CN113875986A - 抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法 - Google Patents

抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明有关于一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法，其系利用短链极性分子层的多个分子嵌设于菌体核的益生菌的细胞壁表面，再依序利用醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层包覆二者。所得的抗氧化多层包埋益生菌颗粒可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。

Description

抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法
技术领域
本发明是有关于一种包埋益生菌颗粒及其制造方法，特别是有关于一种提升益生菌抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法。
背景技术
益生菌(Probiotics)为对宿主要益处的菌株，通常指活性乳酸菌株、比菲德氏菌或酵母。在生理上，可藉由体内摄取的碳水化合物转换为短链脂肪酸，如醋酸、丙酸、丁酸及乳酸。在全球市场上，益生菌每年以10～25％的速度快速成长，因此带动了一连串相关产业与技术的精进，常见的产品有粉剂、胶囊锭剂及液态发酵奶或固态发酵乳，为现今食品产业中，十分重要的一个区块，更是代表了洁净、健康与希望的产品。
以乳酸菌为例，例如发明专利公告第TW 587098号，揭示一种增进免疫能力的乳酸菌，包含刺激免疫性浓度的下列任一或多种生物性纯培养物：鼠李糖乳杆菌HN001(CCRC910107)；鼠李糖乳杆菌HN067(CCRC 910108)；乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)HN019(CCRC 910110)或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HN017(CCRC 910109)，及生理上可接受的赋形剂或稀释剂，其中该赋形剂或该稀释剂为食品，而该食品为酦酵乳、优格、乳酪、乳制饮品或乳粉。另外，如发明专利公告第TW I451871号，揭示一种食品组合物，用以抑制发炎反应，包含：多株乳酸菌菌株，其包含唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)AP-32菌株，寄存编号BCRC 910437、路乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，寄存编号BCRC 910441、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，寄存编号BCRC 910469及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，寄存编号BCRC 910468，其中该些乳酸菌菌株具有胃酸、胆盐及抑霉剂克霉唑(Clotrimazole)耐受性；以及生理上可接受的一赋形剂或一稀释剂，其中该赋形剂或该稀释剂为酦酵乳、优格、乳酪、乳制饮品乳粉、茶或咖啡。
在目前的技术中，益生菌可概分为未经包埋处理的液剂或粉剂，一般常见需要维持低温保存或短效期的产品，以降低环境中氧气或温度的伤害，提升保存期限。然而，储藏环境一旦出现差异或失温，容易导致益生菌大量死亡，而失去原有的机能特性。
因此，在市场需求下，研发人员开发出各种提升乳酸菌存活率的技术。以改善益生菌酸碱耐受性不佳为例，如发明专利公告第TW M384660号，其揭示一种可抑制体内多余脂肪生长的LS66胶囊组合结构，包含一本体、一个以上的LS66孢子乳酸菌以及一涂布层，该本体包含一上胶囊与下胶囊，而上胶囊与下胶囊结合后内部形成一容置空间，该LS66孢子乳酸菌系填设于上述容置空间内，该涂布层涂布于本体内部表面，其中该涂布层系为一活化剂。乳酸菌利用硬胶囊包埋后，虽可保护菌体通过酸性的胃部环境，但硬胶囊于肠道不易溶解，使得释出菌体的时机不稳定，且同样有不耐久存的问题。
除了以硬胶囊包埋改善益生菌酸碱耐受性不佳其次，以上，科学化开发益生菌机能性特点的应用专利及改善益生菌在液剂或粉剂中储藏或加工安定性特点之外，更有大颗粒晶球包覆性益生菌材料的案例。
益生菌可利用单一极性层(如脱脂奶粉、糖质类的亲水极性材料，或如油脂类的疏水非极性材料)进行固定化或包埋。其次，益生菌亦可利用多层式醣质壁材(或称包覆材)包覆，可提供多层次缓释剂型，例如由外至内依序利用胃酸中酸分解壁材、胆盐碱性解离壁材及肠道中分解壁材进行包覆。由此所得的多层次缓释剂型虽可有效提升益生菌的酸碱耐受性，但常因酸碱解离不完全而进入下一阶段时，无法持续解离，导致在体内无法完全解离释放包覆在其中益生菌的困扰且包埋价格昂贵与包埋后菌体存活率低的缺点，而需大量摄取，容易造成糖分或脂质摄取过量的严重缺点。
发明内容
因此，本发明的一实施方式是在提供一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒(multilayer antioxidant coating lactic acid bacteria microencapsule，MAOC-LAB)，其利用短链极性分子层的多个分子嵌设于菌体核的益生菌的细胞壁表面，再依序利用醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层包覆二者，以形成多层同心立体结构。
本发明的另一实施方式系在提供一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，由此制得的抗氧化多层包埋益生菌颗粒可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
根据本发明的上述实施方式，提出一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒。在一实施例中，上述抗氧化多层包埋益生菌颗粒可包含菌体核，嵌设于菌体核细胞壁表面的短链极性分子层，设于菌体核及短链极性分子层上的醣类分子层，以及设于醣类分子层上的双极性抗氧化乳化蛋白层。在上述实施例中，菌体核系由至少一益生菌所组成，而短链极性分子层的多个分子可嵌设于至少一益生菌的细胞壁表面。在上述实施例中，双极性抗氧化乳化蛋白层可由蛋白质与油溶性抗氧化剂所组成。
依据本发明一实施例，上述至少一益生菌可包括但不限于乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合。在此实施例中，上述至少一益生菌可包括但不限于干燥菌体、含菌酦酵液或含菌浓缩酦酵液及上述的任意组合。在其他例子中，上述至少一益生菌的菌体密度可例如为每毫升1×1010菌落形成单位(colony forming unit，cfu)至1×1011cfu/mL。
依据本发明一实施例，上述短链极性分子层可包括但不限于氨基酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸酯类、醇类化合物、胡萝卜素或茄红素及上述的任意组合。
依据本发明一实施例，上述短链极性分子层可包括但不限于氨基酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸酯类、醇类化合物、胡萝卜素或茄红素及上述的任意组合。
依据本发明一实施例，上述醣类分子层可包括但不限于单醣、双醣、寡醣及多醣及上述任意组合，且醣类分子层可例如为结晶态。
依据本发明一实施例，上述蛋白质可包括但不限于脱脂奶粉、全脂奶粉、大豆蛋白粉、乳清蛋白粉、酪蛋白粉、豌豆蛋白粉、酵母蛋白粉及上述的任意组合。
依据本发明一实施例，上述油溶性抗氧化剂可包括但不限于维生素E、虾红素、叶黄素、芝麻油、米糠油、脂肪酸类及上述的任意组合。在一些例子中，前述脂肪酸类可包括但不限于脂肪酸甘油酯、柠檬酸甘油酯、酒石酸甘油酯、乳酸甘油酯、乙氧基甘油酯、磷酸甘油酯、琥珀酸甘油酯、脂肪酸聚合甘油酯、交酯化蓖麻酸聚合甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸丙二醇酯、单及双脂肪酸甘油二乙酰酒石酸酯、脂肪酸盐类及上述的任意组合。
依据本发明一实施例，上述菌体核、短链极性分子层、醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层可构成多层同心立体结构。
根据本发明的另一实施方式，提出一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，包含提供菌体核，将短链极性分子层的多个分子嵌设于菌体核细胞壁表面，将醣类分子层包覆菌体核及短链极性分子层，将双极性抗氧化乳化蛋白层包覆醣类分子层，以及进行干燥步骤，以形成抗氧化多层包埋益生菌颗粒。在一实施例中，上述菌体核可由至少一益生菌所组成，且至少一益生菌可包括但不限于乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合，而短链极性分子层的多个分子则嵌设于至少一益生菌的细胞壁表面。在此实施例中，上述双极性抗氧化乳化蛋白层可由蛋白质与油溶性抗氧化剂进行均质乳化步骤所形成。在此实施例中，菌体核、短链极性分子层、醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层可构成多层同心立体结构。
依据本发明一实施例，上述干燥步骤包括冷冻干燥处理、真空干燥处理或喷雾干燥处理。
应用本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法，所制得的益生菌颗粒具有多层同心立体结构，可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：
图1系绘示根据本发明一实施例的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的剖面示意图。
其中，附图标记说明如下：
100：抗氧化多层包埋益生菌颗粒
110：菌体核 111：细胞膜
113：壁膜间隙 115：细胞壁
121：短链极性分子层 123：醣类分子层
125：双极性抗氧化乳化蛋白层
具体实施方式
承前所述，本发明提供一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒(multilayerantioxidant coating lactic acid bacteria microencapsule，MAOC-LAB)，其利用短链极性分子层的多个分子嵌设于菌体核的益生菌的细胞壁表面，再依序利用醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层包覆二者，以形成多层同心立体结构。
请参照图1，其系绘示根据本发明一实施例的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的剖面示意图。在一实施例中，上述抗氧化多层包埋益生菌颗粒100可包含菌体核110、嵌设于菌体核110细胞壁115表面的短链极性分子层121、设于菌体核110及短链极性分子层121上的醣类分子层123、设于醣类分子层123上的双极性抗氧化乳化蛋白层125。在上述实施例中，菌体核110系由至少一益生菌所组成，而短链极性分子层的多个分子可嵌设于至少一益生菌的细胞壁115表面。在上述实施例中，双极性抗氧化乳化蛋白层可由蛋白质与油溶性抗氧化剂所组成。
在上述实施例中，至少一益生菌的种类并无特别限制，可例如乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合。在此实施例中，上述至少一益生菌的状态亦无特别限制，可例如干燥菌体、含菌酦酵液或含菌浓缩酦酵液及上述的任意组合。在其他例子中，上述至少一益生菌在使用时以浓缩为宜，其光学密度可例如为至少OD600100，而其菌体密度相当于每毫升1×1010菌落形成单位(colony forming unit，cfu)至1×1011cfu/mL。
上述益生菌包含乳酸菌，隶属于革兰氏阳性菌，其细胞壁115由肽聚糖组成，而细胞膜111则兼具亲水性及亲油性的磷脂双层(phospholipid bilayer)薄膜结构，细胞壁115与细胞膜111之间则为壁膜间隙113。革兰氏阳性菌缺乏革兰氏阴性菌的外膜跟脂多醣层，较易受外界环境影响。现有技术在针对上述益生菌进行固定化包埋处理时，大多利用单层的极性亲水性壁材包埋益生菌。惟此等单层包埋结构经干燥后，非极性脂肪酸容易产生大范围的裂解或破损，进而伤害菌体甚至降低干燥后的存活率。
因此，在上述实施例中，抗氧化多层包埋益生菌颗粒可包含短链极性分子层，其多个分子可嵌设于益生菌的细胞壁表面，藉此改善现有单层包埋技术的缺点。申言之，在上述实施例中，短链极性分子层可包括但不限于氨基酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸酯类、醇类化合物、胡萝卜素或茄红素及上述的任意组合。由于上述短链极性分子具可穿透性，可嵌设于益生菌的细胞壁表面，在益生菌后续的干燥过程中，有助于稳定包埋结构，避免益生菌的脂双层结构裂解、崩坏而死亡。倘若抗氧化多层包埋益生菌颗粒未使用上述短链极性分子层嵌设于益生菌的细胞壁表面，则由此包埋的益生菌经干燥后，所得的结构较不稳定，容易导致脂双层结构裂解、崩坏甚至提高干燥后的死亡率。
在上述实施例中，包覆短链极性分子层的醣类分子层可包括但不限于单醣、双醣、寡醣及多醣及上述任意组合，且醣类分子层以结晶态为较佳。
在一些具体例中，上述单醣包含葡萄糖、甘露糖及山梨糖。在一些具体例中，上述双醣包含蔗糖、乳糖及海藻糖。在一些具体例中，上述寡醣包含异麦芽寡糖。在一些具体例中，上述多醣包含淀粉及糊精。由于短链极性分子层可嵌设于益生菌的细胞壁表面，有助于醣类分子层包覆于细胞壁上，改变细胞壁的亲水性。
在一实施例中，抗氧化多层包埋益生菌颗粒包含双极性抗氧化乳化蛋白层，可设于醣类分子层上。在此实施例中，双极性抗氧化乳化蛋白层可由蛋白质与油溶性抗氧化剂所组成。
在上述实施例中，适合的蛋白质可包括但不限于脱脂奶粉、全脂奶粉、大豆蛋白粉、乳清蛋白粉、酪蛋白粉、豌豆蛋白粉、酵母蛋白粉及上述的任意组合。由于蛋白质可与亲水性醣类分子层具良好亲和性并结合，在胃酸环境中又具凝胶性，可降低胃酸中溶解度，提高乳酸菌在胃酸中存活率。
在上述实施例中，适合的油溶性抗氧化剂可包括但不限于维生素E、虾红素、叶黄素、芝麻油、米糠油、脂肪酸类及上述的任意组合。在一些例子中，前述脂肪酸类可包括但不限于脂肪酸甘油酯、柠檬酸甘油酯、酒石酸甘油酯、乳酸甘油酯、乙氧基甘油酯、磷酸甘油酯、琥珀酸甘油酯、脂肪酸聚合甘油酯、交酯化蓖麻酸聚合甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸丙二醇酯、单及双脂肪酸甘油二乙酰酒石酸酯、脂肪酸盐类及上述的任意组合。由于油溶性抗氧化剂能阻绝环境中水气与氧气，可延缓吸湿性。
依据本发明一实施例，上述菌体核、短链极性分子层、醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层可构成多层同心立体结构，有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
本发明另提出一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法。在一实施例中，首先，提供菌体核。在此实施例中，菌体核可由至少一益生菌所组成，关于益生菌的种类及菌体密度已如前所述，此处不另赘言。
接着，在一些实施例中，短链极性分子层的多个分子可先嵌设于菌体核的细胞壁表面后，再将醣类分子层包覆菌体核及短链极性分子层。关于短链极性分子层及醣类分子层的种类如前悉述，不再赘言。在其他实施例中，短链极性分子层亦可与醣类分子层混合后，再与菌体核混合，以包覆菌体核。举例而言，0.5w/v％～30w/v％的短链极性分子可先与浓度30w/v％～60w/v％醣类分子溶于水中混合均匀，将酸碱值调整至pH3～pH8后，将混合溶液加热至60℃～120℃，持温15分钟至120分钟，再与益生菌的菌体核在0kg/cm2至0.25kg/cm2的压力下混合15分钟至120分钟。在这些实施例中，不论短链极性分子层及醣类分子层是先后包覆抑或同时包覆，短链极性分子层的多个分子皆可先嵌设于益生菌细胞壁表面，而醣类分子层则包覆于益生菌细胞壁及短链极性分子层上。
之后，双极性抗氧化乳化蛋白层可包覆醣类分子层。在一些实施例中，双极性抗氧化乳化蛋白层可由蛋白质与油溶性抗氧化剂进行均质乳化步骤所形成。关于蛋白质及油溶性抗氧化剂的种类已如前所述，此处不赘。在一些实施例中，前述的均质乳化步骤可使用2w/v％～20w/v％的蛋白粉、0.05v/v％～8v/v％油脂及油溶性抗氧化剂混合后进行。在这些例子中，均质乳化步骤可使用现有制程条件，或使用例如0巴(Bar)至12Bar的乳化压力、例如4℃至120℃的温度、进行5分钟至90分钟。
而后，将包埋短链极性分子层、醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层的菌体核进行干燥步骤，以形成抗氧化多层包埋益生菌颗粒。上述干燥步骤可使用现有方式进行，例如冷冻干燥处理、真空干燥处理或喷雾干燥处理等，惟本发明不限于上述所举。在一些实施例中，上述冷冻干燥处理可使用现有制程条件，或将上述包埋多层的菌体核置于-35℃或以下的温度进行冷冻干燥处理，以获得抗氧化多层包埋益生菌颗粒。抗氧化多层包埋益生菌颗粒可于40℃以下的温度储放，以避免多层包埋结构的层次分离。
由此所得的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，菌体核、短链极性分子层、醣类分子层及双极性抗氧化乳化蛋白层可构成多层同心立体结构，经实验证实，可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
补充说明的是，相较于现有包覆材料及制程，本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法藉由特定组成及特定制程，有效降低壁材的体积及含量。如此一来，不仅提高抗氧化多层包埋益生菌颗粒经干燥后的活菌数，制程中又无需使用流动床干燥机，成本较现有包埋方式(例如晶球)更加容易、降低成本且容易量产。
以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
实施例一：制备抗氧化多层包埋益生菌颗粒
制备例1
首先，将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌体核(至少OD600100)依序利用6w/v％的短链极性分子层与35w/v％的醣类分子层的混合溶液进行包埋，再利用20w/v％的双极性抗氧化乳化蛋白层进行包埋。前述短链极性分子层与醣类分子层混合溶液的酸碱值为pH 4.0±0.5，包覆时的加热温度为90℃±5、持温时间30分钟、压力为0.15kg/cm2。双极性抗氧化乳化蛋白层则是混合30w/v％的脱脂奶粉(skim milk)以及0.2w/v％的维生素E(VIT.E)后，在2bar的压力及90℃的温度下进行均质乳化30分钟而形成。之后，上述多层包埋颗粒于-40℃冷冻24小时，再于-30℃进行冷冻干燥处理达72小时后，经20目筛网磨粉过筛，以制得抗氧化多层包埋益生菌颗粒。
制备例2
制备例2的制程条件同制备例1，不同之处在于制备例2的菌体核为雷特氏B菌(Bifidobacterium lactis)。
比较例1
首先，将含有6w/v％的短链极性分子、35w/v％的醣类分子及20w/v％的双极性抗氧化乳化蛋白的混合溶液，对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌体核(至少OD600100)进行单层包埋，其中单层包覆的酸碱值、加热温度为90℃±5、持温时间、压力等制程条件与制备例1相同，此处不另赘述。之后，上述单层包埋颗粒于-40℃冷冻24小时，再于-30℃进行冷冻干燥处理达72小时后，经20目筛网磨粉过筛而制得单层包埋益生菌颗粒。
比较例2
比较例2的制程条件同比较例1，不同之处在于比较例2的菌体核为雷特氏B菌(Bifidobacterium lactis)。
实施例二：评估实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的保护效果
1.评估抗吸湿潮解性
首先，将实施例一的制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，以及比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，分别置于培养皿(直径9cm)中，精秤其初始重量。接着，将制备例1、制备例2、比较例1与比较例2的包埋益生菌颗粒暴露于湿度75％±5％的环境中，每隔5分钟，精秤其各时间点测得的重量，共连续测量20分钟。然后，根据式(I)评估各时间点的吸水率，其结果如表1所示。
Figure BDA0002838158610000091
表1
Figure BDA0002838158610000092
Figure BDA0002838158610000101
由表1结果可知，以20分钟吸水率为例，相较于比较例1，制备例1的抗氧化多层包埋益生菌颗粒可降低33.7％的相对吸水量[相对吸水量＝(制备例1-比较例1)/比较例1×100％]。同样以20分钟吸水率为例，相较于比较例2，制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒可降低36％的相对吸水量。由此结果证实，不论以嗜酸乳杆菌或雷特氏B菌为菌体核，实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒确实可有效降低吸水率及相对吸水量，具有抗吸湿潮解的效果，进而提高产品加工的稳定性。
2.评估储存安定性
实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及单层包埋益生菌颗粒在不同温度下储存一段时间后，分别测量其活菌数，以评估不同包埋技术对益生菌安定性的差异。
首先，将实施例一的制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，以及比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，分别包装于铝箔夹链袋中，然后储存于不同的温度区间，例如低于-10℃、低于7℃、25℃及40℃，或合并高湿环境(65％±5％RH，75％±5％RH)中。经储存三个月后，统计各组活菌数，其结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002838158610000102
由表2结果可知，不论是制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，或比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，在低于7℃储存三个月后，二种包埋技术皆可提供益生菌良好的保护。然而，在25℃及40℃储存三个月后，可发现制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的活菌数，显著高于比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒。相较于比较例1，制备例1的抗氧化多层包埋益生菌颗粒储放在40℃中，可提高嗜酸乳杆菌20倍的活菌数。同样地，相较于比较例2，制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒可提高雷特氏B菌超过50倍的活菌数。上述结果证明，实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒确实有助于提高益生菌在不同温度下的储存安定性。
3.评估耐氧化性
此实施例是在流动床机干燥机中通入高量空气，以提供强烈氧化的环境，藉此评估不同包埋技术对益生菌耐氧化性的差异。
首先，在流动床干燥机的舱体内，分别置入50公斤的制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，以及比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒。接着，启动流动床造粒模式，其中通气量为800m3/hr，入口风相对湿度为小于7％，入口风温度为50℃，全程共1小时。在过程中，每隔15分钟取样检测活菌数，观察在高温、低湿、高量空气的强氧化环境下，不同包埋技术对益生菌活菌数的变化，其结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002838158610000111
由表3结果可知，在高温、低湿、高量空气的强氧化环境下，的确会降低益生菌的存活率。不过，以喷雾时间60分钟的活菌数为例，制备例1的抗氧化多层包埋益生菌颗粒与比较例1的单层包埋益生菌颗粒，二者嗜酸乳杆菌的活菌数差异可达7.4倍。同样地，制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，二者雷特氏B菌的活菌数差异可达3倍。由此结果证实，在高氧化伤害的环境下，实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒确实可有效提高益生菌的耐氧化性。
4.评估胃酸耐受性
前述实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及单层包埋益生菌颗粒分别浸泡于十倍重量的酸化磷酸缓冲盐溶液中，经3个小时反应后，以模拟胃酸处理的环境。分别测量不同包埋技术的益生菌在不同pH值的环境下的活菌数，藉此评估不同包埋技术对益生菌的胃酸耐受性，结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0002838158610000121
由表4结果可知，不论是制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，或比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，在中性pH 7.2及pH 3.2的环境下，各组间的活菌数无显著差异。然而，当环境酸碱值降低至pH 2.4或pH 2.0时，制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的活菌数，显著高于比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，其差异最多可达117倍。上述结果证实，抗氧化多层包埋益生菌颗粒确实有助于提高益生菌(不论嗜酸乳杆菌或雷特氏B菌)的胃酸耐受性。
5.评估酵素分解耐受性
此实施例是将制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，以及比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，分别添加至0.1％的不同酵素水溶液中，藉此评估不同包埋技术对益生菌的酵素分解耐受性的差异。
首先，将100克的制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，以及比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，分别加入含有乳糖分解酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、木瓜酵素等水溶液中(酵素浓度为50,000U/mL)，在40℃的温度下反应10分钟后，计算各组活菌数，其结果如表5所示。
表5
组别 PBS 乳糖酶 胰蛋白酶 葡萄糖氧化酶 木瓜酵素
制备例1 1.2×10<sup>11</sup> 9.2×10<sup>10</sup> 9.1×10<sup>10</sup> 1.1×10<sup>11</sup> 7.7×10<sup>10</sup>
制备例2 3.1×10<sup>11</sup> 3.4×10<sup>11</sup> 3.2×10<sup>11</sup> 2.4×10<sup>11</sup> 1.1×10<sup>11</sup>
比较例1 1.1×10<sup>11</sup> 8.4×10<sup>10</sup> 7.1×10<sup>10</sup> 1.2×10<sup>11</sup> 4.0×10<sup>10</sup>
比较例2 2.8×10<sup>11</sup> 2.2×10<sup>11</sup> 7.6×10<sup>10</sup> 2.1×10<sup>11</sup> 7.9×10<sup>10</sup>
由表5结果可知，不同的酵素处理对益生菌的活菌数产生程度不等的影响。比较二种糖类分解酵素(即乳糖分解酶、葡萄糖氧化酶)及二种蛋白酶(即胰蛋白酶、木瓜酵素)的结果可知，不论是制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，或比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒，经醣类分解酵素处理后，对于嗜酸乳杆菌或雷特氏B菌的活菌数并无显著差异。然而，经蛋白酶处理后，制备例1与制备例2的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的活菌数，明显高于比较例1与比较例2的单层包埋益生菌颗粒。上述结果证明，实施例一的抗氧化多层包埋益生菌颗粒确实有助于提高益生菌的对蛋白酵素分解耐受性，尤其是富含蛋白消化酵素的胃液。
综言之，由上述数个实施例证实，本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法，所制得的益生菌颗粒具有多层同心立体结构，确实可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
需补充的是，本发明虽以特定的制程或特定的分析方法作为例示，说明本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法亦可使用其他制程或其他的分析方法进行。
由上述实施例可知，本发明的抗氧化多层包埋益生菌颗粒及其制造方法，其优点在于所制得的益生菌颗粒具有多层同心立体结构，可有效提升益生菌的抗吸湿潮解性、储存安定性、耐氧化性、胃酸耐受性及酵素分解耐受性。
虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定者为准。

Claims (26)

1.一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，所述抗氧化多层包埋益生菌颗粒包含：
一菌体核，其中该菌体核系由至少一益生菌所组成；
一短链极性分子层，其中该短链极性分子层的多个分子系嵌设于该至少一益生菌的一细胞壁表面，且该短链极性分子层系选自于由氨基酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸酯类、醇类化合物、胡萝卜素或茄红素及上述的任意组合所组成的一族群；
一醣类分子层，设于该菌体核及该短链极性分子层上，其中该醣类分子层系选自于由单醣、双醣、寡醣及多醣及上述任意组合所组成的一族群，且该醣类分子层为一结晶态；以及
一双极性抗氧化乳化蛋白层，设于该醣类分子层上，其中该双极性抗氧化乳化蛋白层系由一蛋白质与一油溶性抗氧化剂所组成。
2.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该至少一益生菌系选自于由乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合所组成的一族群。
3.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该至少一益生菌系选自于由一干燥菌体、一含菌酦酵液、一含菌浓缩酦酵液及上述的任意组合所组成的一族群。
4.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，其中该至少一益生菌的一菌体密度为每毫升1×1010菌落形成单位(colony forming unit，cfu)至1×1011cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该氨基酸盐类系选自于由L-组胺酸盐酸盐、DL-蛋胺酸、L-离胺酸盐酸盐、磷酸一钾、L-麸酸钠及上述的任意组合所组成的一族群。
6.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该磷酸盐类系选自于由磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸钙、磷酸二钠、磷酸三纳、磷酸三钙、三聚磷酸钠、四聚磷酸钠及上述的任意组合所组成的一族群。
7.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，其中该柠檬酸酯类系选自于由柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸亚铁纳、柠檬酸钾、柠檬酸铁及上述的任意组合所组成的一族群。
8.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该醇类化合物系选自于由D-甘露醇、生育醇、麦芽糖醇丙二醇D-山梨醇、乳糖醇、肌醇、D-木糖醇及上述的任意组合所组成的一族群。
9.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该单醣包含葡萄糖、甘露糖及山梨糖，该双醣包含蔗糖、乳糖及海藻糖，该寡醣包含异麦芽寡糖，且该多醣包含淀粉及糊精。
10.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该蛋白质系选自于由脱脂奶粉、全脂奶粉、大豆蛋白粉、乳清蛋白粉、酪蛋白粉、豌豆蛋白粉、酵母蛋白粉及上述的任意组合所组成的一族群。
11.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该油溶性抗氧化剂系选自于由维生素E、虾红素、叶黄素、芝麻油、米糠油、脂肪酸类及上述的任意组合所组成的一族群。
12.根据权利要求11所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该脂肪酸类系选自于由脂肪酸甘油酯、柠檬酸甘油酯、酒石酸甘油酯、乳酸甘油酯、乙氧基甘油酯、磷酸甘油酯、琥珀酸甘油酯、脂肪酸聚合甘油酯、交酯化蓖麻酸聚合甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸丙二醇酯、单及双脂肪酸甘油二乙酰酒石酸酯、脂肪酸盐类及上述的任意组合所组成的一族群。
13.根据权利要求1所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其特征在于，该菌体核、该短链极性分子层、该醣类分子层及该双极性抗氧化乳化蛋白层系构成多层同心立体结构。
14.一种抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：
提供一菌体核，其中该菌体核系由至少一益生菌所组成，且该至少一益生菌系选自于由乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合所组成的一族群；
将一短链极性分子层的多个分子嵌设于该至少一益生菌的一细胞壁表面，其中该短链极性分子层系选自于由氨基酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸酯类、醇类化合物、胡萝卜素或茄红素及上述的任意组合所组成的一族群；
将一醣类分子层包覆该菌体核及该短链极性分子层，其中该醣类分子层系选自于由单醣、双醣、寡醣及多醣及上述任意组合所组成的一族群，且该醣类分子层为一结晶态；
将一双极性抗氧化乳化蛋白层包覆该醣类分子层，其中该双极性抗氧化乳化蛋白层是由一蛋白质与一油溶性抗氧化剂进行一均质乳化步骤所形成；以及
进行一干燥步骤，以形成该抗氧化多层包埋益生菌颗粒，其中该菌体核、该短链极性分子层、该醣类分子层及该双极性抗氧化乳化蛋白层系构成多层同心立体结构。
15.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该至少一益生菌系选自于由乳杆菌、乳球菌、比菲德氏菌及酵母菌及上述的任意组合所组成的一族群。
16.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该至少一益生菌为一干燥菌体、一含菌酦酵液或一含菌浓缩酦酵液。
17.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该至少一益生菌的一菌体密度为1×1010cfu/mL至1×1011cfu/mL。
18.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该氨基酸盐类系选自于由L-组胺酸盐酸盐、DL-蛋胺酸、L-离胺酸盐酸盐、磷酸一钾、L-麸酸钠及上述的任意组合所组成的一族群。
19.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，磷酸盐类系选自于由磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸钙、磷酸二钠、磷酸三纳、磷酸三钙、三聚磷酸钠、四聚磷酸钠及上述的任意组合所组成的一族群。
20.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该柠檬酸酯类系选自于由柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸亚铁纳、柠檬酸钾、柠檬酸铁及上述的任意组合所组成的一族群。
21.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该醇类化合物系选自于由D-甘露醇、生育醇、麦芽糖醇丙二醇D-山梨醇、乳糖醇、肌醇、D-木糖醇及上述的任意组合所组成的一族群。
22.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该单醣包含葡萄糖、甘露糖及山梨糖，该双醣包含蔗糖、乳糖及海藻糖，该寡醣包含异麦芽寡糖，且该多醣包含淀粉及糊精。
23.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该蛋白质系选自于由脱脂奶粉、全脂奶粉、大豆蛋白粉、乳清蛋白粉、酪蛋白粉、豌豆蛋白粉、酵母蛋白粉及上述的任意组合所组成的一族群。
24.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该油溶性抗氧化剂系选自于由维生素E、虾红素、叶黄素、芝麻油、米糠油、脂肪酸类及上述的任意组合所组成的一族群。
25.根据权利要求24所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该脂肪酸类系选自于由脂肪酸甘油酯、柠檬酸甘油酯、酒石酸甘油酯、乳酸甘油酯、乙氧基甘油酯、磷酸甘油酯、琥珀酸甘油酯、脂肪酸聚合甘油酯、交酯化蓖麻酸聚合甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸丙二醇酯、单及双脂肪酸甘油二乙酰酒石酸酯、脂肪酸盐类及上述的任意组合所组成的一族群。
26.根据权利要求14所述的抗氧化多层包埋益生菌颗粒的制造方法，其特征在于，该干燥步骤包括冷冻干燥处理、真空干燥处理或喷雾干燥处理。
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