CN110628679B - 解鸟氨酸拉乌尔菌g10及产酶方法与产品和应用 - Google Patents

解鸟氨酸拉乌尔菌g10及产酶方法与产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了海洋来源的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10，其保藏号为CCTCC NO：M 2019485。该菌种为革兰氏阴性细菌，短杆状，有荚膜，不能运动；以牛肉膏蛋白胨培养时，菌落直径1～3mm，最适生长温度为30℃，最适生长pH为6。本发明还公开了该菌种产甲壳素脱乙酰基酶方法和产品。该菌种可以产生多种工农业用酶，包括甲壳素脱乙酰基酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和纤维素酶。解鸟氨酸拉乌尔菌G10在生产甲壳素脱乙酰基酶过程中，培养基成分简单，培养时间短(24h)，培养温度低(25℃)。该酶酶活最适温度为30℃，最适pH为5。该酶具良好的pH适应性，在pH3～10之间均有27％以上酶活，在酶法制备壳聚糖中有应用。

Description

解鸟氨酸拉乌尔菌G10及产酶方法与产品和应用
技术领域
本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10，已于2019年6月25日保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019485；本发明还涉及该菌种产甲壳素脱乙酰基酶的方法、产品及其应用。
背景技术
甲壳素脱乙酰基酶(Chitin deacetylase，EC 3.5.1.41)水解甲壳素多糖中的N-乙酰基。甲壳素中的N-乙酰基只要被脱去55％以上即可被称为壳聚糖。壳聚糖在医药、食品、化工、农业、环境工程和生物医学工程等诸多领域的有重要应用价值。目前市面上采用的甲壳素脱乙酰方法普遍为浓碱法，存在诸多弊端，例如污染环境、反应耗时长、产品质量不稳定等。生物酶法—甲壳素脱乙酰基酶可以解决上述问题，具有很多化学法不具备的优势，例如不会降解甲壳素分子中的主链部分、产物品质稳定、脱乙酰度较高、节约成本、耗时短等。虽然甲壳素脱乙酰基酶具有重要应用价值，但目前国内尚无商品化的酶制剂，所以其开发潜力巨大。已经报道的甲壳素脱乙酰基酶产生菌株多存在产酶发酵时间长，发酵温度高，产酶培养基成本高等缺点。综上所述，广泛筛选产酶量高、生产成本低的优良菌株是开发甲壳素脱乙酰基酶的重要途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的可产甲壳素脱乙酰基酶的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10。
本发明的另一个目的是提供解鸟氨酸拉乌尔菌G10产甲壳素脱乙酰基酶的方法。
本发明的又一个目的是提供解鸟氨酸拉乌尔菌G10所产甲壳素脱乙酰基酶产品。
本发明的再一个目的是提供了前述方法所产甲壳素脱乙酰基酶的用途；
本发明的又一个目的是提供了解鸟氨酸拉乌尔菌G10的水解应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。本发明是一种解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10，其特点是：其生物保藏号为：CCTCC NO:M 2019485。
本发明还公开了一种以上技术方案所述的解鸟氨酸拉乌尔菌G10生产甲壳素脱乙酰基酶的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)种子培养：将解鸟氨酸拉乌尔菌G10斜面培养物接种到种子培养基中，转速150～180rpm，装液量20～30％，20～35℃培养10～15h，得到种子液；所述种子培养基组成为海带汁，制备方法为：干海带磨成80目粉，按20g/1000ml称取海带粉加入水中，煮沸20min，补充失水，过滤即得。
(2)液体摇瓶发酵：将种子液接种到产酶培养基中，150～200rpm，装液量30～50％，20～40℃培养15～32h，得到甲壳素脱乙酰基酶发酵液；所述产酶培养基的组成为：虾壳粉1～2％，硫酸铵0.1～0.5％，海带汁配制。
本发明还公开了一种甲壳素脱乙酰基酶，其特点是：该甲壳素脱乙酰基酶采用以上技术方案所述的解鸟氨酸拉乌尔菌G10发酵制得。或者该甲壳素脱乙酰基酶采用以上技术方案所述的产酶方法制得。所述的甲壳素脱乙酰基酶可以用于制备甲壳素脱乙酰化产品，如壳聚糖。本发明方法所产甲壳素脱乙酰基酶的最适pH为5，酶活最适温度为30℃，在pH3～10范围均具有活性。
本发明所述的解鸟氨酸拉乌尔菌G10，分离自中国江苏省连云港在海一方公园海域海泥。通过筛选培养基筛选得到所述解鸟氨酸拉乌尔菌。所述筛选培养基组成为：甲壳素粉1％，琼脂2％，海带汁配制。对所述菌种进行摇瓶培养，并对其发酵液进行甲壳素脱乙酰基酶活性鉴定。
本发明所述的解鸟氨酸拉乌尔菌G10通过16S rDNA序列分析，结合菌落形态、细胞显微形态和生理生化反应结果，鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌。生理生化测定表明，该菌种具有产生多种工农业用酶的能力，包括：甲壳素脱乙酰基酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和纤维素酶。
本发明还公开了一种利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解甘露聚糖的方法，其特征在于，其步骤如下：在甘露聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，于180rpm、装液量40％、32℃培养34h，细胞离心沉淀，收集上清，即得到甘露聚糖酶提取液。甘露聚糖酶产酶培养基：魔芋精粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，海水配制。
本发明还公开了一种利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解木聚糖的方法，其特征在于，其步骤如下：在木聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在30℃、180rpm、装液量40％培养34h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到木聚糖酶提取液。木聚糖酶产酶培养基的组成为：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，K2HPO4 0.015％，KH2PO4 0.6％，木聚糖1％，海水配制。
本发明还公开了一种利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解纤维素的方法，其特征在于，其步骤如下：在纤维素酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在38℃、180rpm、装液量50％培养22h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到纤维素酶提取液。纤维素酶产酶培养基的组成为：羧甲基纤维素钠1％,蛋白胨1％,酵母膏0.05％,氯化钠0.05％,磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，自来水配制。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种新的产甲壳素脱乙酰基酶的解鸟氨酸拉乌尔菌G10。所产的酶具有广范的用途。
2、利用本发明解鸟氨酸拉乌尔菌G10生产甲壳素脱乙酰基酶的培养基成分简单、价格低廉，仅含有虾壳、硫酸铵、海带三种原料。该菌种产酶培养时间短，发酵液酶活力高，25℃仅培养24h，发酵液酶活力为187.34U/ml。该菌种所产的甲壳素脱乙酰基酶产品的最适pH为5，酶活最适温度为30℃，在pH 3～10范围均具有活性，用途广范。所产生的甲壳素脱乙酰基酶可以应用于壳聚糖的制备。
3、本发明的菌种解鸟氨酸拉乌尔菌G10还产生多种工农业用酶，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶和纤维素酶，具有广泛的应用潜力。
附图说明
图1为解鸟氨酸拉乌尔菌G10细胞形态图(1000倍；革兰氏染色)；
图2为解鸟氨酸拉乌尔菌G10单菌落形态图；
图3为基于16S rDNA构建的解鸟氨酸拉乌尔菌G10种系进化关系图；
图4为不同温度对解鸟氨酸拉乌尔菌G10生长的影响图；
图5为不同pH对解鸟氨酸拉乌尔菌G10生长的影响图；
图6为不同NaCl浓度对解鸟氨酸拉乌尔菌G10生长的影响图；
图7为不同反应温度对酶活性的影响图；
图8为30℃条件下酶的热稳定性图；
图9为不同反应pH对酶活性的影响图；
图10为pH 5条件下酶的pH稳定性图。
本发明所述解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10(简称解鸟氨酸拉乌尔菌G10)于2019年6月25日保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019485，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，联系电话：027－68754052。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
实施例1，解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10(以下简称解鸟氨酸拉乌尔菌G10或者菌种G10)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2019485。解鸟氨酸拉乌尔菌G10的分离，步骤如下：
在连云港在海一方公园海域低潮区采集海泥样本，无菌蒸馏水稀释后涂布于筛选培养基平板上，25℃培养48～72h，选择出现透明圈的菌落。挑取菌落接种到产酶培养基中，25℃培养24h，培养物于8000rpm离心3min，得到上清，检测其中甲壳素脱乙酰基酶活性。在10ml的离心管中加入0.05mol/L的磷酸缓冲液3ml，加入发酵上清液1ml，再加入0.2g/L的对硝基乙酰苯胺溶液1ml，置于30℃水浴锅中进行酶促反应15min，酶促反应结束后，沸水中煮沸失活10min终止酶促反应。用1ml同样浓度的已经沸水浴灭活的酶作为对照组。用分光光度计测量反应液在400nm的条件下的吸光度值，通过对硝基苯胺标准曲线的回归方程计算酶活力，通过比较酶活力大小选择酶活最高的菌种。酶活力定义为在以上的反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量为一个酶单位。
筛选培养基的组成：甲壳素粉1％，琼脂粉2％，海带汁配制。其中海带汁的制备方法为：干海带磨成80目粉，称取20g加入到1000ml自来水中，煮沸20min，补充失水，过滤即得。
解鸟氨酸拉乌尔菌G10的鉴定，步骤如下：
(1)对解鸟氨酸拉乌尔菌G10进行显微观察，结果为：该菌种为革兰氏阴性杆状细菌；油镜下观察所见：细胞短杆状，无芽孢，有荚膜，不能运动；菌体大小(宽×长)约为0.57±0.03μm×1.09±0.05μm；单独存在或两个细胞呈链状排列，参见图1。
(2)对解鸟氨酸拉乌尔菌G10进行菌落形态特征观察，30℃培养24h后，菌种G10在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落特征为：单菌落的直径为1～3mm，菌落半透明，表面水润光泽，菌落圆形，***成半球型，边缘规则，参见图2。在筛选培养基上生长时菌落形态与上述相似，但菌落直径增大，为5～10mm。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7.0。
(3)对解鸟氨酸拉乌尔菌G10进行生理生化性能测定，结果见表1：
表1解鸟氨酸拉乌尔菌G10生理生化性能
Figure GDA0003545481640000051
注：+：阳性；-：阴性。
(4)利用细菌16S rDNA序列通用引物27F和1492R，以菌种G10基因组DNA为模版进行扩增。通过PCR反应获得16S rDNA扩增产物并测序，得到长度为1506bp的序列(见序列表)。利用Mega 5软件，基于16S rDNA序列对菌种G10进行种系关系分析，参见图3。
综合菌落形态、细胞形态和16S rDNA序列分析，鉴定菌种G10为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)。
测定解鸟氨酸拉乌尔菌G10在牛肉膏蛋白胨培养基上的生长特性，步骤如下：
(1)菌种G10细胞悬液的制备：
利用牛肉膏蛋白胨培养基对菌种G10在30℃培养24h，获得细胞悬液。
(2)温度对菌种G10生长的影响：
将菌种G10细胞悬液以0.5％(v/v)接种量接种于牛肉膏蛋白胨培养基，分别在不同温度下静置培养，48h后在600nm波长下测定细胞悬液OD值。结果表明，该菌种生长温度范围为4～45℃，最适生长温度为30℃，见图4。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7.0。
(3)pH对菌种G10生长的影响：
使用磷酸缓冲液配制pH在2～8之间的牛肉膏蛋白胨培养基，使用硼酸缓冲液配制pH在9～12的培养基。将G10细胞悬液以0.5％接种量接种于不同pH的培养基，在30℃培养48h，测定细胞浓度。结果表明，该菌种生长pH范围为4～10，最适生长pH为6，见图5。
(4)NaCl对菌种G10生长的影响：
配制不同NaCl浓度的牛肉膏蛋白胨培养基，使其浓度为0～20％(w/v)。将G10细胞悬液以0.05％接种量接种于不同NaCl浓度的培养基，在30℃培养48h，测定细胞浓度。结果表明，该菌种生长的NaCl浓度为0％～5％，最适生长的NaCl浓度为0，见图6。
实施例2，实施实例1所述解鸟氨酸拉乌尔菌G10产甲壳素脱乙酰基酶的方法，步骤如下：
(1)制备种子液：从G10菌种斜面接种到种子培养基中，转速180rpm，装液量20％，30℃培养12h，得到种子液；其中种子培养基为海带汁，制备方法为：干海带磨成80目粉，称取20g加入到1000ml自来中，煮沸20min，补充失水，过滤即得。
(2)产酶培养：将种子液以1％(v/v)接种量接种于产酶培养基中，200rpm，装液量30％，25℃培养24h，离心或过滤细胞，收集上清液，即得到甲壳素脱乙酰基酶发酵液。按照实施实例1中方法测定发酵液酶活力为187.34U/ml。
产酶培养基：虾壳粉1％，硫酸铵0.2％，海带汁配制。
解鸟氨酸拉乌尔菌G10产甲壳素脱乙酰基酶的性质测定，内容如下：
(1)反应温度对酶活性的影响：
选择25℃、30℃、35℃、40℃、45℃这5个温度进行酶活力的测定。结果见图7，酶的最适作用温度为30℃，在25℃～35℃温度范围时有60％以上的酶活力。
(2)酶的热稳定性：
将甲壳素脱乙酰基酶发酵液在30℃下保温48h，每隔4h取出一组样品，迅速冻存于-20℃冰箱内，待保温结束后统一测定残余酶活，以未进行温度处理的发酵液的酶活设为100％，结果见图8。菌种G10产生的甲壳素脱乙酰基酶热稳定性高，在30℃下保温12h后残余酶活39％。
(3)反应pH对酶活性的影响：
用不同pH的缓冲液配制反应体系，保持底物和酶浓度相同，在30℃下进行酶活力测定。结果见图9，pH 3时该酶的活性最高。在pH 2～4之间有60％以上酶活力。
(4)酶的pH稳定性：
将甲壳素脱乙酰基酶发酵液的pH用缓冲液调节至5，至于4℃冰箱中保温，每隔4h取出一个样冻存，最后统一测定酶活。结果见图10，该酶有较好的pH稳定性。
实施例3，利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解甘露聚糖，步骤如下：
在甘露聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，于180rpm、装液量40％、32℃培养34h，细胞离心沉淀，收集上清，即得到甘露聚糖酶提取液。取0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)100ml，加入0.4g魔芋精粉，加热并用玻璃棒搅拌溶解，配置成底物溶液。取0.9ml底物溶液置于10ml离心管中，再加入0.1ml酶提取液，摇匀，放入55℃水浴锅中，酶促反应10min。反应结束后，加入DNS溶液2ml，放入电磁炉中在沸水中反应5min。用分光光度计测定其540nm处吸光度值值。沸水浴灭活的酶提取液做对照组。根据甘露糖标准曲线计算得到甘露聚糖酶提取液酶活力为13.1U/ml。酶活力定义：在pH为7.0，温度为55℃条件下，每分钟水解β-甘露聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位。
甘露聚糖酶产酶培养基：魔芋精粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，海水配制。
实施例4，利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解木聚糖，步骤如下：
在木聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在30℃、180rpm、装液量40％培养34h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到木聚糖酶提取液。将0.2ml木聚糖酶提取液加入到1.8ml 1％木聚糖底物溶液(1％木聚糖底物液用pH 5、0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)，30℃反应30min，加入1ml DNS试剂后，沸水浴10min，冷却后定容至20ml。在540nm下测吸光度值。沸水浴灭活的酶提取液做对照组。根据木糖标准曲线计算得到甘露聚糖酶提取液酶活力为73.2U/ml。木聚糖酶活力单位(U)的定义为：在上文所提到条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。
木聚糖酶产酶培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，K2HPO4 0.015％，KH2PO4 0.6％，木聚糖1％，海水配制。
实施例5，利用解鸟氨酸拉乌尔菌G10水解纤维素，步骤如下：
在纤维素酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在38℃、180rpm、装液量50％培养22h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到纤维素酶提取液。取0.5ml的纤维素酶提取液，加入0.5ml 0.5％的羧甲基纤维素钠溶液(0.1M,pH 7的磷酸缓冲液配制)，50℃保温20min后，加入1ml的DNS试剂，混合于沸水中煮沸5min，待冷却至室温后，用蒸馏水稀释至5ml，用分光光度计测定540nm处吸光度值。沸水浴灭活的酶提取液做对照组。根据葡萄糖标准曲线计算得到纤维素酶提取液酶活力为43U/ml。酶活力定义：在上述条件下每分钟水解底物生成1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。
纤维素酶产酶培养基：羧甲基纤维素钠1％,蛋白胨1％,酵母膏0.05％,氯化钠0.05％,磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，自来水配制。
序列表
<110> 江苏海洋大学
<120> 解鸟氨酸拉乌尔菌G10及产酶方法与产品和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1506
<212> DNA
<213> 解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)
<400> 2
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tccccgggct caacctggga actgcatccg aaactggcag gctagagtct tgtagagggg 660
ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa 720
ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga tgtcgacttg gaggttgttc ccttgaggag 840
tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 900
ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa 960
cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc agagaactta gcagagatgc tttggtgcct 1020
tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcggttcgg ccgggaactc 1140
aaaggagact gccagtgata aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc 1200
cttacgagta gggctacaca cgtgctacaa tggcatatac aaagagaagc gacctcgcga 1260
gagcaagcgg acctcataaa gtatgtcgta gtccggatcg gagtctgcaa ctcgactccg 1320
tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc 1440
ttcgggaggg cgcttaccac tttgtgattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtagg 1506

Claims (7)

1.解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO：M 2019485。
2.一种如权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10产甲壳素脱乙酰基酶的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)制备种子液：将解鸟氨酸拉乌尔菌G10接种到种子培养基中，转速150～180rpm，装液量20～30％，20～35℃培养10～15h，得到种子液；所述种子培养基为海带汁，配制方法如下：干海带磨成80目粉，按20g/1000ml向海带粉中加水，煮沸20min，补充失水，过滤即得；
(2)产酶培养：将种子液以1％v/v接种量接种到产酶培养基中，150～200rpm，装液量30～50％，20～40℃培养15～32h，得到甲壳素脱乙酰基酶发酵液；所述产酶培养基的组成为：虾壳粉1～2％，硫酸铵0.1～0.5％，采用步骤(1)中所述的海带汁配制。
3.一种甲壳素脱乙酰基酶，其特征在于：该甲壳素脱乙酰基酶采用权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10发酵制得；或者采用权利要求2所述的方法制得。
4.一种如权利要求2所述的方法所产甲壳素脱乙酰基酶或者如权利要求3所述的甲壳素脱乙酰基酶的用途，其特征在于，该用途为利用甲壳素脱乙酰基酶制备甲壳素脱乙酰化的产品。
5.一种利用权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10水解甘露聚糖的方法，其特征在于，其步骤如下：在甘露聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，于180rpm、装液量40％、32℃培养34h，细胞离心沉淀，收集上清，即得到甘露聚糖酶提取液；所述的甘露聚糖酶产酶培养基的组成为：魔芋精粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，海水配制。
6.一种利用权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10水解木聚糖的方法，其特征在于，其步骤如下：在木聚糖酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在30℃、180rpm、装液量40％培养34h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到木聚糖酶提取液；木聚糖酶产酶培养基的组成为：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，K2HPO40.015％，KH2PO4 0.6％，木聚糖1％，海水配制。
7.一种利用权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)G10水解纤维素的方法，其特征在于，其步骤如下：在纤维素酶产酶培养基中接种解鸟氨酸拉乌尔菌G10，在38℃、180rpm、装液量50％培养22h后，细胞离心沉淀，收集上清，即得到纤维素酶提取液；纤维素酶产酶培养基的组成为：羧甲基纤维素钠1％,蛋白胨1％,酵母膏0.05％,氯化钠0.05％,磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，自来水配制。
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