化合物I-1(2.75千克，20.91摩尔)和化合物I-1-1(3.55千克，31.36摩尔)，搅拌至溶解澄清。再加入碳酸钾(7.22千克，52.27摩尔)，加热至75～80度下搅拌16小时。反应完成后，将反应液冷却至25度；向反应釜中加入水(27升)，将约27升的反应液转入30升白桶中暂存；向釜中剩余的27升反应液中缓慢加入盐酸溶液(6摩尔/升,8.5升)，每次0.3升，调节pH至3～4。有黄色固体析出，伴有大量气体产生，少量放热。减压抽滤固液混合物，滤饼用水洗涤三次，每次2升。剩余27升反应液，同样方法处理。滤饼合并后，在45度真空干燥24小时，得到化合物I-2。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ14.32(br s,1H),7.42(dd,J＝7.4,9.0Hz,1H),7.12(d,J＝9.0Hz,1H),6.53(dd,J＝1.4,7.4Hz,1H),4.26-4.18(m,2H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤2：化合物I-3
室温下，将二甲亚砜(12升)加入50升反应釜中，加入化合物I-2(3.6千克，16.03摩尔)，内温升至70度。反应液澄清后，加入氯化钠(1.87千克，32.05摩尔)的水(6升)溶液，将内温升至80-85度，搅拌16小时。反应完成后，温度降至25度，向釜中加入水(20.5升)，搅拌5分钟，反应液用乙酸乙酯萃取2次，每次10升。合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次，每次10升。有机相用无水硫酸钠干燥后，45度下减压浓缩得到产物化合物I-3。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(t,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.6Hz,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),3.94(s,2H)。
步骤3：化合物I-4
室温下，将四氢呋喃(7.5升)加入50升反应釜中，加入化合物I-3(1.5千克，9.83摩尔)和化合物I-3-1(0.926千克，10摩尔)，内温降至-25度。氮气氛围下，向釜中泵入六甲基硅胺基锂(10升，10摩尔，四氢呋喃溶液)，控制内温不超过-15度，约3小时加完。将内温升在-8～-5度之间，保温反应3小时。将温度降至-25度，用蠕动泵将六甲基硅胺基钠(10升，10摩尔，四氢呋喃溶液)加到反应釜(2小时加完)中，控制内温不超过-15度。将内温升至20～25度，搅拌反应16小时。反应完成后，向反应液中缓慢加入水(0.883升，49.1摩尔)，控制内温低于30度搅拌0.5小时。反应液在釜中，40度减压蒸馏，浓缩得到化合物I-4粗产物溶液(约10升)，直接用于下一步反应。
步骤4：化合物I-5
室温下，向粗品化合物I-4(10升溶液)的50升反应釜中加入氢氧化钾(9.6升，19.2摩尔)的水溶液和乙醇(10升)，内温升至75～80度，搅拌5小时。反应完成后降温至25～30度，向反应液中缓慢加入盐酸水溶液(8升，48摩尔)，控制温度不超过40度，加热内温至60度，搅拌1小时。反应完成后，浓缩得到粗产物溶液(剩余液约2升)，用乙酸乙酯萃取两次，每次7.5升。将萃取液加入反应釜中，加入硅胶(100-200目，750克)，加入正庚烷(15升)，搅拌16小时。过滤，滤饼用正庚烷/乙酸乙酯(1:1)洗涤三次，每次1升，合并有机相，减压浓缩得到黑色固体粗品。将粗品用乙醇(3升)加热至内温70度，搅拌至溶清，降温至20度，有大量固体析出后，向混悬液中加入水(9升)，搅拌0.5小时。过滤，滤饼用水洗涤两次，每次1升；将滤饼加入到混合溶液(正庚烷/乙醇，4:1，4.5升)中，搅拌0.5小时，过滤，滤饼用正庚烷/乙醇(4:1)洗涤2次，每次0.3升，将滤饼45度真空干燥16小时，得到化合物I-5。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(dd,J＝0.8,7.8Hz,1H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.18(dd,J＝0.8,7.8Hz,1H),4.43(dd,J＝4.6,9.2Hz,1H),4.31(d,J＝9.2Hz,1H),3.04-2.89(m,1H),2.14(dd,J＝4.4,7.8Hz,1H),1.56-1.44(m,1H)。
步骤:5：化合物I-6
室温下，将四氢呋喃(16升)加入50升反应釜中，加入化合物I-5(3.2千克，15.27摩尔)，搅拌至溶解澄清。内温升至30度，在氮气氛围下，用蠕动泵将硼氢化锂(4.58升，9.16摩尔)的四氢呋喃溶液缓慢加入到釜中(1.5小时加完)，控制温度不超过35度，夹套温度控制在10度，投料完毕后，控制内温在25度～35度之间，保温反应2小时，搅拌过夜16小时。向反应液中缓慢加入饱和氯化铵(2.3升)溶液，控制内温低于20度，搅拌0.5小时。向反应液中加入正庚烷(8升)，搅拌0.5小时，减压抽滤固液混合物，滤饼用正庚烷/四氢呋喃(1:2)洗涤2次，每次1.5升，滤液减压浓缩至约8升，加入乙酸乙酯16升。有机相用水洗涤3次，每次3升，水相用乙酸乙酯萃取3次，每次2升。合并有机相，用无水硫酸钠(2千克)干燥后，减压浓缩。粗品用正庚烷/乙酸乙酯(10:1，6.4升)打浆，搅拌0.5小时，过滤，滤饼用正庚烷/乙酸乙酯(10:1，3.2升)洗涤1次，将滤饼真空干燥16小时，得化合物I-6。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(t,J＝7.8Hz,1H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.25(d,J＝7.8Hz,1H),4.84-4.62(m,2H),4.09(dd,J＝6.2,12.4Hz,1H),3.88-3.71(m,2H),3.50(ddd,J＝4.8,8.8,11.8Hz,1H),1.82-1.62(m,1H),1.29(dd,J＝4.0,8.8Hz,1H),0.92(dd,J＝4.0,6.2Hz,1H)。
步骤6：化合物I-7
室温下，将四氢呋喃(22.5升)加入50升反应釜中，加入化合物I-6(1.5千克，7.02摩尔)，搅拌至溶解澄清。加入偶氮二甲酰二哌啶(2.04千克，8.07摩尔)，搅拌至溶解澄清，在氮气氛围下，用蠕动泵将正丁基膦的四氢呋喃溶液(1.63千克，8.07摩尔)缓慢加入到釜中(1.5小时加完)，控制温度不超过40度。投料完毕后，控制内温在15～25度之间，反应2小时，室温搅拌过夜16小时。将反应液过滤，滤饼用甲基叔丁醚洗涤2次，每次3升，滤液浓缩得粗品。粗品用甲基叔丁醚(15升)溶解，用盐酸(4摩尔/升)洗涤3次，每次3升，水相用甲基叔丁醚萃取3次，每次3升，合并有机相用饱和食盐水洗涤3次，每次5升，用无水硫酸钠(2千克)干燥后，减压浓缩得粗品。粗品转移至釜中，加入正庚烷(7升)，升温至内温70度，搅拌0.5小时至溶清。降温至内温15度，搅拌16小时。过滤，滤饼用正庚烷(1.4升)洗涤1次，滤饼真空干燥16小时，得化合物I-7。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(t,J＝7.8Hz,1H),7.04(dd,J＝0.8,7.8Hz,1H),6.87(dd,J＝0.8,7.7Hz,1H),4.10-4.04(m,2H),3.86-3.78(m,2H),2.07(ddd,J＝2.8,5.2,8.0Hz,1H),1.32(dd,J＝4.4,8.2Hz,1H),1.07(t,J＝4.8Hz,1H)。
步骤7：化合物I-8
室温下，将二氧六环(12升)加入50升反应釜中，加入化合物I-7-1(2.11千克，17.89摩尔)和叔丁醇钾(2.51千克，22.36摩尔)。反应液加热至95度，将化合物I-7(1.75千克，8.94摩尔)的二氧六环(5.5升)溶液用恒压滴液漏斗加入此反应液中，并控制内温90-100度。30分钟加完，保温反应30分钟。反应完成后，降温至50度，垫硅藻土过滤，滤饼用正庚烷洗涤2次，每次2升，滤液合并后旋干。将得到的黄色油状物溶于正庚烷(20升)中，用水洗3次，每次15升，点板显示无化合物I-7-1剩余。有机相用无水硫酸钠(2.5千克)干燥后浓缩，得粗产品化合物I-8。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(t,J＝7.8Hz,1H),6.66-6.48(m,2H),4.45-4.29(m,2H),4.21-4.07(m,2H),3.95-3.81(m,2H),3.75-3.64(m,2H),2.13-2.02(m,1H),1.42-1.34(m,1H),1.25-1.17(m,9H),1.10-1.02(m,1H)。
步骤8：化合物4a
室温下，将二氯甲烷(13升)加入50升反应釜中，加入三氟甲基异烟酸(2.6千克，13.6摩尔)和N,N-二甲基甲酰胺(105毫升，1.36摩尔)，搅拌至澄清。用恒压滴液漏斗缓慢加入草酰氯(1.67升，19.05摩尔)，尾气用碱液吸收。20度下，氮气氛围下搅拌16小时。反应完成后，将反应液中溶剂旋蒸除去，得到的三氟甲基异烟酰氯用N,N-二甲基甲酰胺(12升)溶解，将此溶液用恒压滴液漏斗缓慢加入到3-溴-4-甲基苯胺(3.0千克，13.97摩尔)和二异丙基乙胺(4.11升，20.44摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(6升)溶液中，控制内温在15～25度之间。加料完成后，继续反应0.5小时。反应完成后，将反应液加入到水(54升)中，析出固体，控制温度在20～30度，加完后继续搅拌10分钟，悬浊液用抽滤漏斗减压过滤，滤饼用水洗涤(2升)一次，收集滤饼。将滤饼转移至装有正庚烷(15升)的反应釜中，内温在15～25度，搅拌16小时。反应液过滤，滤饼用正庚烷(1升)洗涤2次，将滤饼真空干燥16小时，得化合物4a。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(d,J＝4.8Hz,1H),8.11(s,1H),8.01(br s,1H),7.96-7.86(m,2H),7.49(br d,J＝8.2Hz,1H),7.26(d,J＝8.2Hz,1H),2.41(s,3H)。
步骤9：化合物I-9
室温下，将叔丁基甲醚(18升)加入50升反应釜中，加入化合物I-8(1.8千克，6.49摩尔)和嚬哪醇硼酸酯(1.73千克，6.81摩尔)，搅拌澄清，体系抽真空置换三次氮气。将tmphen(30.67克，0.13摩尔)和[Ir(COD)(OMe)]2(40.02克，65毫摩尔)分别依次加入反应釜中，体系氮气流保护升温至55-60度，保温搅拌2小时。反应完成后，自然冷却反应液，搅拌16小时。反应液减压浓缩，得粗产品化合物I-9。
步骤10：化合物I-10
室温下，将二氧六环(16升)加入50升反应釜中，加入化合物4a(2.2千克，6.12摩尔)，搅拌至澄清，将Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(263.22克，0.32摩尔)加入到反应釜中，通氮气置换3次。将碳酸钠(1.37千克，12.89摩尔)溶于水(5.2升)至澄清后加入到反应釜中，升温至70-75度。N2保护下将溶液化合物I-9(2.6千克，6.45摩尔)用蠕动泵加入反应釜中(100毫升/分钟)，控制内温70-75度，搅拌约2小时。反应完成后，反应液冷却至室温，将反应液垫硅藻土减压抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤2次，每次2.5升。滤液减压浓缩后，向其中加入乙酸乙酯(25升)和饱和食盐水(20升)，并垫硅藻土减压抽滤，滤液分液后，有机相用无水硫酸钠(2.5千克)干燥。将有机相中转移至反应釜中，向其中加入改性硅胶(3.6千克)，加热至60度搅拌16小时。反应液冷却到室温，过滤，滤液减压浓缩。得到黄色粘稠物中加入叔丁基甲醚(4.5升)，50度溶清后，趁热转移到50升反应釜中，并加入正庚烷(13.5升)，升温至60度。关闭加热，打浆液自然降温至20度，搅拌16小时。减压抽滤，滤饼用(叔丁基甲醚/正庚烷＝1/3，2.5升)洗涤,滤饼真空干燥16小时，得到粗产品。在50升反应釜中加入乙醇/正庚烷(1/10，12.5升)，将粗产品加入其中，升温至65度，保温搅拌1小时。关闭加热，打浆自然降温至20度，搅拌16小时。减压抽滤，滤饼用乙醇/正庚烷(1:10，2升)洗涤，滤饼真空干燥16小时，得化合物I-10。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(d,J＝4.8Hz,1H),8.24(br s,1H),8.15(s,1H),7.95(br d,J＝3.8Hz,1H),7.63(br d,J＝8.2Hz,1H),7.44(s,1H),7.32-7.27(m,1H),6.53(s,1H),6.47(s,1H),4.41(t,J＝5.2Hz,2H),4.20-4.07(m,2H),3.94-3.84(m,2H),3.74(t,J＝5.2Hz,2H),2.25(s,3H),2.12(ddd,J＝2.6,5.0,7.8Hz,1H),1.41(dd,J＝4.2,8.0Hz,1H),1.24(s,9H),1.08(t,J＝4.4Hz,1H)。
步骤11：化合物I-11
室温下，将甲酸(12升)加入50升反应釜中，加入化合物I-10(2.4千克，4.32摩尔)，内温升至60～70度，搅拌4～5小时。反应完成后，停止加热，反应液冷却至室温，将反应液减压浓缩(45度)。向粗品中加入乙酸乙酯(20升)和水(15升)，加入碳酸氢钠固体调节溶液pH至4～5，分液，有机相用饱和食盐水(10升)洗涤一次，用无水硫酸钠干燥后旋干。转移至烘箱中真空干燥16小时，得化合物I-11。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.87(d,J＝4.8Hz,1H),8.41(s,1H),8.17-8.06(m,2H),7.93(br d,J＝4.4Hz,1H),7.62-7.52(m,1H),7.46(s,1H),7.32-7.21(m,1H),6.56(s,1H),6.50(s,1H),4.64-4.45(m,4H),4.22-4.03(m,2H),3.94-3.83(m,2H),2.25(s,3H),2.12(ddd,J＝2.6,5.0,7.8Hz,1H),1.40(dd,J＝4.2,7.8Hz,1H),1.09(t,J＝4.4Hz,1H)。
步骤12：式(I)化合物
室温下，将乙二醇二甲醚(10.5升)加入50升的反应釜中。加入化合物I-11(2.1千克，3.98摩尔)，搅拌至溶液澄清。降温至5～10度，缓慢加入氢氧化钠(238.85克，5.97摩尔)的纯水(2.1升)溶液，搅拌0.5小时。反应完成后，向反应液中加入乙酸乙酯(20升)和纯水(10升)，分液，有机相用水(10升)洗涤一次，无水硫酸钠干燥。旋蒸有机相，得到的固体转移到烘箱，真空干燥16小时，得式(I)化合物(粗品)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(d,J＝4.8Hz,1H),8.18(s,1H),8.14(s,1H),7.96(br d,J＝4.8Hz,1H),7.60(br d,J＝8.2Hz,1H),7.52(s,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),6.63(s,1H),6.57(s,1H),4.54-4.46(m,2H),4.20-4.11(m,2H),4.02-3.96(m,2H),3.96-3.86(m,2H),2.29(s,3H),2.16(ddd,J＝2.6,5.0,7.8Hz,1H),1.41(dd,J＝4.2,7.9Hz,1H),1.14(t,J＝4.4Hz,1H)。
实施例2：式(I)化合物单晶的制备
实验方法：
将式(I)化合物30毫克，溶解于2mL丙酮中，将溶解好的溶液放入离心管(容量：10mL)中。向此溶液慢慢加入2mL石油醚，两种溶剂上下分层显著，用封口膜封闭管口，开少许蒸发小孔。室温静置10天，待溶剂挥发大部分有晶体析出，收集晶体进行单晶X射线衍射(SC-XRD)检测。
实验结果：
表1式(I)化合物的晶体结构数据和测定参数
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表2式(I)化合物晶体的原子坐标(×104)和等价各向同性移位参数/>
表3式(I)化合物化合物晶体的键长和键角[deg]/>
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表4式(I)化合物晶体的扭转角度[deg]
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结论：该单晶的晶胞图见图1，结果表明式(I)化合物的结构为N-(3-(2-((1R,5S)-3-氧杂双环[3.1.0]己-1-基)-6-(2-羟基乙氧基)吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)异烟酰胺。
生物测试：
实验例1：体外酶活性测试
实验目的：
检测化合物对RAF激酶活性的抑制效应。
实验步骤：
(1)化合物准备：
用DMSO将待测化合物及参考化合物稀释到1μM，并对化合物进行3倍梯度稀释，得到10个浓度梯度的目标板。ATP浓度为10μM。
(2)实验流程：
1)缓冲液配制：20mM HEPES(pH 7.5),10mM MgCl2,1mM EGTA,0.01％Brij35,0.02mg/ml,BSA,0.1mM Na3VO4,2mM DTT,1％DMSO；
2)用新制的缓冲液配置指定的底物溶液，加入相应的辅因子；
3)将相应的RAF激酶酶加入到上述底物溶液中，并混合均匀；
4)用Echo550将化合物的DMSO溶液加入到上述溶液中；
5)加入33P-ATP(特定活性0.01μCi/μl)引发反应，室温孵育2小时；
6)用P81离子交换纸(Whatman#3698-915)标记上述反应；
7)用0.75％的磷酸充分洗涤滤器；
8)检测滤纸上残留的放射性磷酸化底物。
实验结果：表5提供了本发明的化合物对RAF激酶的抑制活性。
表5化合物的体外酶活性
结论：本发明化合物对RAF酶具有显著的抑制活性。
实验例2：Calu-6(KrasQ61K)抗增殖活性实验
实验材料：
1)实验试剂耗材
名称 品牌货号
EMEM培养基 维森特-320-005-CL
胎牛血清 Biosera-FB-1058/500
0.25％胰蛋白酶 源培-S310KJ
双抗(青霉素、链霉素) Procell-PB180120
CellTiter Glo Promega-G7573
细胞板 Corning-3610
2)实验仪器
名称 品牌货号
细胞计数板 求精
Victor Nivo PerkinElmer
实验步骤：
细胞接种:
(1)细胞培养基：89％EMEM，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素；
(2)除去细胞培养瓶中原有培养基，用胰酶消化细胞后计数，用培养基将细胞悬液稀释到铺板所需的细胞密度3.75×104个细胞每毫升；
(3)在细胞板四周每孔中加入100μL培养基，向其它孔中加入80μL细胞悬液，放入含5％CO2的37度培养箱中培养过夜。
加药:
用Echo对化合物进行梯度稀释和加药，然后将细胞板放回到培养箱中培养三天；
读板、分析数据：
加CTG并读板：向细胞板的每个孔中加入20μL CellTiterGlo，避光震荡10min，在Victor Nivo上读板。
实验结果：表6提供了本发明化合物对Calu-6细胞的抗增殖活性。
表6化合物的体外活性
类型 式(Ⅰ)化合物
肺癌Calu-6细胞抗增殖活性IC50(nM) 600
结肠癌HCT-116细胞抗增殖活性IC50(nM) 1100
肺癌Calu-6细胞ERK磷酸化抑制活性IC50(nM) 490
结肠癌HCT-116细胞ERK磷酸化抑制活性IC50(nM) 180
实验例3：HCT-116(KrasG13D)抗增殖活性实验
实验材料：
1)实验试剂耗材
名称 品牌货号
Mc’Coy 5A培养基 BI-01-075-1ACS
胎牛血清 Biosera-FB-1058/500
0.25％胰蛋白酶 源培-S310KJ
双抗(青霉素、链霉素) Procell-PB180120
CellTiter Glo Promega-G7573
细胞板 Corning-3610
2)实验仪器
名称 品牌货号
细胞计数板 求精
Victor Nivo PerkinElmer
实验步骤：
细胞接种:
(1)细胞培养基：89％Mc’Coy 5A，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素；
(2)除去细胞培养瓶中原有培养基，用胰酶消化细胞后计数，用培养基将细胞悬液稀释到铺板所需的细胞密度2.5×104个细胞每毫升；
(3)在细胞板四周每孔中加入100μL培养基，向其它孔中加入80μL细胞悬液，放入含5％CO2的37度培养箱中培养过夜。
加药:
对化合物进行梯度稀释和加药，然后将细胞板放回到培养箱中培养三天；
读板、分析数据：
加CTG并读板：向细胞板的每个孔中加入20μL CellTiterGlo，避光震荡10min，在Victor Nivo上读板。
实验结果：表6提供了本发明化合物对HCT-116细胞的抗增殖活性。
实验例4：HCT116(KrasG13D)ERK磷酸化抑制试验
实验材料：
1.试剂耗材
试剂 品牌货号
人ERK磷酸化蛋白高灵敏检测试剂盒 Cisbio-64AERPEH
RPMI1640培养基 Gibco-22400089
胎牛血清 Hyclone-SV30087.03
96HTRF微孔板 Cisbio-66PL96025
96微孔板 COSTAR-3599
DMSO Sigma-D2650-100mL
0.05％Trypsin-EDTA Gibco-25300-062
2.主要仪器
仪器 生产厂家 型号
生物安全柜 AIRTECH BSC-1304IIA2
二氧化碳培养箱 Thermo 311
细胞计数仪 BECKMAN Vi-cellXR
酶标仪 PerkinElmer Envision
离心机 Eppendorf Centrifuge 5810R
3.细胞信息
细胞名称 来源 货号
HCT116 ATCC ATCC-HTB-132
实验步骤和方法：
1)复苏细胞并培养至对数生长期，用胰酶消化，种96孔板，放入培养箱中孵育过夜。
2)将DMSO溶解的系列梯度化合物加入96孔板中，放回至培养箱中孵育1小时。
3)取出细胞板，去上清，加入细胞裂解液(含1％的封闭肽)室温孵育裂解30分钟。
4)每孔转移16μL细胞裂解液至HTRF板中，随后加入配置好的抗体混合液4μL。
5)孵育过夜后用Envision读板，根据ratio(Ex665/Ex615荧光强度的比值)得到拟合的曲线并根据
Graphpad的四参数拟合公式Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))计算得出EC50。实验结果：表6提供了本发明化合物对HCT-116ERK磷酸化抑制活性。
实验例5：Calu-6(KrasQ61K)ERK磷酸化抑制试验
实验材料：
1)试剂耗材
试剂 品牌货号
人ERK磷酸化蛋白高灵敏检测试剂盒 Cisbio-64AERPEH
RPMI1640培养基 Gibco-22400089
胎牛血清 Hyclone-SV30087.03
96HTRF微孔板 Cisbio-66PL96025
96微孔板 COSTAR-3599
DMSO Sigma-D2650-100mL
0.05％Trypsin-EDTA Gibco-25300-062
2)主要仪器
仪器 生产厂家 型号
生物安全柜 AIRTECH BSC-1304IIA2
二氧化碳培养箱 Thermo 311
细胞计数仪 BECKMAN Vi-cellXR
酶标仪 PerkinElmer Envision
离心机 Eppendorf Centrifuge 5810R
3)细胞信息
细胞名称 来源 货号
Calu6 ATCC ATCC-HTB-56
实验步骤和方法：
1)复苏细胞并培养至对数生长期，用胰酶消化，种96孔板，放入培养箱中孵育过夜。
2)将DMSO溶解的系列梯度化合物加入96孔板中，放回至培养箱中孵育1小时。
3)取出细胞板，加入细胞裂解液(含1％的封闭肽)室温孵育裂解30分钟。
4)每孔转移16μL细胞裂解液至HTRF板中，随后加入配置好的抗体混合液4μL。
5)孵育过夜后用Envision读板，根据ratio(Ex665/Ex615荧光强度的比值)得到拟合的曲线并根据
Graphpad的四参数拟合公式Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))计算得出EC50。
实验结果：表6提供了本发明化合物对Calu-6 ERK磷酸化抑制活性。
结论：式(I)化合物对Calu-6细胞和HCT-116细胞均具有较好的抗增殖活性以及较好的ERK磷酸化抑制活性。
实验例6：A375(BRAFV599E)抗增殖活性实验
实验材料：
1)实验试剂耗材
名称 品牌货号
EMEM培养基 维森特-320-005-CL
胎牛血清 Biosera-FB-1058/500
0.25％胰蛋白酶 Basal Media-S310KJ
双抗(青霉素、链霉素) Basal Media-S110JV
CellTiter Glo Promega-G7573
细胞板 Corning-3610
2)实验仪器
名称 品牌货号
EnVision PerkinElmer
实验步骤：
细胞接种:
(1)细胞培养基：89％EMEM，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素；
(2)除去细胞培养瓶中原有培养基，用胰酶消化细胞后计数，用培养基将细胞悬液稀释到铺板所需的细胞密度2000个细胞每孔；
(3)每孔中加入80μL细胞悬液，放入含5％CO2的37度培养箱中培养过夜。
加药:
每孔加入20μL化合物工作液到细胞板中，37℃，5％CO2培养箱，继续孵育5天。
读板、分析数据：
加CTG并读板：向细胞板的每个孔中加入50μL CellTiterGlo，震荡10min，使用EnVision检测。
实验结果：表7提供了本发明化合物对A375细胞的抗增殖活性。
表7化合物的体外细胞活性
化合物 A375细胞IC50(nM) Colo-205细胞IC50(nM)
式(I)化合物 269.5 619.5
实验例7：Colo-205(BRAFV599E)抗增殖活性实验
实验材料：
1)实验试剂耗材
名称 品牌货号
RPMI-1640培养基 Biological Industries-06-1055-57-1ACS
胎牛血清 Biosera-FB-1058/500
0.25％胰蛋白酶 Basal Media-S310KJ
双抗(青霉素、链霉素) Basal Media-S110JV
CellTiter Glo Promega-G7573
细胞板 Corning-3610
2)实验仪器
名称 品牌货号
EnVision PerkinElmer
实验步骤：
细胞接种:
(1)细胞培养基：89％EMEM，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素；
(2)除去细胞培养瓶中原有培养基，用胰酶消化细胞后计数，用培养基将细胞悬液稀释到铺板所需的细胞密度3000个细胞每孔；
(3)每孔中加入80μL细胞悬液，放入含5％CO2的37度培养箱中培养过夜。
加药:
每孔加入20μL化合物工作液到细胞板中，37℃，5％CO2培养箱，继续孵育3天。
读板、分析数据：
加CTG并读板：向细胞板的每个孔中加入50μL CellTiterGlo，震荡10min，使用EnVision检测。
实验结果：表7提供了本发明化合物对Colo-205细胞的抗增殖活性。
结论：本发明化合物对A375细胞和Colo-205细胞的具有显著的抗增殖活性。
实验例8：小鼠单次静脉与口服给药的药代动力学研究
本实验旨在研究供试式(I)化合物单次静脉及单次口服给药后，化合物在小鼠体内的药代动力学(PK)情况。
样品收集与制备：
静脉注射或口服给药后，采集动物血液样本，记录实际采血时间。血样采集以后，立即转移至贴有标签的含K2-EDTA的离心管中，随后离心处理后取血浆。将血浆转移至预冷的离心管，在干冰中速冻，并储存在-70±10℃超低温冰箱中，直到进行LC-MS/MS分析。
药代动力学数据分析：
使用药动学软件，以非房室模型对化合物的血浆药物浓度数据进行处理。达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)以及可定量末时间，从血药浓度-时间曲线中直接获得。使用对数线性梯形法计算下列药代动力学参数：半衰期(T1/2)，表观分布容积(Vdss)以及清除率(Cl)，0点到末端时间点时间-血浆浓度曲线下面积(AUC0-last)，初始浓度(C0)。
实验结果：
表8小鼠单次静脉和口服给药本发明化合物的药代动力学参数
结论：式(I)化合物在小鼠中口服吸收较好，具有较低的清除率，半衰期较长，生物利用度较好。
实验例9：人源肺癌Calu-6细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学实验
实验材料：
1.1实验动物及饲养环境
1.1.1实验动物
种属：小鼠
品系：BALB/c裸小鼠
到货周龄：6-8周龄
性别：雌性
1.1.2饲养环境
动物在SPF级动物房以IVC(独立送风***，恒温恒湿)笼具饲养(每笼3-5只)
温度：20-26℃
湿度：40-70％
1.2化合物信息
1.3肿瘤组织或细胞信息
细胞：人肺癌Calu-6细胞体外培养，EMEM培养基中加0.2Units/mL bovineinsulin，10％胎牛血清，37℃5％CO2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
1.4其它试剂信息
名称 生产厂家 货号 保存条件
胎牛血清 Hyclone SV30087.03 -20℃
Trypsin gibco 25200-072 -20℃
EMEM培养基 ATCC ATCC30-2003 2-8℃
1.5仪器信息
名称 生产厂家 型号
二氧化碳培养箱 赛莫飞世尔(Thermo Fisher) Heracell240i
低温高速离心机 艾本德(Eppendorf) 5810R
分析天平 赛多利斯(Sartorius) SECURA225D-1CN
普通天平 常州天之平仪器设备有限公司 EL-2KJ
数显游标卡尺 三丰 0～150mm
实验方法与步骤：
2.1肿瘤细胞接种
细胞接种：将0.2mL Calu-6细胞(1:1与基质胶配比)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到173mm3时开始分组给药。
2.2实验动物分组及给药方案
注：1:每组小鼠数目；2:给药体积参数：根据小鼠体重10μL/g。如果体重下降超过15％，则停药，直到体重恢复到10％以内再给药；3：0.5％MC(甲基纤维素)。
2.3受试物的配制
注1：在给动物给药前需要轻轻将药物充分混匀，solutol为聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，PEG为聚乙二醇。
2.4肿瘤测量和实验指标
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV平均值；CRTV：阴性对照组RTV平均值)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即D0)测量所得肿瘤体积，Vt为某一次测量时的肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
2.5统计分析
统计分析基于试验结束时RTV的数据运用SPSS软件进行分析。组间比较用one-wayANOVA进行分析，方差不齐(F值有显著性差异)，应用Games-Howell法进行检验。p<0.05认为有显著性差异。
3.实验结果
3.1受试物对人肺癌裸鼠皮下移植肿瘤生长的抑制作用
本实验评价了受试物在人肺癌异种移植瘤模型中的药效，以溶剂对照组为参照。给药组式(I)化合物(100mg/kg)的T/C为11.4％，TGI为99.1％，有显著抑瘤作用(P＜0.01)。
3.2体重变化情况
小鼠体重、状态未见异常。
结论：本发明化合物对人肺癌Calu-6细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠生长有显著的抑制作用。
实验例10：人源结肠癌Colo-205细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠的体内药效学实验
实验材料
1.1实验动物及饲养环境
1.1.1实验动物
种属：小鼠
品系：BALB/c裸小鼠
到货周龄：6-8周龄
性别：雌性
1.1.2饲养环境
动物在SPF级动物房以IVC(独立送风***，恒温恒湿)笼具饲养(每笼3只)
温度：20-26℃
湿度：40-70％
1.2化合物信息
1.3肿瘤组织或细胞信息
细胞：人结肠癌Colo-205细胞(ATCC-CCL-222)体外贴壁培养，培养条件为RPMI1640培养基中加10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素/两性霉素B，37℃ 5％CO2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
1.4其它试剂信息
名称 生产厂家 货号 保存条件
胎牛血清 Cellmax SA211.02 -10℃
RPMI 1640培养基 gibco 22400-089 2℃-8℃
Anti-Anti Gibco 15240062 -20℃-5℃
胰酶 Gibco 25200072 -20℃-5℃
PBS Hyclone SH30256.01 15℃-30℃
1.5仪器信息
名称 生产厂家 型号
二氧化碳培养箱 赛莫飞世尔(Thermo Fisher) Heracell240i
低温高速离心机 艾本德(Eppendorf) 5810R
分析天平 赛多利斯(Sartorius) SECURA225D-1CN
普通天平 常州天之平仪器设备有限公司 EL-2KJ
数显游标卡尺 三丰 0～150mm
实验方法与步骤
2.1肿瘤细胞接种及分组
细胞接种：将0.1mL(5×106个)Colo-205细胞皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到约150mm3时开始分组给药。
实验动物分组及给药方案
注：N:每组小鼠数目；给药体积参数：根据小鼠体重10μL/g。如果体重下降超过15％，则停药，直到体重恢复到10％以内再给药。
2.3受试物的配制
注：在给动物给药前需要轻轻将药物充分混匀。
2.4肿瘤测量和实验指标
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV平均值；CRTV：阴性对照组RTV平均值)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即D0)测量所得肿瘤体积，Vt为某一次测量时的肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
2.5统计分析
统计分析基于试验结束时RTV的数据运用SPSS软件进行分析。组间比较用one-wayANOVA进行分析，方差不齐(F值有显著性差异)，应用Games-Howell法进行检验。p<0.05认为有显著性差异。
3.实验结果
3.1受试物对人结肠癌裸鼠皮下移植肿瘤生长的抑制作用
本实验评价了受试物在人肺癌异种移植瘤模型中的药效，以溶剂对照组为参照。给药组式(I)化合物(30mg/kg QD,100mg/kg QD)的T/C分别为68.46％和36.12％，TGI分别为31.98％和74.05％，有显著抑瘤作用，量效关系较好。人结肠癌Colo-205细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给予化合物后的肿瘤生长曲线见图2。
3.2体重变化情况
小鼠体重、状态未见异常。受试物对小鼠体重的影响见图3。
结论：本发明化合物对结肠癌Colo-205细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠生长有显著的抑制作用。
实验例11：SD大鼠经口灌胃重复给药4周恢复4周毒性试验伴随毒代动力学试验
实验材料：
1.1实验动物及饲养环境
1.1.1实验动物
种属：大鼠
品系：SD大鼠
动物年龄：约7～9周龄
性别：雌性和雄性
1.1.2饲养环境
温度：20-26℃
湿度：40-70％
使用笼具为不锈钢饲育架上的悬吊式PC透明大鼠饲育盒，雌雄分开饲养，每盒不多于5只。动物饲养室温度控制在20℃～26℃，相对湿度控制在40％～70％。控制光照/黑暗各12h循环(如遇夜间操作可临时豁免此要求)。
1.2化合物信息
名称 分子量 纯度(％) 含量(％) 保存条件
式(I)化合物分散体 499.49 97.6 93.1 2℃～8℃、密封
1.3其它试剂信息
1.4仪器信息
名称 生产厂家 型号
血液分析仪 西门子医学诊断产品(上海)有限公司 ADVIA 2120i
全自动整合式生化分析仪 西门子医学诊断产品(上海)有限公司 Dimension EXL 200
电解质分析仪 麦迪卡医疗设备(苏州)有限公司 EasyLyte PLUS
全自动血凝分析仪 希森美康医用电子(上海)有限公司 CA-1500
尿液分析仪 桂林优利特医疗电子有限公司 URIT-500B
实验方法与步骤
2.1制剂配制及保存
2.1.1溶媒制剂配制方法
1)量取1000mL纯水至洁净干燥的烧杯中；
2)准确(不超过理论量的±1％)称取0.5g甲基纤维素加入1中，并置于磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，即得所需制剂；
3)2℃～8℃、密闭保存3个月。
2.1.2空白辅料制剂配制方法
1)量取目标体积的溶媒制剂备用；
2)准确称取(不得超过理论量*的±1％)所需空白辅料至洁净干燥的研钵中，加入少量溶媒制剂研磨至眼观无明显颗粒，将其转移至合适容器中，用剩余备用溶媒制剂润洗研钵，连同润洗液转移至上述容器中；
3)置于磁力搅拌器搅拌至少1h至目视均匀，即得。
*理论量＝高浓度供试品制剂理论浓度×体积/供试品含量×供试品中辅料含量＝高浓度供试品制剂理论浓度×体积/46.5％×50％。
2.1.3供试品制剂配制方法
1)量取配制目标的体积溶媒制剂备用；
2)准确称取(不得超过理论量*的±1.0％)所需量的供试品至洁净干燥的研钵中，加入少量溶媒制剂研磨至眼观无明显颗粒，将其转移至合适容器中，用剩余备用溶媒制剂润洗研钵，连同润洗液一同转移至上述容器中；
3)用分散机分散至目视均匀；
4)置于磁力搅拌器搅拌至少1h至目视均匀，即得所需制剂。
注：*理论量＝理论浓度×体积/含量＝理论浓度×体积/46.5％。
2.2动物分组及给药
2.2.1动物分组
按照随机和体重均衡性原则，根据动物最近体重，使用Provantis***对大鼠分性别进行分层随机分组，共分8组。
2.2.2动物给药
给药途径：经口灌胃；
给药期限及频率：每日给药1次，连续给药28天，停药恢复28天；
给药前和给药中的要求：供试品制剂和辅料制剂在给药前至少搅拌30min，并持续搅拌至给药结束。
实验动物分组及给药方案
注：1.动物编号末两位为11～15的动物进入恢复期。
2.动物编号为4位，千位表示性别，“1”为雄性，“2”为雌性；末二位表示组内序号。
3.如动物因外伤或其他原因需要分开饲养时，记录在原始记录中，仅作为原始记录保存。
4.剂量以式(I)化合物分散体API计。
2.3实验检测
2.3.1临床病理采样及检测
血液：所有动物采血前隔夜禁食，不限饮水。用一次性真空负压管经由腹主动脉采血。血液学采用EDTA-K2抗凝管，采血量约1.0mL；血清生化/电解质采用分离胶/促凝剂管，采血量约3.0mL；凝血常规采用柠檬酸钠抗凝管，采血量约1.0mL。
尿液：将大鼠(单只)放置于洁净的代谢笼中，待收集管中储有一定量的尿液后用注射器吸取不少于0.5mL尿液，并将尿液转移至干净的集尿管中，记录其收集时间和体积等信息。
经处理后利用仪器分析血液及尿液各参数。
2.3.2毒代动力学采样和评价
采集给药第1天和第28天各时间点的动物血液样本，约0.2mL/时间点，1.5mL离心管含15μL浓度为30mg/mL EDTA-K2抗凝剂(EDTA-K2配制方法：以配制10mL 30mg/mL EDTA-K2为例，准确称取300mg EDTA-K2放入干净的容器内，加入10mL超纯水，摇匀，2℃～8℃、密闭保存备用)。
采用LC-MS/MS方法测定血浆中式(I)化合物的浓度，采用Analyst 1.6.3及WatsonLIMS 7.4软件分析测定式(I)化合物在血浆中的浓度后，绘制浓度和时间曲线，并用WinNonlin8.1至少计算下列参数：浓度-时间曲线下面积(AUC0-t或AUC0-∞)、最大峰浓度(Cmax)，达峰时间(Tmax)。报告主要参数(包括不同时间血药浓度，Cmax、Tmax和AUC)的个体值、平均值和标准偏差值，按不同性别计算各个参数。
2.4数据处理及分析
Provantis 10.2.3直接采集的数据，以及回录入Provantis 10.2.3的数据，使用Provantis 10.2.3内置的SAS统计软件进行数据处理和统计分析。使用Analyst 1.6.3软件导出LC-MS/MS测得的毒代原始数据，使用Microsoft Excel进一步统计分析。应用软件Agilent OpenLAB CDS2.4进行数据的采集及处理。
实验结果：
各实验组雌、雄性SD大鼠临床病理学和毒代动力学检测未观察到明显异常，血清生化总胆红素未见异常。
实验结论：
本发明式(I)化合物对SD大鼠经口灌胃给药后，安全药良好，雄性MTD≥300毫克每公斤，雌性MTD≥100毫克每公斤。
实验例12：Beagle犬经口灌胃重复给药4周恢复4周毒性试验伴随毒代动力学试验
实验材料：
1.1实验动物及饲养环境
1.1.1实验动物
种属：犬
品系：Beagle犬
动物年龄：7～8月龄
性别：雌性和雄性
1.1.2饲养环境
温度：19-26℃
湿度：40-70％
动物使用不锈钢饲养笼单笼饲养。饲养室温度控制在19℃～26℃，相对湿度控制在40％～70％。控制光照/黑暗12h循环(如遇夜间操作可临时豁免此要求)。
1.2化合物信息
名称 分子量 纯度(％) 含量(％) 保存条件
式(I)化合物分散体 499.49 97.6 93.1 2℃～8℃、密封
1.3其它试剂信息
名称 生产厂家 保存条件
Kollidon VA 64 BASF SE 10℃～30℃、密封
甲基纤维素 阿法埃莎(中国)化学有限公司 室温
1.4仪器信息
实验方法与步骤
2.1制剂配制及保存
2.1.1溶媒制剂配制方法
1)量取1000mL纯水至洁净干燥的烧杯中；
2)准确(不超过理论量的±1％)称取0.5g甲基纤维素加入1中，并置于磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，即得所需制剂；
3)2℃～8℃、密闭保存3个月。
2.1.2空白辅料制剂配制方法
1)量取目标体积的溶媒制剂备用；
2)准确称取(不得超过理论量*的±1％)所需空白辅料至洁净干燥的研钵中，加入少量溶媒制剂研磨至眼观无明显颗粒，将其转移至合适容器中，用剩余备用溶媒制剂润洗研钵，连同润洗液转移至上述容器中；
3)置于磁力搅拌器搅拌至少1h至目视均匀，即得。
*理论量＝高浓度供试品制剂理论浓度×体积/供试品含量×供试品中辅料含量＝高浓度供试品制剂理论浓度×体积/46.5％×50％。
2.1.3供试品制剂配制方法
1)量取配制目标的体积溶媒制剂备用；
2)准确称取(不得超过理论量*的±1.0％)所需量的供试品至洁净干燥的研钵中，加入少量溶媒制剂研磨至眼观无明显颗粒，将其转移至合适容器中，用剩余备用溶媒制剂润洗研钵，连同润洗液一同转移至上述容器中；
3)用分散机分散至目视均匀；
4)置于磁力搅拌器搅拌至少1h至目视均匀，即得所需制剂。
注：*理论量＝理论浓度×体积/含量＝理论浓度×体积/46.5％。
2.2动物分组及给药
2.2.1动物分组
按照随机和体重均衡性原则，根据动物最近体重，使用Provantis***对犬分性别进行分层随机分组，共分4组。
2.2.2动物给药
给药途径：经口灌胃；
给药期限及频率：每日给药1次，连续给药4周，自D29停药恢复4周；
给药前和给药中的要求：动物给食后约1h给药。给药前制剂在室温环境下搅拌至少1h，给药过程中持续搅拌直至给药结束。
分组和给药剂量
注：1.动物编号末位为4、5的动物进入恢复期。
2.动物编号为4位，千位表示性别，“1”为雄性，“2”为雌性；末二位表示组内序号。
3.剂量以式(I)化合物分散体API计。
2.3实验检测
2.3.1临床病理采样及检测
血液：所有动物喂食前采血(濒死动物例外)，不限饮水。用一次性真空负压管经由前肢或后肢静脉采血。血液学采用EDTA-K2抗凝管，采血量约为1.0mL；血清生化/电解质采用分离胶/促凝剂管，采血量约为3.0mL；凝血常规采用柠檬酸钠抗凝管，采血量约为1.0mL。
尿液：用清洁的不锈钢收尿盘收集新鲜尿液后，用一次性无菌注射器抽取约1.0mL尿液，并将尿液转移至干净的集尿管中(按照机构内部对应的标签模板进行标识)，记录其收集时间和体积等信息。
经处理后利用仪器分析血液及尿液各参数。
2.3.2毒代动力学采样和评价
采集给药第1天和第28天各时间点的动物血液样本，约1mL，含EDTA-K2抗凝剂采血管。
采用Analyst 1.6.3及Watson LIMS 7.4软件分析测定式(I)化合物在血浆中的浓度后，绘制浓度和时间曲线，并用WinNonlin 8.1至少计算下列参数：浓度-时间曲线下面积(AUC0-t或AUC0-∞)、最大峰浓度(Cmax)，达峰时间(Tmax)。报告主要参数(包括不同时间血药浓度，Cmax、Tmax和AUC)的个体值、平均值和标准偏差值。按不同性别计算各个参数。
2.4数据处理及分析
Provantis 10.2.3直接采集的数据，以及回录入Provantis 10.2.3的数据，使用Provantis 10.2.3内置的SAS统计软件进行数据处理和统计分析。使用Analyst 1.6.3软件导出LC-MS/MS测得的毒代原始数据，使用Microsoft Excel进一步统计分析。应用软件Agilent OpenLAB CDS2.4进行数据的采集及处理。
实验结果
各实验组雌、雄性Beagle犬临床病理学和毒代动力学检测未观察到明显异常，血清生化总胆红素未见异常。实验结论：
本发明式(I)化合物对Beagle犬经口灌胃给药后，安全药良好，MTD≥100毫克每公斤。

Claims (3)

1.式(I)化合物N-(3-(2-((1R,5S)-3-氧杂双环[3.1.0]己-1-基)-6-(2-羟基乙氧基)吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)异烟酰胺或其药学上可接受的盐，
2.一种药物组合物，其包含式(I)化合物N-(3-(2-((1R,5S)-3-氧杂双环[3.1.0]己-1-基)-6-(2-羟基乙氧基)吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)异烟酰胺或其药学上可接受的盐及可药用的载体。
3.权利要求1所述的式(I)化合物及其盐或权利要求2所述的药物组合物在制备RAF激酶抑制剂中的应用。
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