TWI408231B - 稻稈纖維水解酵素之生產方法 - Google Patents

Description

稻稈纖維水解酵素之生產方法

本發明係有關於一種稻稈纖維水解酵素之生產方法，尤指涉及一種以木黴菌(Trichoderma Species)為生產菌株，特別係指所生產之酵素能夠將稀酸前處理原料中之纖維素分解為葡萄糖，俾使水解效率達85%以上，並較商業酵素提高約4%者。

纖維素分解酵素主要由真菌、細菌及放線菌所生產，纖維素降解作用主要由三種纖維酵素共同作用完成，包含：葡萄糖內切酶(EC 3.2.1.4；endoglucanases)：用以攻擊纖維素之低結晶區，產生游離短鍊聚合糖；葡萄糖外切酶(EC 3.2.1.91；exoglucanases)：用以將游離短鍊聚合糖從末端切成纖維雙糖(Cellobiose)；以及纖維雙糖酶(EC 3.2.1.21；b-glucosidase)：用以將水解纖維雙糖轉變成葡萄糖。當上述三個酵素活性成分比例適當，則可完成纖維素之分解。

木黴菌生產纖維水解酵素，係由碳源種類決定誘導之程度，先前研究(Sun,Cheng et al.2008)以稻稈在未經處理、研磨與鹼處理下，作為誘導酵素之基質，可誘導活性分別為0.18、0.71與1.07FPU/ml。現階段工業量產纖維酵素以木黴菌進行生產，雖然以高純度纖維基質進行酵素生產可得到較高活性酵素液，但因基質價格昂貴，因此在商業生產上必須尋找低價之替代誘導基質。有鑑於此，若能利用含有纖維素之自然原料，應用於誘導纖維酵素生產，將可達到降低酵素成本之目的。 故，一般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。

本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種所生產之酵素能夠將該稀酸前處理原料中之纖維素分解為葡萄糖，俾使水解效率達85%以上，並較商業酵素提高約4%者。

本發明之次要目的係在於，提供一種能利用含有纖維素之自然原料，應用於誘導纖維酵素生產，以達到降低酵素之成本者。

為達以上之目的，本發明係一種稻稈纖維水解酵素之生產方法，係以木黴菌為生產菌株，並以稀酸前處理原料誘導該木黴菌生產纖維水解酵素，俾使所生產之酵素能夠將該稀酸前處理原料中之纖維素分解為葡萄糖；於其中，該稀酸前處理原料係依序經由稀酸前處理程序、水洗程序、前培養菌絲程序、以及纖維素水解酵素生產程序生產纖維水解酵素。

請參閱『第1圖及表一』所示，係分別為本發明之生產流程示意圖及本發明使用之培養基配方表。如圖、表所示：本發明係一種稻稈纖維水解酵素之生產方法，係以木黴菌(Trichoderma Species)為生產菌株，並以稀酸前處理原料誘導該木黴菌生產纖維水解酵素，藉所生產之酵素能夠將該稀酸前處理原料中之纖維素分解為葡萄糖，俾使水解效率達85%以上者；於其中，該稀酸前處理原料係可選自任何含有纖維素 之自然原料，應用於誘導纖維酵素生產，故可達到降低酵素成本之目的，且該稀酸前處理原料為誘導基質，係預先經稀酸前處理程序破壞其結構及混酸後，再送入高溫環境下通入介於140~180℃之間之蒸汽進行蒸煮20~40分鐘。

當本發明於運用時，上述稀酸前處理原料係可選自稻稈(Rice straw)，其實施方法係至少包含下列步驟：(A)稀酸前處理程序11：上述稀酸處理過之稻稈係以雙軸螺旋擠壓機(詳細過程請參考本申請人以中華民國專利申請第097100129號之專利案，在此不多作贅述)混酸搭配高溫熱水溶洗反應槽作為前處理設備所產生之固態稻稈渣料。其反應過程中，經裁切至適當尺寸之稻稈首先以該雙軸螺旋擠壓機破壞其結構，其操作之稀酸濃度為3%(w/w)，螺桿轉速為40 rpm，混酸溫度在120℃，以及進料稻桿乾重與稀酸水溶液之比例約為50：100。當上述稻稈經擠壓機處理後，再送入熱水溶洗反應槽，並通入適量蒸汽進行稀酸催化，使稻桿乾重與水溶液之比例降至約30：100，同時提高反應溫度至160℃，並在此高溫下蒸煮30分鐘後，隨即將反應後之稻稈及水溶液排出，再經固液分離設備將反應後之稻稈渣料及水溶液予以分離，最後其所得之稻稈渣料即為本發明進行纖維水解酵素生產之誘導物質；(B)水洗程序12：將上述所得之誘導物質利用水洗方式降低誘導物中含糖類與抑制物成分，經取預處理稻稈渣料重量5~6倍水，與稻稈渣料均勻混合，再將稻稈渣料過濾，直到測出濾液酸鹼值介於4.2~5.5之間即可；(C)前培養菌絲程序13：取1%葡萄糖(即1g Glucose) 及培養基調整酸鹼值為5.5，在121℃下經15分鐘壓熱減菌後，作為前培養基。在該前培養基中將木黴菌孢子植菌為108個/ml，以溫度25℃及150rpm振盪培養24小時，經過濾得前培養菌絲。其中，上述培養基組成如下表一所示；

(D)纖維素水解酵素生產程序14：取上述特定體積之培養基並添加佔培養基重量比1~5%比例之酸處理稻稈渣料，調整酸鹼值為5.5，在121℃下經15分鐘壓熱減菌後，在此培養基接種上述前培養菌絲後，以溫度25℃及150rpm振盪培養72小時，經固液分離後得纖維水解酵素。至此，完成纖維水解酵素之製備程序，並進行後續之酵素粗萃液活性分析與酵素水解測試；(E)酵素粗萃液活性分析15：對於經由步驟(C)、(D)所得之纖維水解酵素粗萃液之酵素活性值，本發明係利用由國際純化學與應用化學聯盟(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)所建立之方法，該纖維水解酵素乃將以濾紙(Whatman No.1 Filter Paper)為基質，經由酵素加水分解而生成之還原糖與呈色劑-3,5-二硝基柳酸(Dinitrosalicylic acid,DNS)反應，以540奈米(nm)之吸光度之增加用以定量測定。其中，該纖維水解酵素總活性測定計算方式主要係以50毫克(mg)Whatman No.1濾紙為受質，於50℃條件下作用60分鐘後，產生2.0mg之還原糖，以FPU為酵素活性單位，並定義為在測試分析條件下，每分鐘釋放出來0.37微莫耳(μmol)還原糖之酵素量，為1 Unit/ml；(F)酵素水解測試16：配製50毫升(mL)0.05M且pH4.8之醋酸鹽緩衝液(Acetate Buffer)於250mL三角瓶中，以稀酸前處理稻稈渣料為水解效率測試原料，其原料乾重與水溶液總重量之比例為1：50，酵素添加比例為每克纖維素添加具有15~30FPU活性之酵素量，於溫度50℃及100rpm振盪條件下進行水解實驗72小時，再取樣分析樣品中之水解產物，計算水解效率。

請參閱『第2圖』所示，係本發明以未處理及研磨處理之稻稈與酸處理稻稈基質之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。如圖所示：於一較佳實施例中，係本發明以未處理稻稈、研磨稻稈及稀酸前處理稻稈，在瓶杯實驗中進行酵素生產測試，其中添加誘導物與培養基比例為1：100。由實驗結果發現，經稀酸前處理稻稈比未處理或僅研磨之酵素生產，要增加480%與262.5%誘導效果，可生成酵素之活性達0.58FPU/ml，顯示稻稈需經前處理破壞結構後，才能作為誘導纖維水解酵素之基質。

請參閱『第3圖』所示，係本發明以酸處理稻稈基質有無水洗之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。如圖所示：於另一較佳實施例中，係本發明以未水洗稀酸前處理稻稈與水洗稀酸前處理稻稈，在瓶杯實驗中進行對酵素生產影響之測試，其中添加誘導物與培養基比例為1：100。由實驗結果顯示，經水洗後之誘導基質係可增加纖維酵素生產活性之125.8%，酵素活性值可達1.31FPU/ml。

請參閱『第4圖』所示，係本發明以不同比例酸處理稻稈之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。如圖所示：於再一較佳實施例中，係本發明以5L發酵槽測試，其中，添加作為基質之水洗稀酸前處理稻稈渣料與培養基比例為1：100及1：50，以操作條件溫度25℃，且轉速200rpm，於通氣量1vvm及酸鹼值5.5進行反應72小時測試酵素活性。由實驗結果顯示，經水洗基質比例為1：100所誘導酵素活性2.1FPU/ml最高，比水洗基質比例為1：50所誘導還高出26.88%，亦比瓶杯實驗在相同條件下酵素活性增加60.3%。於其中，上述測試酵素活性之操作範圍乃可以酸鹼值介於4~6之間，且轉速介於180~300rpm之間，於溫度介於23~30℃及通氣量介於0.6~1.2vvm之間進行48~72小時之操作反應。

請參閱『第5圖』所示，係本發明以商業酵素及本發明酵素對稀酸前處理稻渣水解之效益比較示意圖。如圖所示：於又一較佳實施例中，係本發明將所誘導之纖維水解酵素，應用於160℃雙軸擠壓稀酸處理稻稈渣料進行酵素水解。其中，商業酵素A與商業酵素B混合使用，其水解效率僅81.7%，惟以本發明所誘導之酵素進行酵素水解時，其水解效率乃可達 85.7%，可見本發明誘導生產之酵素對介於140~180℃之間之稀酸前處理原料有很高之水解效率，並明顯較商業酵素高出4%水解效率。

綜上所述，本發明係一種稻稈纖維水解酵素之生產方法，可有效改善習用之種種缺點，係以木黴菌為生產菌株，並以稀酸前處理原料誘導該木黴菌生產纖維水解酵素，藉所生產之酵素能夠將該稀酸前處理原料中之纖維素分解為葡萄糖，俾使水解效率可達85%以上，進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

11‧‧‧步驟(A)稀酸前處理程序

12‧‧‧步驟(B)水洗程序

13‧‧‧步驟(C)前培養菌絲程序

14‧‧‧步驟(D)纖維素水解酵素生產程序

15‧‧‧步驟(E)酵素粗萃液活性分析

16‧‧‧步驟(F)酵素水解測試

第1圖，係本發明之生產流程示意圖。

第2圖，係本發明以未處理及研磨處理之稻稈與酸處理稻稈基質之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。

第3圖，係本發明以酸處理稻稈基質有無水洗之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。

第4圖，係本發明以不同比例酸處理稻稈之誘導出纖維水解酵素活性比較示意圖。

第5圖，係本發明以商業酵素及本發明酵素對稀酸前處理稻渣水解之效益比較示意圖。

11‧‧‧步驟(A)稀酸前處理程序

12‧‧‧步驟(B)水洗程序

13‧‧‧步驟(C)前培養菌絲程序

14‧‧‧步驟(D)纖維素水解酵素生產程序

15‧‧‧步驟(E)酵素粗萃液活性分析

16‧‧‧步驟(F)酵素水解測試

Claims (3)

1. 一種稻稈纖維水解酵素之生產方法，係包括：(A)稀酸前處理程序：將稻稈以稀酸濃度為3%(w/w)，螺桿轉速為40 rpm，混酸溫度在120℃，以及進料稻桿乾重與稀酸水溶液之比例約為50：100下，以雙軸螺旋擠壓機破壞其結構，當稻稈經擠壓處理後，再送入熱水溶洗反應槽，並通入適量蒸汽進行稀酸催化，使稻桿乾重與水溶液之比例降至約30：100，在介於140~180℃之反應溫度下進行蒸煮20~40分鐘後，經固液分離得稀酸處理之稻稈渣料，完成誘導物之製備；(B)水洗程序：將上述所得稀酸處理之稻稈渣料，經取其預處理重量5~6倍水，與稻稈渣料均勻混合，再將稻稈渣料過濾，直到測出濾液酸鹼值介於4.2~5.5之間；(C)前培養菌絲程序：取1%葡萄糖(即1g Glucose)及培養基調整酸鹼值為5.5，經壓熱減菌後，作為前培養基，並在該前培養基中將木黴菌(Trichoderma Species)孢子植菌為10⁸ 個/ml，以溫度25℃及150rpm振盪培養24小時，經過濾得前培養菌絲；以及(D)纖維素水解酵素生產程序：取上述特定體積之培養基並添加步驟(B)佔培養基重量比1~5%比例之酸處理稻稈渣料，調整酸鹼值介於4~6之間，經壓熱減菌，在此培養基接種上述前培養菌絲後，以溫度介於23~30℃、通氣量介於0.6~1.2vvm之間及轉速介於150~300rpm之間，振盪培養48~72小時，經固液分離後得纖維水解酵素。
2. 依據申請專利範圍第1項所述之稻稈纖維水解酵素之生產方 法，其中，該步驟(B)水洗程序係用以去除誘導物中含糖類與抑制物成分。
3. 依據申請專利範圍第1項所述之稻稈纖維水解酵素之生產方法，其中，該步驟(C)木黴菌之接種量為5~10%容積百分率(5~10v/v%)。