EA037388B1 - Штамм lactobacillus paracasei для продуцирования линолевой кислоты с сопряженными связями, питательные и фармацевтические препараты, содержащие этот штамм, и их применение - Google Patents
Штамм lactobacillus paracasei для продуцирования линолевой кислоты с сопряженными связями, питательные и фармацевтические препараты, содержащие этот штамм, и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA037388B1 EA037388B1 EA201890223A EA201890223A EA037388B1 EA 037388 B1 EA037388 B1 EA 037388B1 EA 201890223 A EA201890223 A EA 201890223A EA 201890223 A EA201890223 A EA 201890223A EA 037388 B1 EA037388 B1 EA 037388B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- lactobacillus paracasei
- strain
- lmg
- cla
- linoleic acid
- Prior art date
Links
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 title claims abstract description 165
- JBYXPOFIGCOSSB-GOJKSUSPSA-N 9-cis,11-trans-octadecadienoic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O JBYXPOFIGCOSSB-GOJKSUSPSA-N 0.000 title claims abstract description 108
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 title claims abstract description 92
- 229940108924 conjugated linoleic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 title abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims abstract description 81
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 81
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 24
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 32
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 25
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 17
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 15
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 11
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 10
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 10
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 8
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 claims description 8
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical class OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 235000021255 galacto-oligosaccharides Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000003271 galactooligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 claims description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 3
- 230000007147 bacterial dysbiosis Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 claims 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 claims 2
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 32
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 24
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 20
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 18
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 18
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- -1 silver ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 3
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 201000009863 inflammatory diarrhea Diseases 0.000 description 3
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N Polydextrose Polymers OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 201000004983 autoimmune atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003043 biohydrogenation Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 1
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical class [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000288157 Passiflora edulis Species 0.000 description 1
- 235000000370 Passiflora edulis Nutrition 0.000 description 1
- 229920001100 Polydextrose Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000294 Resistant starch Polymers 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 1
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 description 1
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 description 1
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- RPOLGTNRZHMBKA-UHFFFAOYSA-N nonaazanium 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O RPOLGTNRZHMBKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000001259 polydextrose Substances 0.000 description 1
- 235000013856 polydextrose Nutrition 0.000 description 1
- 229940035035 polydextrose Drugs 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000021254 resistant starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000012748 slip agent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000007916 tablet composition Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
- A61K9/009—Sachets, pouches characterised by the material or function of the envelope
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
- A61K9/2095—Tabletting processes; Dosage units made by direct compression of powders or specially processed granules, by eliminating solvents, by melt-extrusion, by injection molding, by 3D printing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к новому штамму, принадлежащему к виду Lactobacillus paracasei, способному превращать линолевую кислоту в линолевую кислоту с сопряженными связями. Настоящее изобретение также относится к питательным препаратам, или пищевым продуктам, и/или фармацевтическим композициям, которые содержат штамм Lactobacillus paracasei и могут быть использованы для лечения и/или профилактики патологий и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом линолевой кислоты с сопряженными связями, или в случае, когда рекомендуется применение пробиотика.
Description
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к новому штамму, принадлежащему к виду Lactobacillus paracasei, обозначаемому LMG S-26420 и способному превращать линолевую кислоту (LA) в линолевую кислоту с сопряженными связями (CLA), который используется для лечения и профилактики заболеваний и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом линолевой кислоты с сопряженными связями, или в случае, когда рекомендуется применение пробиотика; к способам получения такого штамма и к фармацевтическим или питательным композициям, содержащим это штамм.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 может быть также использован для лечения и профилактики всех расстройств, при которых введение пробиотика дает благоприятный эффект, например для сохранения и поддержания баланса кишечной флоры.
Термин CLA означает смесь изомеров положений и геометрических изомеров линолевой кислоты (LA), где двойные связи являются сопряженными в различных положениях, образуя тем самым цис- и транс-изомеры.
Известны по меньшей мере 16 изомеров CLA, и изомерами, представляющими особый биологический интерес, являются изомеры c9-t11 и t9-t11. Изомер c9-t11 является преобладающим изомером в пище, и было подтверждено, что он играет важную роль, поскольку он участвует во многих биологических процессах и включен в фосфолипидную фракцию тканей животных, содержащих смеси изомеров CLA.
CLA продуцируется в организме человека в основном на низком уровне, а поэтому ее недостаток восполняется употреблением молочных продуктов и мяса с пищей или добавок, содержащих пробиотические бактерии.
Продукты животного происхождения, полученные от жвачных животных, являются основными источниками CLA для человека. Такие источники являются промежуточными соединениями реакции биогидрогенизации линолевой кислоты, и хорошо известно, что продуцирование CLA у жвачных животных происходит посредством реакции неполной биогидрогенизации ненасыщенных кислот, а именно линолевой кислоты, осуществляемой бактериями жвачных животных.
CLA вводится в организм вместе с молоком, рыбой, мясом и молочными продуктами, и ее полезное действие коррелирует с ежедневным ее потреблением на уровне приблизительно 3 г/день. При несбалансированной диете в среднем потребление CLA составляет 0,35 г/день, и этот дефицит должен быть компенсирован посредством употребления пробиотиков, превращающих LA в CLA, что будет обеспечивать нужные дозы, которые, как считается, оказывают полезное действие на организм.
Биологическая активность линолевых кислот с сопряженными связями обусловлена главным образом действием изомеров c9-t11 и t10-c12; причем основная биологическая активность, ассоциированная с противораковым действием, обусловлена изомером c9-t11, а изомер t10-c12 участвует в метаболизме липидов в организме человека.
CLA обладает важными биологическими свойствами и является полезной для здоровья человека и животных, например при воспалительных заболеваниях кишечника, диарее и воспалении толстой кишки, для увеличения массы тела, для повышения термогенеза, для защиты от окислительного стресса, для предупреждения образования опухолей и при аутоиммунных заболеваниях, воспалительных заболеваниях, диабете и атеросклерозе.
Ecker J. et al., Biochem. Bioph. Res. Comm. 388, 2009, 660-666 сообщают, что изомер c9-t11 активирует ген-мишень LXR, участвующий в развитии и прогрессировании атеросклероза. Ogawa J. et al., Appl. Env. Microbiol 2001, 67, 1246 описывают продуцирование специфических изомеров CLA из линолевой кислоты лактобациллами, Lactobacillus acidophilus, в микроаэрофильных условиях и высказывают предположение, что оксикислота 10-гидрокси-цис-12-октадеканоид является промежуточным соединением такой реакции превращения и что эта реакция превращения осуществляется более чем за одну стадию.
Ogawa J. et al., J. Bioscience Bioeng. 100 (4), 355 (2005) сообщают о превращении LA в CLA бифидобактериями и лактобациллами с образованием смеси изомеров. При использовании бифидобактерий продуцирование изомеров CLA варьируется приблизительно от 3 до 400 мг на литр культуры, а при использовании лактобацилл продуктивность варьируется приблизительно от 100 мг до 4 г на литр культуры. При использовании Lactobacillus casei продуктивность никогда не превышает 1 г на литр культуры.
Rosberg-Cody E. et al., Appl. Env. Microbiol 70 (8) 4635, 2004 описывают выделение штаммов бифидобактерий из материала фекалий новорожденных, используемого для продуцирования CLA, и предлагают использовать эти бактерии в добавках для питания новорожденных с риском некрозирующего энтероколита.
Кроме того, Coakley M. et al., J. Appl. Microbiol. 94, 138 (2003) описывают способность лактобацилл, лактококков и бифидобактерий превращать LA в CLA, и ими было продемонстрировано, что штаммы бифидобактерий обладают более высокой способностью превращать LA в CLA, и процент такого превращения составляет почти 65%.
Alonso L. et al., J. Diary Sci. 86, 1941 (2003) описывают превращение LA в CLA бактериями Lactobacilli casei и Lactobacilli acidophilus кишечника человека в среде с добавлением различных концентраций линолевой кислоты. При концентрациях линолевой кислоты 0,02% максимальная концентрация CLA, продуцируемой бактерией Lactobacillus casei, составляет приблизительно 110 мг на литр культуры, а ко- 1 037388 личество изомера c9-t11, представляющего биологический интерес, составляет от 60 до 85 мг на литр культуры.
Gustavo A. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 77 (3), 648-650, 2013 описывают быстрый и более простой метод скрининга бактерий, продуцирующих линолевую кислоту с сопряженными связями (CLA) и выделенных из коровьего молока. Один штамм, подобный L. Paracasei, превращает свободную линолевую кислоту в полноразмерную CLA более чем на 85%. Однако процент превращения изомера CLA c9,t11, представляющего биологический интерес, составляет приблизительно лишь 18%.
Oguz Gursoy et al., International Journal of Food Sciences and Nutrition, 63(5), 610-615 описывают влияние использования различных культур пробиотиков на концентрацию линолевой кислоты с сопряженными связями и на состав жирных кислот в сыре. Эти авторы сообщают, что различия пробиотиков и способ их хранения не влияют на статистическое содержание CLA в образцах. Повышение содержания CLA в образцах сыра обусловлено липолизом свободной линолевой кислоты молочнокислыми бактериями.
Потребление пробиотических продуктов, содержащих лактобациллы, также является полезным для поддержания баланса бактериальной флоры кишечника и может оказаться ценным средством для профилактики и лечения дисбиоза в целом, где баланс между бифидобактериями и лактобациллами имеет очень важное значение.
Принимая во внимание низкое содержание CLA в пище и учитывая дозу, подходящую для лечения всех патологий и расстройств, ассоциированных с дефицитом CLA, необходимо получить бактерии, превращающие LA в CLA для приготовления суточных доз, полезных для здоровья индивидуума и используемых для лечения всех патологий, при которых изомеры CLA дают благоприятный эффект.
Бифидобактерии превращают LA в CLA, но культуры бифидобактерий имеют недостаток, заключающийся в низком выходе продукта, а именно числа бактерий на литр культуры, а поэтому эти бактерии трудно получить в большом количестве в промышленном масштабе.
Следовательно, необходимо получить бактериальный штамм, который обладал бы способностью превращать LA в CLA, продуцируемую бактериальными культурами с высокой продуктивностью, и который мог бы быть использован в фармацевтических или питательных препаратах для лечения или профилактики всех расстройств и патологий, ассоциированных с дефицитом CLA.
Также необходимо получить бактериальный штамм, принадлежащий к роду Lactobacillus и способный превращать LA в изомеры CLA, полезные для человека или животных. Кроме того, также необходимо получить лактобациллы для лечения всех расстройств или патологий, ассоциированных с микробным дисбалансом на поверхности тела. Штамм, принадлежащий к роду молочнокислых бактерий, может быть введен в комбинации с бактериями рода Bifidus для стимуляции баланса микробов флоры человека или животного.
Бактериями, принадлежащими к роду Lactobacillus, являются бактерии с наивысшей продуктивностью, а поэтому они являются более предпочтительными, чем бактерии, принадлежащие к роду Bifidobacterium, для превращения LA в CLA. Лактобациллы могут быть получены промышленными способами с более высоким выходом, чем бифидобактерии, и могут быть использованы для получения питательных или фармацевтических композиций, вводимых человеку или животному.
Среди этих бактерий предпочтительными являются лактобациллы, обладающие большей способностью превращать LA в изомеры c9-t11 и t9-t11 CLA, чем в другие изомеры. c9-t11 является главным изомером, поскольку он участвует в образовании фосфолипидов клеточной мембраны и является преобладающим изомером, присутствующим в пищевых продуктах. Эти изомеры оказывают полезное действие на человека и животных, а в частности изомер t9-t11 обладает антипролиферирующими и противораковыми свойствами. Ecker J. et al., Biochem. Biophysical. Res. Comm. 388, 660, 2009 сообщают, что изомер t9-t11 CLA является сильным агонистом макрофагального LXR, ассоциированного с процессами индуцирования воспаления, и играет важную роль в замедлении артериосклеротических процессов у животных-моделей.
В настоящем изобретении описан штамм, принадлежащий к роду Lactobacillus и называемый Lactobacillus paracasei LMG S-26420, и этот штамм способен превращать LA в CLA с большим процентом превращения, чем другие штаммы лактобацилл, известные специалистам. Кроме того, штамм LMG S-26420 согласно изобретению характеризуется способностью превращать LA в CLA, где смесь изомеров c9-t11 и t10-c12 преобладает по сравнению с другими изомерами.
Этот штамм получают с использованием бактериальных культур, характеризующихся продуктивностью более чем 4 г на литр культуры, и такой штамм может быть получен в лиофильной форме.
Этот штамм является стабильным, и такой продукт бактериальной культуры может храниться в течение длительного периода времени при температуре ниже 0°С или более 6 месяцев при 4°С в лиофильной форме. Штамм LMG S-26420 может содержаться в питательных препаратах, или в пищевых продуктах, или в фармацевтических композициях, используемых для лечения и/или профилактики расстройств или патологий, ассоциированных с дефицитом CLA, и всех расстройств, при которых потребление пробиотиков будет полезным для человека или животных.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении описан новый штамм, принадлежащий к роду Lactobacillus, называемому
- 2 037388
Lactobacillus paracasei и депонированному в Бельгийской Объединенной коллекции микроорганизмов
ВССМ/бактерий LMG - Микробиологической лаборатории университета Гента - 15 апреля 2011 под номером LMG S-26420.
Бактерия Lactobacillus Paracasei LMG S-26420 характеризуется тем, что она превращает линолевую кислоту в линолевую кислоту с сопряженными связями на более чем 30%.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется тем, что он превращает линолевую кислоту (LA) в линолевую кислоту с сопряженными связями (CLA) на более чем 30% по сравнению с исходной LA, где биологические изомеры с биологической активностью c9-t11 и t9-t11 составляют более чем 30% по сравнению с другими изомерами CLA.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется тем, что он продуцирует CLA в высокой концентрации.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 получают из бактериальных культур, характеризующихся продуктивностью более чем 4 г на литр культуры и выходом колониеобразующих единиц (КОЕ) более чем 1 х 109 на миллилитр культуры.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется своей стабильностью: он может храниться при температуре ниже 0°С, и в течение периода времени более чем 6 месяцев при 4°С в лиофильной форме.
Лиофильный штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется тем, что в нем количество живых клеток составляет более чем 1х 1010, а в частности приблизительно от 1х 1010 до 7х1010 единиц на грамм лиофильного продукта.
Целью настоящего изобретения является разработка способа продуцирования штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в бактериальной культуре, где инокулят штамма LMG S-26420 имеет концентрацию от 0,1 до 10% (об./об.) в культуральной среде при температуре от 30 до 37°С, при величинах рН от 4,5 до 7,5, в течение периода времени от 6 до 15 ч. Биомассу разделяют, после чего она может храниться при температуре ниже 4°С или может быть подвергнута лиофилизации.
Описанный способ позволяет получить штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 с числом колониеобразующих единиц (КОЕ) от 1х 109 до 1х 109 на миллилитр культуры и с биомассой в количестве от 10 до 20 г/л культуры.
Способ, включающий лиофилизацию, позволяет получить штамм LMG S-26420 в твердой форме. В присутствии криозащитных агентов полученный штамм имеет выход колониеобразующих единиц (КОЕ) более чем 50%, а лиофильный штамм LMG S-26420 содержит клетки в количестве более чем 1х 1010 на грамм лиофильного продукта.
Целью настоящего изобретения являются питательные препараты или пищевые продукты и фармацевтические композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в лиофильной форме в количестве, соответствующем количеству живых клеток приблизительно от 1 х 108 до приблизительно 5х1011.
Питательные препараты или пищевые продукты и фармацевтические композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть приготовлены в форме саше, таблеток или капсул. Питательные препараты или пищевые продукты и фармацевтические композиции могут содержать пребиотики, витамины, минеральные соли и фармацевтические или питательные наполнители.
Пребиотики, содержащиеся в композициях Lactobacillus paracasei LMG S-26420, выбраны из группы, состоящей из фрукто-олигосахаридов, инулинов, галакто-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, изомальто-олигосахаридов и витаминов, выбранных из группы, включающей витамины комплекса Е и В.
Питательные препараты или пищевые продукты и фармацевтические композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут включать бифидобактерии.
Композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть использованы для лечения и профилактики патологий и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом линолевой кислоты с сопряженными связями, и во всех других случаях, где использование пребиотика дает ценный и полезный эффект.
В частности, композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть использованы для лечения и профилактики патологий и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом CLA, таких как, например, воспалительные заболевания кишечника, диарея и воспаление толстой кишки; для увеличения массы тела; для повышения термогенеза; для защиты от окислительного стресса; для предупреждения образования опухолей; и для лечения и профилактики аутоиммунных заболеваний, диабета и атеросклероза.
Целью настоящего изобретения являются композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S26420 вместе с бифидобактериями и используемые для лечения всех расстройств, ассоциированных с бактериальным дисбиозом.
Композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть использованы при всех физиологических состояниях, при которых баланс бактериальной флоры кишечника у человека и животных должен оставаться неизменным.
- 3 037388
Описание изобретения
Чистая бактериальная культура штамма, принадлежащего к роду Lactobacillus paracasei, была депонирована в Бельгийской Объединенной коллекции микроорганизмов ВССМ/бактерий LMG Микробиологической лаборатории - Университета Гента под номером LMG S-26420.
Настоящее изобретение относится к новому штамму Lactobacillus paracasei LMG S-26420, к фармацевтическим, питательным или пищевым композициям, содержащим указанный штамм, и к их применению для лечения и/или профилактики патологий и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом линолевой кислоты с сопряженными связями, или в случае, когда рекомендуется применение пробиотика.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 был выделен из бактериальной флоры влагалища здоровой женщины и отобран из многих других штаммов лактобацилл, выделенных одновременно из одного и того же источника и из биологических образцов других типов и из других штаммов одного и того же вида, поскольку было обнаружено, что этот штамм способен превращать линолевую кислоту (LA) в линолевую кислоту с сопряженными связями (CLA). Благодаря этому свойству такой штамм становится пробиотическим агентом, полезным для человека и животного.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется тем, что он превращает LA в CLA на более чем 30%, как было определено хроматографическим методом.
Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращает LA в изомеры CLA с биологической активностью, а в частности в изомеры c9-t11 и t9-t11. В конкретном аспекте изобретения Lactobacillus paracasei LMG S26420 превращает LA в изомеры c9-t11 и t9-t11 CLA на более чем 30%.
Для оценки способности штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращать LA в CLA было применено три различных метода: метод Ogawa, метод Liu и хроматографический метод.
Применение метода Ogawa J., описанного в Appl. Environ. Microbiol 67(3): 1246-1252, 2001, позволяет определить способность штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращать LA в CLA в подходящей культуральной среде после добавления LA в бактериальную культуру для метаболической адаптации клеток.
В первом случае, LA, в различных концентрациях от 0,01 до 1 мг/мл, добавляют к серии клеточных культур штамма LMG S-26420, и эти клетки инкубируют в течение периода времени от 1 до 4 дней при температуре от 30 до 40°С. Конечный продукт центрифугируют и к клеткам добавляют LA в постоянной концентрации, равной 5 мг/мл. Клеточные культуры инкубируют при температуре от 30 до 40°С в течение периода времени от 40 до 80 ч, а затем центрифугируют для удаления супернатанта. Для оценки способности штамма превращать LA в CLA клетки ресуспендируют в воде и определяют CLA спектрофотометрическим методом.
Во втором случае LA в постоянной концентрации, равной 5 мг/мл, добавляют к серии клеточных культур Lactobacillus paracasei LMG S-26420, и биомассу, полученную по окончании культивирования, инкубируют с LA в различных концентрациях от 0,05 до 0,4 мг/мл.
В обоих случаях было показано, что Lactobacillus paracasei LMG S-26420 является эффективным для превращения LA в CLA, в частности на более чем 30%.
Применение метода Liu P., описанного в Biomed. & Biotechnol. 12811, 923-930, 2011, включает инокуляцию штамма LMG S-2 642 0 в адекватной культуральной среде с LA в концентрациях от 0,05 до 1 мг/мл. Эти культуры инкубируют в течение периода времени от 1 до 3 дней при температуре от 30 до 40°С, а затем центрифугируют. Концентрации CLA определяют спектрофотометрическим методом.
Испытания, проводимые методами Ogawa и Liu, выявили способность штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращать LA в CLA. Однако эти методы не позволяют определить процент превращения в изомеры CLA, а в частности если этот штамм способен превращать LA в изомеры CLA, обладающие наивысшей биологической активностью.
Хроматографический метод, в свою очередь, позволяет разделять и количественно оценивать геометрические изомеры CLA, изомеры транс-транс, транс-цис и цис-цис, а в частности изомеры цис9транс11, транс10-цис12 и транс9-транс11.
Полученные изомеры CLA были определены с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на ионах серебра (ЖХВД) с помощью диодно-матричного детектора и УФ-детектора на 234 нм.
Хроматографический метод продемонстрировал, что штамм LMG S-26420 превращает LA в CLA на более чем 30%.
Хроматографический метод продемонстрировал, что штамм LMG S-26420 превращает LA в CLA на 30-50%, где процент изомеров с биологической активностью, c9-t11 и t9-t11, превышает процент других изомеров. В частности, штамм LMG S-26420 превращает LA в изомеры CLA c9-t11 и t9-t11, где количество этих изомеров на 40% больше, чем количество всех других геометрических изомеров CLA.
Штамм LMG S-26420 получают из бактериальных культур, характеризующихся числом колониеобразующих единиц (КОЕ) более чем 1х109/мл и количеством твердой массы более чем 4 г/л культуры. Полученный новый бактериальный штамм является стабильным при температуре ниже 4°С в течение более длительных периодов времени и может быть лиофилизован способами, позволяющими в значи- 4 037388 тельной степени сохранять жизнеспособность клеток. Лиофилизованные продукты являются стабильными в течение более чем 3 месяцев при температуре 4 и 25°С.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 продуцирует лиофилизованную биомассу в количестве более чем 4 г/л культуры, а в частности от 10 до 20 г/л культуры. Принимая во внимание способность этого штамма превращать LA в CLA в количестве более чем 30%, можно сказать, что новый штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 способен продуцировать CLA в значительных концентрациях. Так, например, добавление Lactobacillus paracasei LMG S-26420 к растворам, содержащим линолевую кислоту в концентрации приблизительно 500 мг/л, приводит к получению линолевой кислоты с сопряженными связями в концентрации более чем 250 мг/л.
Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что новый штамм, принадлежащий к роду Lactobacillus и способный превращать LA в изомеры CLA с высокими выходами превращения, может быть подходящим для его включения в питательные препараты, или в пищевые продукты, или в фармацевтические композиции.
Новый штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 может быть включен к композиции, которые также содержат другие бактериальные штаммы, принадлежащие к одному и тому же роду или к другому роду, подобному бифидобактериям.
Композиции, содержащие LMG S-26420 и другие бактериальные штаммы, продуцируют преимущественно гетерогенную популяцию пробиотиков, подходящую для поддержания баланса бактериальной флоры в кишечнике.
Бактериальные культуры, которые являются целью настоящего изобретения, были продуцированы сначала в лабораторном, а затем в промышленной масштабе. Бактериальная культура LMG S-26420 была получена ферментативным способом в течение периода времени от 6 до 12 ч при температуре от 30 до 40°С в среде, обозначаемой MRS® (De Man, Rogosa & Sharpe) и содержащей в качестве главных ингредиентов дрожжевой экстракт, смеси пептонов и глюкозы, а также соли калия, аммония, магния и марганца.
Было проведено множество фаз размножения первичных культур для увеличения числа клеток на объем культуры чистого штамма с получением так называемых маточных культур, которые были использованы в качестве инокулята для промышленного продуцирования бактериальных культур пробиотического LMG S-26420.
Промышленный способ продуцирования Lactobacillus paracasei LMG S-26420 включает следующие стадии:
инокуляция штамма LMG S-26420 маточными культурами в процентах по объему от 0,1 до 10% и сбраживание в адекватной культуральной среде при 37°С и рН 4,5-7,5 в течение 8-15 ч;
отделение бактериальной биомассы от культурального бульона путем центрифугирования.
Биомасса может быть заморожена или подвергнута лиофилизации после добавления подходящих криозащитных агентов, выбранных из подходящих углеводов, которые могут быть использованы для поддержания жизнеспособности клеток в процессе лиофилизации.
Штамм LMG S-26420 получают ферментативными способами, характеризующимися продуцированием жизнеспособных клеток в количестве более чем 109 жизнеспособных клеток на миллилитр культуры и биомассы лактобацилл более чем 4 г/л культуры.
Штамм LMG S-26420 получают с продуктивностью от 1х1010 до 7х1010 жизнеспособных клеток на миллилитр культуры и с выходом осушенного продукта от 10 до 20 г/л.
Жизнеспособность клеток определяют методами подсчета бактерий, известными специалистам.
Штамм LMG S-26420, полученный из описанных культур, может быть лиофилизован для его надежного хранения и добавления в пищу, в продукты питания или в фармацевтические препараты.
Способ лиофилизации проводят в присутствии криозащитных агентов, выбранных их растворимых углеводов, таких как, например, трегалоза и циклодекстрины или их смесь. Описанный способ лиофилизации характеризуется получением лиофильного штамма LMG S-26420 с выходом жизнеспособных клеток более чем 50% по сравнению с выходом клеток до лиофилизации. Штамм LMG S-26420 характеризуется тем, что он содержит жизнеспособные клетки в количестве приблизительно более чем 1х 1010 на грамм лиофильного продукта, а в частности приблизительно от 1х 1010 до 7х1010 на грамм лиофильного продукта. Это подтверждает, что штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 характеризуется высокой продуктивностью, может быть лиофилизован и может храниться как лиофильный продукт с клетками, сохраняющими подтвержденную жизнеспособность.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, полученный с использованием описанных клеточных культур и лиофилизованный в присутствии криозащитных агентов, выбранных из растворимых углеводов или их смесей, характеризуется активностью в воде (aw) ниже 0,6, то есть величиной, ниже которой происходит ингибирование пролиферации большинства бактерий и мучнистой росы. Активность в воде представляет собой величину, полученную путем измерения парциального давления пара в веществе, деленного на парциальное давление воды, и определяемую с помощью детекторов для непосредственного измерения этих величин.
Как описано Ryser, E.T. et al., Listeria, Listeriosis and Food Safety (3rd ed.). CRC Press. 173-174,
- 5 037388 (2007), величины активности в воде ниже 0,6 указывают на то, что лиофильный препарат может храниться в течение определенного периода времени, поскольку он не разлагается из-за пролиферации микробов, которая является одной из самых главных причин порчи пищи или пищевых продуктов.
Лиофильные продукты штамма LMG S-26420s характеризуются повышенным числом жизнеспособных клеток на грамм лиофильного продукта и низким уровнем активности в воде, и эти продукты могут храниться в виде препаратов композиций или препаратов в различных формах, содержащих различные количества пробиотиков без каких-либо ограничений.
Бактериальный штамм LMG S-26420 в растворах, подвергаемый лиофилизации, характеризуется тем, что он имеет величины температур перехода в стекловидное состояние Tg более чем 100°С, а в присутствии растворимых углеводов, таких как, например, трегалоза, температуры перехода в стекловидное состояние составляют от 100 до 120°С. Эти величины подтвердили, что данный штамм может быть подвергнут лиофилизации и вакуумной сушке при температурах до 100°С без превращения продукта в стекловидное состояние и без последующей потери его свойств.
Температура перехода замороженных растворов в стекловидное состояние Tg' для лиофилизуемых препаратов составляет от -15 до -30°С, а в присутствии растворимых углеводов, таких как, например, трегалоза, температуры перехода в стекловидное состояние составляют в пределах от -20 до -30°С.
Способ лиофилизации штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420, описанный в примере 3, в присутствии криозащитных агентов, выбранных из растворимых углеводов, а в частности трегалозы, характеризуется проведением стадии замораживания при температуре ниже -30°С, с последующей сушкой при температуре ниже 100°С. Такой способ позволяет получить штамм LMG S-26420 в лиофильной форме, характеризующейся сохранением своих биологических свойств.
В частности, способ лиофилизации штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420, описанный в настоящем изобретении, в присутствии трегалозы обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток более чем на 30%, а в частности от 30 до 60%, по сравнению с жизнеспособностью клеток до лиофилизации.
Описанные лиофильные композиции штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 содержат растворимые углеводы, такие как трегалоза и маннит; и такие углеводы могут быть добавлены в содержащие трегалозу лиофильные препараты, если требуется высокая лиофильная масса, а в частности при полученнии препаратов с низкой дозой пробиотического штамма.
Растворы, содержащие лиофилизованный штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут включать осмолиты, выбранные из группы, состоящей из бетаина, саркозина, глицерина, эритрита; соли, выбранные из группы, состоящей из ацетатов, формиатов или солей аммония, и эти растворы могут быть использованы для поддержания рН от 4 до 8 в процессе лиофилизации.
Лиофильный штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 является стабильным при температуре 4°С в течение более чем 3 месяцев. В конкретном аспекте Lactobacillus paracasei LMG S-26420 сохраняет свою клеточную жизнеспособность более, чем 70% в течение 6 месяцев при температуре 4°С, а его активность в воде составляет ниже 0,6%.
Следовательно, лиофильный продукт может быть приготовлен в большом количестве и может храниться в виде препарата композиций в твердой или суспендированной форме в различных дозах пробиотика.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, к питательным препаратам или к пищевым продуктам, содержащим различные количества штамма LMG S-26420 в лиофильной форме в пределах от 20 до 2500 мг. Эти композиции характеризуются тем, что они содержат живые клетки LMG S-26420 в количестве от 1х 109 до 1 χ 1011 на грамм лиофильного продукта.
Препараты могут быть приготовлены в форме, подходящей для перорального введения, например в форме саше, таблеток, капсул или жидких суспензий.
Композиции в форме таблеток или капсул могут содержать штамм Lactobacillus paracasei LMG S26420 в количестве от 20 до 800 мг, а композиции в форме саше для жидкой суспензии могут содержать штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в количестве от 20 мг до 10 г. Фармацевтические или питательные композиции могут содержать Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в количестве приблизительно от 1x109 до 1х1011 единиц клеток.
Фармацевтические, питательные или пищевые композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут, но необязательно, включать среди прочих пребиотики, выбранные из группы, состоящей из фрукто-олигосахаридов, инулинов, галакто-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, изомальто-олигосахаридов, резистентного декстрина, полидекстрозы, арабиногалактанов, резистентного крахмала, декстранов, гуаровой камеди; аминокислот; белков; антиоксидантов; витаминов, выбранных из группы, включающей витамины комплексов Е и В, вместе с фармацевтически приемлемыми солями, используемыми для приготовления нужной формы.
Фармацевтические, питательные или пищевые композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут также включать и другие бактерии, способные превращать LA в CLA, а в частности бактерии, принадлежищие к роду Bifidobacterium. Эти композиции способствуют увеличению степени превращения LA в CLA и обеспечивают баланс бактериальной флоры кишечника.
- 6 037388
Композиции в форме саше получают путем смешивания штамма Lactobacillus paracasei LMG S26420 в виде лиофильных продуктов с выбранными наполнителями, такими как, например, олигосахариды, выбранные из группы, состоящей из фрукто-олигосахаридов, инулинов, галакто-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, изомальто-олигосахаридов, и отдушек, которые были предварительно просеяны.
Затем гомогенную смесь распределяют по саше.
Лиофильная форма может быть подвергнута измельчению или гранулированию, а затем добавлена к фармацевтическим наполнителям, выбранным для приготовления нужных твердых форм.
Композиции в форме таблеток могут содержать разбавители, лиганды, дезинтеграторы, лубриканты и агенты, уменьшающие скольжение, и такие композиции получают методами, известными специалистам.
Композиции могут содержать, но необязательно, консерванты, антиоксиданты, забуферивающие агенты, красители, ароматизаторы и подсластители.
Композиции согласно изобретению, содержащие штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, являются стабильными при температуре 4 и 25°С в течение 1, 3 и 6 месяцев с полным восстановлением живых клеток.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению фармацевтических, питательных или пищевых композиций, содержащих штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 для лечения и профилактики патологий и/или физиологических состояний, при которых пробиотик дает благоприятный эффект. Эти композиции могут быть использованы для профилактики и лечения патологий и/или физиологических состояний, ассоциированных с дефицитом CLA, например воспалительных заболеваний кишечника, диареи и воспаления толстой кишки; для увеличения массы тела; для повышения термогенеза; для защиты от окислительного стресса; для предупреждения образования опухолей; и для лечения и профилактики аутоиммунных заболеваний, диабета и атеросклероза.
Композиции, содержащие штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть использованы для лечения и профилактики всех расстройств или патологий, ассоциированных с микробным дисбалансом.
Композиции, содержащие штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, могут быть также использованы в качестве пищевой добавки во все диетические блюда, не содержащие мясных или молочных продуктов, для достижения концентраций CLA, полезных для человека.
Примеры
В примерах описан штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420, точно соответствующий штамму, депонированному в Бельгийской Объединенной коллекции микроорганизмов ВССМ/бактерий LMG, Микробиологической лаборатории Университета Гента, где была подтверждена чистота и жизнеспособность штамма, зарегистрированного под номером LMG S-26420. В частности, в примерах приводится характеризация штамма LMG S-26420 и описание его способности превращать LA в CLA; способа его продуцирования в промышленном масштабе; и композиций, содержащих этот штамм.
Пример 1.
Определение способности штамма превращать линолевую кислоту (LA) в линолевую кислоту с сопряженными связями (CLA).
Для определения способности штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращать LA в CLA были оценены условия, при которых инокулят был получен в присутствии LA для стимуляции предварительно адаптированных бактериальных клеток, и условия в отсутствии LA.
а) Определение методом Ogawa.
Количественное определение способности Lactobacillus paracasei LMG S-26420 превращать LA в CLA проводили методом Ogawa, описанным в Appl. Envr. Microbiol. 2001, 67, 1246.
Этот метод основан на использовании инокулята штамма в культуральной среде MRS® (Man, Rogosa, Sharpe), содержащей смесь пептонов, 18 г/л; дрожжевого экстракта, 4 г/л; глюкозы, 20 г/л; твина80, 1 мл/л; фосфата калия, 2 г/л; трицитрата аммония, 2 г/л; безводного ацетата натрия, 3 г/л; гептагидрата-сульфата магния, 0,2 г/л; безводного сульфата магния, 0,034 г/л; агара 12 г/л.
Штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в концентрации 1% инокулировали в 15 мл MRS® с LA в концентрации от 0,01 до 0,4 мг/мл, и растворы выдерживали при температуре 37°С в течение 3 дней при легком перемешивании. Культуры центрифугировали и супернатант удаляли. Осадок промывали стерильной водой, и клеточную массу приблизительно в 20 мг ресуспендировали с 1 мл раствора фосфатно-калиевого буфера, 100 мМ при рН 6,5, после чего к клеточной суспензии добавляли 5 мг LA в комплексе с бычьим альбумином (BSA) в отношении, соответствующем 0,2 мг BSA/мг LA. После этого культуры инкубировали в течение 48 и 72 ч, а затем центрифугировали для удаления супернатанта. Клетки ресуспендировали в воде и определяли концентрацию CLA спектрофотометрическим методом Баретта, описанным в Appl. Environment Microbiol. 73(7), 2333, (2007). Этот метод включает экстракцию фракции жирной кислоты путем добавления 2 мл изопропанола к 1 мл образца. Растворы интенсивно перемешивали, оставляли на 3 мин, а затем добавляли 1,5 мл гексана. Органические фазы отделяли и дегидратировали безводным сульфатом натрия, а затем определяли количество CLA путем спектрофото- 7 037388 метрического считывания на 233 нм. Концентрации определяли по калибровочной кривой, построенной по различным концентрациям изомера CLA c9-t11, на одной и той же длине волны.
В табл. 1 указаны проценты превращения LA с CLA штаммом Lactobacillus paracasei LMG S-26420, где предварительное инкубирование штамма осуществляли при различных концентрациях LA, а инкубирование промытых клеток осуществляли с использованием 5 мг/мл LA. В табл. 1 показано, что в данных условиях процент превращения LA в CLA составляет от 1 до 7%.
Таблица 1
| Концентраци я LA (мг/мл) | Время инкубирования клеток (ч) | Температура инкубирования клеток (°C) | Концентрация CLA (мг/мл) | Процент (%) превращения LA в CLA |
| 0, 01 | 48 | 30 | 0, 083 | 2 |
| 0, 05 | 48 | 30 | 0, 075 | 2 |
| 0, 1 | 48 | 30 | 0, 067 | 1 |
| 0,2 | 48 | 30 | 0, 041 | 1 |
| 0,3 | 48 | 30 | 0, 045 | 1 |
| 0,4 | 48 | 30 | 0, 104 | 2 |
| 0, 01 | 72 | 37 | 0,204 | 4 |
| 0, 05 | 72 | 37 | 0,273 | 5 |
| 0, 1 | 72 | 37 | 0, 097 | 2 |
| 0,2 | 72 | 37 | 0,349 | 7 |
| 0,3 | 72 | 37 | 0,282 | 6 |
| 0,4 | 72 | 37 | 0, 085 | 6 |
В условиях, указанных в табл. 2, CLA не присутствовала в супернатанте.
В табл. 2 представлены результаты превращения LA в CLA. Предварительное инкубирование осуществляли с LA в концентрации 0,05 мг/мл, и промытую клеточную массу инкубировали при различных концентрациях LA. Затем определяли присутствие CLA в супернатанте и в клеточном осадке.
- 8 037388
Таблица 2
| Конце нтрац ия LA (мг/м л) | Время инкубирования клеток (ч) | Температура инкубирования клеток (°C) | Образец | Концентрац ия CLA (мг/мл) | Процент (%) превращени я LA в CLA |
| 0,05 | 72 | 37 | Клетки | - | - |
| 0,05 | 72 | 37 | Супернат ант | 0,013 | 25 |
| 0,1 | 72 | 37 | Клетки | - | |
| 0,1 | 72 | 37 | Супернат ант | 0,004 | 4 |
| 0,2 | 72 | 37 | Клетки | - | |
| 0,2 | 72 | 37 | Супернат ант | - | - |
| 0,3 | 72 | 37 | Клетки | - | - |
| 0,3 | 72 | 37 | Супернат ант | - | - |
| 0,4 | 72 | 37 | Клетки | 0,007 | 2 |
| 0,4 | 72 | 37 | Supernat f | 0,005 | 1 |
| 0,5 | 72 | 37 | Клетки | 0,007 | 1 |
| 0,5 | 72 | 37 | Supernat f | 0.003 | 1 |
| 1 | 72 | 37 | Клетки | 0,025 | 3 |
| 1 | 72 | 37 | Supernat | - | - |
| f | |||||
| 2 | 72 | 37 | Клетки | 0,042 | 2 |
| 2 | 72 | 37 | Супернат ант | 0,011 | 1 |
| 3 | 72 | 37 | Клетки | 0,059 | 2 |
| 3 | 72 | 37 | Супернат ант | 0,017 | 1 |
| 4 | 72 | 37 | Клетки | 0,077 | 2 |
| 4 | 72 | 37 | Супернат ант | 0,0043 | 1 |
b) Определение методом Liu
Метод Liu был описан в Biomed. Biotechnol. 12811, 923 (2011).
В табл. 3 представлены данные, относящиеся к превращению LA в CLA штаммом Lactobacillus paracasei LMG S-26420 и полученные методом, описанным Liu P. и др. Biomed. Biotech. 12811, 923, 2011.
Этот метод основан на определении количества CLA в супернатанте культур в среде MRS®, содержащей LA в различных концентрациях от 0,05 до 0,5 мг/мл. Культуры инкубировали в течение 24 и 96 ч и при температуре 30 и 37°С. Количество CLA, полученной путем превращения из LA, определяли методом Баретта, описанным в примере 1.а).
- 9 037388
Таблица 3
| Концентрация LA (мг / мл) | Время инкубировани я клеток (часы) | Температура инкубировани я клеток (°C) | Концентрация CLA (мг/мл) | Процент (%) превращения LA в CLA |
| 0, 00 | 24 | 30 | 0, 001 | - |
| 0, 05 | 24 | 30 | 0, 005 | 9 |
| 0, 1 | 24 | 30 | 0, 005 | 5 |
| 0,2 | 24 | 30 | 0, 005 | 2 |
| 0,3 | 24 | 30 | 0, 006 | 2 |
| 0,4 | 24 | 30 | 0, 006 | 2 |
| 0,5 | 24 | 30 | 0, 006 | 1 |
| 0, 00 | 96 | 30 | 0, 001 | - |
| 0, 05 | 96 | 30 | 0, 006 | 12 |
| 0, 1 | 96 | 30 | 0, 005 | 5 |
| 0,2 | 96 | 30 | 0, 005 | 3 |
| 0,3 | 96 | 30 | 0, 006 | 2 |
| 0,4 | 96 | 30 | 0, 006 | 1 |
| 0,5 | 96 | 30 | 0, 006 | 1 |
| 0, 00 | 24 | 37 | 0, 001 | - |
| 0, 05 | 24 | 37 | 0, 004 | 8 |
| 0, 1 | 24 | 37 | 0, 005 | 5 |
| 0,2 | 24 | 37 | 0, 005 | 2 |
| 0,3 | 24 | 37 | 0, 005 | 2 |
| 0,4 | 24 | 37 | 0, 006 | 1 |
| 0,5 | 24 | 37 | 0, 006 | 1 |
| 0, 00 | 96 | 37 | 0, 001 | - |
| 0, 05 | 96 | 37 | 0, 005 | 10 |
| 0, 1 | 96 | 37 | 0, 006 | 6 |
| 0,2 | 96 | 37 | 0, 006 | 3 |
| 0,3 | 96 | 37 | 0, 007 | 2 |
| 0,4 | 96 | 37 | 0, 006 | 2 |
| 0,5 | 96 | 37 | 0, 008 | 2 |
с) Определение хроматографическим методом (ЖХВД).
Хроматографический метод позволяет определить присутствие геометрических изомеров CLA, изомера c9-t11, изомера транс10-цис12 и изомера транс9-транс11 в клеточных суспензиях и в супернатантах культур методом, описанным в а) и b) и в табл. 2 и 3.
Образцы метилировали как описано Kramer J. и др. в Am. J. Clin. 7 9, 1137 S 2004, и полученные метиловые сложные эфиры разделяли с помощью хроматографии высокого давления на ионах серебра (ЖХВД). Изомеры CLA разделяли на трех последовательно соединенных колонках CHromSpher Lipid размером 4,6 ммх250 мм с частицами размером 5 мкм. Изомеры элюировали раствором гексанаацетонитрила:99-1 и последовательно детектировали на диодно-матричном детекторе и УФ-детекторе на 234 нм. Количественную оценку осуществляли с использованием растворов с известными концентра- 10 037388 циями изомеров CLA.
В табл. 4а проиллюстрировано определение изомеров CLA в образцах осадка, полученных после предварительного инкубирования культур с LA в концентрации 0,05 мг/мл и инкубирования промытых клеток при различных концентрациях LA при 37°С и времени инкубирования 72 ч, как описано в (а), методом Ogawa.
Таблица 4а
| Концентра ция LA (мг/мл) | Изомер CLA t9- tll (мкг/г) | Изомер CLA cl0-tl2 (мкг/г) | Изомер CLA с9- tll (мкг/г) | Изомеры (t9-tll и c9-tllT (%) | Общий процент превращения (%) |
| 0,05 | 1,39 | 2,75 | 2,07 | 3,46 | 14,8 |
| 0,01 | 1,56 | 3,50 | 3,07 | 4,63 | 0,2 |
| 0,4 | 1,21 | 2,78 | 2,40 | 3,61 | 0,2 |
* изомеры с биологической активностью
В табл. 4b представлена концентрация изомеров CLA в образцах супернатантов культур, инкубированных с LA в различных концентрациях, как описано в (b), методом Liu.
Таблица 4b
| Концент рация LA (мг/мл) | Изомер CLA t9-tll (мкг/г ) | Изомер CLA сЮ- tl2 (мкг/г) | Изомер c9-tll (мкг/г) | Изомер CLA (t9-tll и c9-tll)* (мкг/г) | Изомеры (t9-tll и c9-tll)* (%) | Общий процент превраще НИЯ (%) |
| 0,05 (24 ч) | 1,81 | 5,07 | 3,30 | 44,16 | 46,76 | 25,9 |
| 0,05 (96 ч) | 2,45 | 6, 33 | 5,06 | 42,26 | 46, 67 | 35,5 |
| 0,2 (96 ч) | 1,74 | 5,64 | 5,04 | 46, 15 | 46, 15 | 7,3 |
| 0,5 (96 ч) | 1,95 | 5,80 | 5,22 | 7,17 | 44,67 | 3,2 |
*изомеры с биологической активностью
Пример 2
Способ ферментации для получения штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420.
Ферментацию осуществляли в ферментере Сарториуса. Инокулят штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в концентрации 1%, соответствующей 40 мл, культивировали в 4 л среды MRS® при температуре 37°С в течение 8 ч.
Клеточную массу, полученную различными способами ферментации, концентрировали путем центрифугирования и промывали стерильной водой. Оптическую плотность водной суспензии клеточной массы определяли спектрофотометрическим методом на 625 нм и определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ) путем подсчета числа клеток на планшете в десятичных цифрах.
Некоторые препараты получали с использованием различных параметров ферментации для определения наилучших условий для роста бактериального штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420.
В табл. 5 указаны параметры, относящиеся к ферментации при различных величинах давления диоксида углерода, скорости перемешивания и рН. В табл. 5 также представлены результаты, полученные путем измерения оптической плотности и числа КОЕ в биомассе через 8 ч после окончания ферментации.
- 11 037388
Таблица 5
| Параметры ферментации | Препарат 1 | Препара т 2 | Препара т 3 | Препарат 4 | Препара т 5 | Препара т 6 |
| Культуральная среда | MRS® | MRS® | MRS® | MRS® | MRS® | MRS®+Tp егалоза 1% |
| pH | П.С. | П.С. | П.С. | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| Р-СО2 (бар) | 0,8 бар -3 0 мин. | 0,8 бар -ЗОмин. | 1 бар бОмин. | 1 бар бОмин. | П.С. | 0.8 бар -45мин. |
| Скорость перемешивания (об/мин) | 100 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| Масса биомассы (г) | 40 | 40 | 32 | 35 | 47 | 62 |
| OD 625 нм - ТО | 3,50 | 0,075 | 0,041 | 0,045 | 0,036 | 0,04 |
| OD 625 нм - 8 часов. | 0,087 | 1,78 | 1,406 | 1,63 | 1,553 | 1,50 |
| КОЕ /мл - ТО | 3,5 0Е+0 6 | 2,50Е+0 7 | 6,30Е+0 7 | 3,30Е+07 | 3,00Е+0 7 | 1,75Е+0 7 |
| КОЕ /мл -8 часов | 2,30Е+09 | 1,10Е+0 9 | 1,90Е+0 9 | 2,20Е+09 | 2,60Е+0 9 | 1,05Е+0 9 |
п.с: не корректировали
Число КОЕ Lactobacillus paracasei LMG S-26420 по окончании культивирования составляло от 1,9x109 до 2,6x109 на миллилитр культуры, а количество полученной биомассы составляло от 8 до 16 г/л культуры.
Измерение КОЕ осуществляли на чашках Петри путем высевания клеточной массы методом серийного разведения и подсчета колоний микроорганизмов.
Клеточные массы могут храниться при температуре ниже 0°С, либо они могут быть сразу лиофилизованы для их хранения в твердой форме, либо они могут быть сразу использованы для приготовления фармацевтических/питательных препаратов.
Пример 3.
Получение штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в лиофильной форме.
Продукт, полученный из препарата, описанного в примере 2 (препарата 6), лиофилизовали.
Для оценки влияния криозащитного агента на лиофилизацию Lactobacillus paracasei LMG S-26420, способы лиофилизации проводили в присутствии циклодекстринов, трегалозы и маннита.
Клеточный осадок суспендировали в воде и добавляли циклодекстрины в количестве 10% (давление/объем).
Раствор разделяли на три части:
раствор А: циклодекстрины 10% (мас./об.);
раствор В: циклодекстрины 10% (мас./об.)+трегалоза 20% (мас./об.);
раствор С: циклодекстрины 10% (мас./об.)+маннит 15% (мас./об.).
В табл. 6 указаны параметры лиофилизации для раствора А и В.
Таблица 6
| Стадии способа лиофилизации (I) | Параметры | ||
| Замораживание | -50°С, | v=2°C/мин, | -50°С х 120 мин |
| Первая сушка | -50°С Р=100 | х 15 мин, мТорр | -30°С, v=0,3°C/mmh, -30°С х 300 мин, |
| Вторая сушка | 30°С, | v=0,16°С/мин | , 30°С х 480 мин, Р=100 мТорр |
| Общее время | 14 часов |
В табл. 7 указаны параметры лиофилизации для растворов С.
- 12 037388
Таблица 7
| Стадии способа лиофилизации (I) | Параметры |
| Замораживание | -60°С х 120 мин |
| Отжиг | —10°С, v=0,55°C/mhh — 10°С х 240 мин -50°С х 120 мин |
| Первая сушка | -18°С, v=0,16°C/mhh -18°С х 600 мин Р=120 мТорр |
| Вторая сушка | 25°С, v=0,07°C/mhh Р=50 мТорр |
Полученный лиофильныи штамм Lactobacillus paracasei LMG S-26420 хранили в бутылях или в саше при 4°С.
Пример 4.
Определение температуры перехода в стекловидное состояние Tg, T'g.
Температуры перехода в стекловидное состояние Tg и T'g растворов А и В до лиофилизации определяли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии на ДСК-устройстве Даймонда путем проведения циклов замораживания/нагревания как показано в табл. 8.
Таблица 8
| Стадия | Температура 1 (°C) | Температура 2 (°C) | Скорость (°С/мин) |
| 1 | 25 | -60 | 10 |
| 2 | -60 | 25 | 40 |
| 3 | 25 | 100 | 10 |
| 4 | 100 | -50 | 50 |
| 5 | -50 | 170 | 40 |
Цикл, указанный в табл. 9 проводили для растворов С.
Таблица 9
| Стадия | Температура 1 (°C) | Температура 2 (°C) | Скорость (°С/мин) |
| 1 | 25 | -60 | 10 |
| 2 | -60 | -10 | 40 |
| 3 | -10 | -10 | Постоянная в течение 120 минут |
| 4 | -10 | -60 | 40 |
| 5 | -60 | 25 | 40 |
Величины температур перехода в стекловидное состояние Tg для растворов и замороженных водных растворов, и T'g для растворов А, В и С, подвергаемых лиофилизации, указаны в табл. 10.
- 13 037388
Таблица 10
| Лиофилизация LMG S-26420 | Препарат | Т'д (°C) | Тд (°C) |
| Растворы А=циклодекстрины 10% (давление/объем) | А-1 | -12,25 | 148,55 |
| А-2 | -12,75 | 140,81 | |
| А-3 | -13,05 | 144,44 | |
| В=циклодекстрины 10% (давление/объем) + трегалоза 20% (давление/объем) | В-1 | -26,50 | 112,00 |
| В-2 | -26,63 | 114,64 | |
| В-3 | -26,54 | 117,54 | |
| В-4 | -26,75 | 112,45 | |
| В-5 | -26,54 | 114,40 | |
| В-6 | -30,58 | 111,93 | |
| В-7 | -34,76 | 116,629 | |
| В-8 | -27,96 | 111,77 | |
| В-9 | -27,50 | 118,40 | |
| С=циклодекстрины 10% (давление/объем) + маннит 15% | С-1 | Т'д1: -36,8 Т'д2: - 28 Т'д3: -14,8 | н. о. |
| С-2 | -28,4 | 106,00 |
Пример 5.
Характеризация лиофильного штамма Lactobacillus paracasei IMG S-26420.
а) Определение жизнеспособности штамма
Для определения выхода и жизнеспособности штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 после лиофилизации растворов А, В и С, полученных как описано в примере 3, вычисляли КОЕ штамма до и после лиофилизации путем подсчета числа микроорганизмов на чашке Петри. Эту процедуру подсчета осуществляли с использованием лиофильного продукта, соответствующего количеству 0,5 г, который был суспендирован в 49,5 г буфера для разведения (MRS®) и подвергнут серийному разведению до уровня, подходящего для такого подсчета. Затем разведенный продукт осаждали на чашке Петри, содержащей 20 мл агаровой среды MRS®, предварительно стерилизованной в автоклаве и инкубированной при 37°С в течение 72 ч в анаэробных условиях.
Оценку проводили для множества лиофильных препаратов, полученных из растворов А, В и С, и результаты представлены в табл. 11.
- 14 037388
Таблица 11
| Лиофилизация LMG S-26420 | Препара т | До лиофилизации КОЕ/мл ± ср. кв.откл. | После лиофилизации (То) КОЕ/г ± ср. кв.откл. | Процент выхода (%) после лиофилизации |
| Раствор А=циклодекстрин ы 10% (масс./об.) | А-1 | 4,6 ± 0,6х1ОВ * 10 | 5,6 ± 0,4х1О10 | 13,9 ±0,9 |
| А-2 | 4,0 ± 0,5х1010 | 3,4 ± 0,2х1010 | 16,6 ± 1,1 | |
| А-3 | 2,8 ± 0,5х1О10 | 3,3 ± О,5х1О10 | 15,8± 2,9 | |
| В=циклодекстрин ы 10% (масс./об.) +трегалоза 20% (масс./об.) | В-1 | 3,2 ± О,5х1О10 | 2,9 ± 0,7х1О10 | 26,2 ± 6,5 |
| В-2 | 4,4 ± 0,1хЮ10 | 3,3 ± О,Зх1О10 | 22,8 ± 1,9 | |
| В-3 | 3,3 ± 0,1х1010 | 6,3 ± 0,Зх1010 | 57 ± 27,0 | |
| В-4 | 2,2 ± 0,8х1О10 | 3,9 ± 0, ЗхЮ10 | 45,1 ± 2,7 | |
| В-5 | 2,8 ± О,2х1О10 | 4,6 ± 0,9х1О10 | 41,7 ± 7,5 | |
| В-6 | 3,6 ± 0,1х1010 | 3,7 ± 0,5х1010 | 23,3 ± 2,9 | |
| В-7 | 3,1 ± 0,9х1О10 | 2,9 ± 0,8х1О10 | 21,9 ±6,0 | |
| В-8 | 5,5 ± О,7х1О10 | 1,4 ± 0,8х1О10 | 35,8 ±1,4 | |
| В-9 | 4,3 ± 0,9х1010 | 3,7 ± 0,8х1010 | 22,6 ± 2,1 | |
| С=циклодекстрин ы 10% (давление/объем )+маннит 15% | С-1 | 7,3 ± 2, хЮ10 | <1хЮ10 | 13,9 ±0,9 |
| С-2 | 3,6 ± 0,5х1О10 | 2,3 ± 0,8х1О10 | 9,56 ± 4,0 |
В табл. 11 подтвержден эффект трегалозы в процессе лиофилизации, дающей более, чем 30% выход КОЕ.
Маннит может быть добавлен к трегалозе, если желательно получить большую лиофильную массу, а в частности, небольшие дозы Lactobacillus paracasei LMG S-26420.
Пример 6.
Определение активности в воде и потери массы путем сушки лиофильного Lactobacillus paracasei LMG S-26420.
а) Определение активности в воде (aw).
Определение активности в воде соответствует определению наличия свободной воды в лиофильных препаратах Lactobacillus paracasei LMG S-26420 для растворов А, В и С, полученных в примере 3. Такое определение осуществляли путем помещения образца приблизительно в 1 г каждого лиофильного продукта в устройство Aqualab VSA Decagon, которое позволяет измерять активность образца в воде на диэлектрическом детекторе влажности и непосредственно получить величину, прямо пропорциональную молям воды на моли всего образца, и полученные величины представлены в табл. 12.
- 15 037388
Таблица 12
| Компоненты лиофилизации LMG S-26420 | Препарат No. | aw (активность в воде) |
| Раствор А=циклодекстрины 10% (масс./об.) | А-1 | н. о. |
| А-2 | н. о. | |
| А-3 | 0,358 | |
| В=циклодекстрины 10% (масс./об.)+трегалоза 20% (масс./об.) | В-1 | н. о. |
| В-2 | н. о. | |
| В-3 | 0,363 | |
| В-4 | 0, 153 | |
| В-5 | 0, 100 | |
| В-6 | 0, 120 | |
| В-7 | 0, 136 | |
| В-8 | 0,166 | |
| В-9 | 0, 087 | |
| Раствор С=циклодекстрины 10% (масс./об.)+маннит 15% (масс./об.) | С-1 | 0, 174 |
| С-2 | 0, 134 |
Все полученные лиофильные продукты имеют величины aw ниже 0,6, что подтверждает то, что эти продукты могут храниться в течение длительного периода времени без риска их разложения.
b) Определение потери содержания воды (LOD).
Содержание влаги в лиофильных образцах вычисляли по термошкале Метлера, и величины представлены в табл. 13.
Таблица 13
| Компоненты лиофилизации LMG S-26420 | Препарат No. | Процент влажности LOD (%) |
| Раствор А=циклодекстрины 10% (масс./об.) | А-1 | 3,61 |
| А-2 | 2,58 | |
| А-3 | 3,9 | |
| В=циклодекстрины 10% (масс./об.) + трегалоза 20% (масс./об.) | В-1 | 4,01 |
| В-2 | 4,24 | |
| В-3 | 4,90 | |
| В-4 | 3,39 | |
| В-5 | 2,94 | |
| В-6 | 2,85 | |
| В-7 | 3,05 | |
| В-8 | 3,21 | |
| В-9 | 2,41 | |
| Раствор С=циклодекстрины 10% (масс./об.)+маннит 15% (масс./об.) | С-1 | 2,14 |
- 16 037388
Пример 7.
Определение стабильности лиофильных препаратов штамма Lactobacillus paracasei IMG S-26420.
Лиофильные препараты штамма Lactobacillus paracasei LMG S-26420 хранили при 4°С и определяли их стабильность путем вычисления уровня бактерий и активности в воде (aw) (Т0) на время 0 и через 3 и месяцев. Полученные результаты представлены в табл. 14.
Таблица 14
| Препарат | КОЕ/г ± ср. кв.откл. | Выход КОЕ % Т6/Т0 | aw (активное ть в воде) ТО | а„ ( активност ь в воде) Тб | ||
| ТО | ТЗ | Тб | ||||
| А-1 | 3,4±0,2 хЮ10 | 1,3±0,2х1 О10 | 9,8±5,7x1 О4 | <10% | ||
| А-2 | 3,5±0,6х Ю10 | 6,4±1,5x1 ОВ 9 | <1,78х102 | <10% | ||
| А-3 | 2,9±0,7х Ю10 | 7,1±2,5x1 О9 | — | |||
| В-1 | 2,9±0,7х 1010 | 7,1±2,5x1 О9 | ||||
| В-2 | 3,3±0,3 хЮ10 | 1,2±0,1x1 О10 | 0,153 | 0,276 | ||
| В-3 | 6,3±0,2 хЮ10 | 1,9±0,2х1 О10 | 1,8±0,1x1 О10 | 27,7±1,0 | 0,100 | 0,163 |
| В-4 | 3,9±0,2х Ю10 | 2,3±0,6x1 О10 | 2,9±0,7x1 О10 | 75,0±19,2 | 0,120 | 0,313 |
| В-5 | 4,6±0,9х Ю10 | 4,9±0,4x1 О10 | 0,136 | 0,279 | ||
| В-6 | 3,7±0,5х Ю10 | 4,2±0,3 хЮ10 | 5,0±0,6x1 О10 | 136,2±14,8 | 0,143 | 0,182 |
| В-7 | 2,9±0,8х Ю10 | 1,9±0,3x1 О10 | 2,6±2,1x1 О10 | 91,1±17,9 | 0,087 |
В таблице показано, что лиофильные продукты, полученные в присутствии трегалозы, являются стабильными при 4°С в течение 6 месяцев и что их активность в воде (aw) всегда ниже 0,6.
Пример 8.
Композиции в саше, содержащие Lactobacillus paracasei IMG S-26420.
Препараты в саше содержат лиофильный продукт, полученный как описано в примере 2 (препараты В) в количестве 800 и 500 мг, соответствующем приблизительно 3х1010 и 2х1010 живых клеток Lactobacillus paracasei LMG S-26420.
Лиофильный продукт смешивали с наполнителями, которые были предварительно просеяны, и гомогенную смесь распределяли по саше. Комбинированные композиции представлены в табл. 15.
Одна из описанных композиций содержит инулин, другая содержит ксило-олигосахарид, а остальные содержат смесь фрукто-олигосахаридов, образовнных цепью молекул фруктозы, связанных с молекулой глюкозы (Actilight 950P).
- 17 037388
Таблица 15
| Компонент | Масса композиции 1 (мг) | Масса композиции 2 (мг) | Масса композиции 3 (мг) | Масса композиции 4 (мг) |
| Лиофильный Lactobacillus paracasei LMG S- 26420 | 800 | 800 | 500 | 500 |
| Инулин | 3200 | |||
| Ксило-олигосахарид | 3200 | 506 | 506 | |
| Отдушка (маракуйя) | 44 | 44 | ||
| Двуокись кремния | 10 | 10 | ||
| Астаксантин | 160 | |||
| Actilight 950Р | 2940 | 1720 | ||
| Общая масса | 4000 | 4000 | 4000 | 4000 |
Композиции могут содержать витамины, например витамин Е, витамин В1, витамин В2, витамин В16.
Композиции в саше могут быть суспендированы в водных растворах или в полутвердых пищевых продуктах.
Пример 9.
Композиции, содержащие Lactobacillus paracasei LMG S-26420 в таблетках.
Препараты в таблетках, содержащие лиофильный продукт в количестве 250 мг, соответствующем приблизительно 1x10 живых клеток Lactobacillus paracasei LMG S-26420, получали путем смешивания лиофильного препарата с наполнителями, предварительно просеянными на сите 800 мкм. Затем смесь спрессовывали в прессовальной машине Ронши или на аналогичном устройстве путем сообщения силы сжатия приблизительно 13 кН.
Общий состав таблеток указан в табл. 16.
Таблица 16
| Компоненты | Количество (мг) |
| Lactobacillus paracasei LMG S-26420 | 250 (1хЮ10 КОЕ) |
| Изомальто | 278,0 |
| Кроскармелоза | 9, 9 |
| Тальк | 5, 5 |
| Двуокись кремния | 3, 8 |
| Стеарат магния | 2,8 |
| Общая масса | 550 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (19)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Штамм Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420, способный превращать линолевую кислоту в конъюгированную линолевую кислоту, где выход конъюгированной линолевой кислоты составляет 3050%.
- 2. Штамм Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 по п.1, отличающийся тем, что он превращает линолевую кислоту в изомеры с противораковой активностью конъюгированной линолевой кислоты cis9-trans11 и trans9-trans11, где сумма этих изомеров в процентном соотношении составляет более чем 30% по сравнению с другими изомерами.
- 3. Способ получения бактериальной биомассы штамма Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 по п.1, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:инокуляция штамма Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 в процентах по объему от 0,1 до 10% в подходящую культуральную среду при температуре от 30 до 37°С и при рН от 4,5 до 7,5 и культивирование в течение 6-15 ч;отделение бактериальной массы от культурального бульона путем центрифугирования.
- 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию лиофилизации в присут-- 18 037388 ствии криозащитных агентов, выбранных из растворимых углеводов.
- 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что криозащитный агент представляет собой трегалозу.
- 6. Фармацевтическая композиция, содержащая клетки бактериального штамма Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 в количестве от 1х108 до 5х 1011 КОЕ в комбинации с приемлемыми наполнителями, в форме таблеток, гранул для саше, капсул или жидких суспензий.
- 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что содержит пребиотики, витамины и минеральные соли.
- 8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что пребиотики выбраны из группы, состоящей из фрукто-олигосахаридов, инулинов, галакто-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, изомальто-олигосахаридов и витаминов, выбранных из группы, включающей витамины Е и В.
- 9. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что дополнительно содержит бифидобактерии.
- 10. Фармацевтическая композиция, содержащая бактериальный штамм Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 для лечения и/или профилактики патологий или заболеваний, ассоциированных с дефицитом конъюгированной линолевой кислоты.
- 11. Применение фармацевтической композиции по п.6 для лечения или профилактики воспалительных патологий кишечника.
- 12. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что дополнительно содержит лактобациллы, принадлежащие к различным штаммам, и/или бифидобактерии, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, ассоциированных с бактериальным дисбиозом.
- 13. Пробиотическая композиция, содержащая клетки бактериального штамма Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 в количестве от 1 х 108 до 5х 1011 КОЕ в комбинации с приемлемыми наполнителями, в форме таблеток, гранул для саше, капсул или жидких суспензий.
- 14. Пробиотическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что содержит пребиотики, витамины и минеральные соли.
- 15. Пробиотическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что пребиотики выбраны из группы, состоящей из фрукто-олигосахаридов, инулинов, галакто-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, изомальто-олигосахаридов и витаминов, выбранных из группы, включающей витамины Е и В.
- 16. Пробиотическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что дополнительно содержит бифидобактерии.
- 17. Пробиотическая композиция, содержащая бактериальный штамм Lactobacillus paracasei BCCM LMG S-26420 для профилактики патологий или заболеваний, ассоциированных с дефицитом конъюгированной линолевой кислоты.
- 18. Применение пробиотической композиции по п.17 для профилактики воспалительных патологий кишечника.
- 19. Пробиотическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что дополнительно содержит лактобациллы, принадлежащие к различным штаммам, и/или бифидобактерии, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, ассоциированных с бактериальным дисбиозом.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITUB2015A002376A ITUB20152376A1 (it) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | Lactobacillus paracasei per la produzione di acido linoleico coniugato, preparazioni nutrizionali e farmaceutiche che lo comprendono e loro uso |
| PCT/EP2016/065245 WO2017005584A1 (en) | 2015-07-07 | 2016-06-30 | Lactobacillus paracasei for the production of conjugated linoleic acid, nutritional and pharmaceutical preparations containing it and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201890223A1 EA201890223A1 (ru) | 2018-06-29 |
| EA037388B1 true EA037388B1 (ru) | 2021-03-23 |
Family
ID=54347708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201890223A EA037388B1 (ru) | 2015-07-07 | 2016-06-30 | Штамм lactobacillus paracasei для продуцирования линолевой кислоты с сопряженными связями, питательные и фармацевтические препараты, содержащие этот штамм, и их применение |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20180187274A1 (ru) |
| EP (1) | EP3319620B1 (ru) |
| CN (1) | CN108348559B (ru) |
| EA (1) | EA037388B1 (ru) |
| ES (1) | ES2788636T3 (ru) |
| IT (1) | ITUB20152376A1 (ru) |
| MX (1) | MX2017016283A (ru) |
| PL (1) | PL3319620T3 (ru) |
| PT (1) | PT3319620T (ru) |
| WO (1) | WO2017005584A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7309212B2 (ja) * | 2018-01-05 | 2023-07-18 | ベネド バイオメディカル カンパニー リミテッド | 新規な乳酸菌およびその応用 |
| CN110710690A (zh) * | 2018-07-12 | 2020-01-21 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 快速增殖肠道有益菌的益生元组合物 |
| US20220249583A1 (en) * | 2019-06-07 | 2022-08-11 | Universite De Lille | Novel lactic acid bacteria strain - antibacterial peptides produced by said strain and related pharmaceutical compositions |
| CN110892940A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-03-20 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 副干酪乳杆菌k56在缓解肠道炎症方面的新应用 |
| CN113355374B (zh) * | 2020-11-26 | 2022-11-22 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 副干酪乳杆菌et-22发酵合成b族维生素的方法及应用 |
| CN116195631A (zh) * | 2020-11-26 | 2023-06-02 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 调节睡眠的副干酪乳杆菌et-22及其应用 |
| CN113355375B (zh) * | 2020-11-26 | 2022-11-22 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 副干酪乳杆菌k56发酵合成b族维生素的方法及应用 |
| CN113005051A (zh) * | 2021-01-17 | 2021-06-22 | 贵州大学 | 一种副干酪乳杆菌及其用途 |
| IT202100026282A1 (it) * | 2021-10-13 | 2023-04-13 | Alfasigma Spa | Surnatante fermentato e composizioni postbiotiche utili nella prevenzione e nel trattamento di malattie cardiovascolari |
| CN114159478B (zh) * | 2021-11-22 | 2022-11-15 | 江南大学 | 一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物及其制备方法与应用 |
| CN115851520B (zh) * | 2022-11-09 | 2024-04-19 | 厦门元之道生物科技有限公司 | 一种副干酪乳杆菌及其应用 |
| CN117987330B (zh) * | 2024-04-03 | 2024-07-05 | 潍坊君薇生物科技有限责任公司 | 具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌gf027冻干粉的制备方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074010A1 (en) * | 2005-12-24 | 2007-07-05 | Teagasc Dairy Products Research Centre | Process for the production of trans-10, cis 12 octadecadienoic acid |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2513292B1 (en) | 2009-12-16 | 2017-09-06 | Probiotical S.p.A. | Conjugated linoleic acid-producing strains of probiotic bacteria and use thereof for the preparation of a pharmaceutical composition |
| JP6430930B2 (ja) * | 2012-04-09 | 2018-11-28 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ラクトバチルス・パラカゼイ株を使用した生物防除 |
-
2015
- 2015-07-07 IT ITUB2015A002376A patent/ITUB20152376A1/it unknown
-
2016
- 2016-06-30 PL PL16739045T patent/PL3319620T3/pl unknown
- 2016-06-30 ES ES16739045T patent/ES2788636T3/es active Active
- 2016-06-30 CN CN201680040117.XA patent/CN108348559B/zh active Active
- 2016-06-30 WO PCT/EP2016/065245 patent/WO2017005584A1/en active Application Filing
- 2016-06-30 EA EA201890223A patent/EA037388B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2016-06-30 US US15/738,889 patent/US20180187274A1/en not_active Abandoned
- 2016-06-30 MX MX2017016283A patent/MX2017016283A/es unknown
- 2016-06-30 PT PT167390459T patent/PT3319620T/pt unknown
- 2016-06-30 EP EP16739045.9A patent/EP3319620B1/en active Active
-
2019
- 2019-10-01 US US16/589,409 patent/US10793925B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074010A1 (en) * | 2005-12-24 | 2007-07-05 | Teagasc Dairy Products Research Centre | Process for the production of trans-10, cis 12 octadecadienoic acid |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ILARIA CARAFA, TIZIANA NARDIN, ROBERTO LARCHER, ROBERTO VIOLA, KIERAN TUOHY, ELENA FRANCIOSI: "Identification and characterization of wild lactobacilli and pediococci from spontaneously fermented Mountain Cheese", FOOD MICROBIOLOGY., ACADEMIC PRESS LTD, LONDON., GB, vol. 48, 1 June 2015 (2015-06-01), GB, pages 123 - 132, XP055298635, ISSN: 0740-0020, DOI: 10.1016/j.fm.2014.12.003 * |
| OGAWA, J. ; KISHINO, S. ; ANDO, A. ; SUGIMOTO, S. ; MIHARA, K. ; SHIMIZU, S.: "Production of conjugated fatty acids by lactic acid bacteria", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 100, no. 4, 1 October 2005 (2005-10-01), NL, pages 355 - 364, XP027707241, ISSN: 1389-1723 * |
| ROMERO-PÉREZ G A, INOUE R, USHIDA K, YAJIMA T.: "A rapid method of screening lactic acid bacterial strains for conjugated linoleic acid production.", BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY BIOCHEMISTRY, JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY AND AGROCHEMISTRY, JP, vol. 77, no. 3, 1 January 2013 (2013-01-01), JP, pages 648 - 650, XP002754919, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1271/bbb.120709 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017005584A9 (en) | 2017-03-23 |
| WO2017005584A1 (en) | 2017-01-12 |
| EP3319620A1 (en) | 2018-05-16 |
| ITUB20152376A1 (it) | 2017-01-09 |
| PL3319620T3 (pl) | 2020-07-27 |
| US10793925B2 (en) | 2020-10-06 |
| CN108348559B (zh) | 2021-11-23 |
| EA201890223A1 (ru) | 2018-06-29 |
| ES2788636T3 (es) | 2020-10-22 |
| US20180187274A1 (en) | 2018-07-05 |
| US20200032357A1 (en) | 2020-01-30 |
| CN108348559A (zh) | 2018-07-31 |
| EP3319620B1 (en) | 2020-03-04 |
| PT3319620T (pt) | 2020-04-06 |
| MX2017016283A (es) | 2018-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10793925B2 (en) | Lactobacillus paracasei for the production of conjugated linoleic acid, nutritional and pharmaceutical preparations containing it and uses thereof | |
| RU2732480C2 (ru) | Композиция, подходящая для защиты микроорганизмов | |
| US20180207165A1 (en) | Methods and compositions for stimulating beneficial bacteria in the gastrointestinal tract | |
| KR101043465B1 (ko) | 에쿠올 생산 유산균 함유 조성물 | |
| KR101618391B1 (ko) | 높은 옥살산 분해능을 갖는 유산균 | |
| KR100514593B1 (ko) | 공역화 리놀렌산을 생산하는 신규한 균주, 이를 함유하는 캡슐제 및 이를 이용한 기능성 식품 | |
| KR20060135016A (ko) | 유카 추출물, 퀼라야 추출물 및 유산균을 포함하는 조성물및 상기 조성물을 함유하는 음식물 | |
| KR20140006509A (ko) | 공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 롱검 균주 및 그 용도 | |
| Homayouni-Rad et al. | Kluyveromyces marxianus as a probiotic yeast: A mini-review | |
| AU2017327485B2 (en) | Bacteria | |
| US20190053527A1 (en) | Method for preparing a probiotic powder using a two-in-one whey-containing nutrient medium | |
| JP4762987B2 (ja) | 乳酸菌培養により得られる血圧低下剤 | |
| JP6061530B2 (ja) | Ｎａｓｈ予防治療剤 | |
| JP2017031102A (ja) | 血中尿酸値低減剤 | |
| KR101191893B1 (ko) | 초유로부터 분리한 공액리놀레산 생산 균주 및 그 용도 | |
| JP2019071879A (ja) | 乳酸醗酵ニンジンの製造方法 | |
| TWI838990B (zh) | 腸管免疫賦活劑、IgA産生促進劑及基因表現促進劑 | |
| Fiagbor | Development of Probiotic Milk with Tiger Nut (Cyperus esculentus) Milk Extract | |
| ITRM20130257A1 (it) | Nuovo ceppo di lactobacillus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |