CN113845583B - 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种修饰的重组人神经生长因子，由式A聚合物与重组人神经生长因子反应得到。所述式A聚合物是一种N‑二取代氨基乙酰胺基醛聚合物。经实验证实：本发明提供的修饰rhNGF，相较于未修饰的rhNGF以及单甲氧基聚乙二醇修饰的rhNGF，均具有更高的体内血药浓度、更长的体内半衰期，而且保留了修饰前rhNGF的原有活性。此外，本发明提供的修饰的重组人神经生长因子制备方法成本低，修饰产物均一性高。

Description

一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，特别涉及一种修饰的重组人神经生长因子(recombinant human Nerve Growth Factor，rhNGF)及其制备方法。
背景技术：
神经生长因子(NGF)是一种具有重要生物学功能的神经细胞生长调节因子，对中枢神经***及周围神经***的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，能够促进交感和感觉神经元的成熟并维持已成熟交感神经元的正常功能。
因为NGF是蛋白质分子，进入体内后半衰期较短，需要每天给药才能保持其活性的发挥，病人依从性较差。因此，对蛋白质药物的分子进行保护，降低清除率、延长半衰期，从而减少给药频率、给药剂量是亟待解决的问题。
对蛋白质进行修饰，比如将某种生物惰性、安全无毒的聚合物通过共价与天然蛋白质连接，往往能有效改善蛋白质类药物在临床应用中的特性，如：提高血浆半衰期、降低免疫原性、提高药物疗效及安全性等。
但是，在蛋白质修饰过程中，由于蛋白质分子中的结合位点常常不止一个，有些蛋白质分子会同时结合单个或多个修饰物。与单修饰产物相比，多修饰产物不仅批间一致性差，质量控制困难，浪费原材料，提高了经济成本，而且往往生物学活性损失大。
因此，需要通过优化修饰条件，使反应更多的向单修饰方向进行，以使修饰产物更加均一，仍然保留天然蛋白质原有的生物学活性。
发明内容
本发明的目的是对重组人神经生长因子(以下亦称为rhNGF)进行修饰，增强rhNGF在体内的稳定性，延长半衰期。同时优化修饰条件，以使修饰产物保留原有的生物学活性。
本发明将式A聚合物与rhNGF的N-末端α氨基共价相连，得到了修饰rhNGF(式B)：
式中，m为1或2。
所述式A是N-二取代氨基乙酰胺基醛衍生物的聚合物。
式A聚合物的重均分子量为10kD～40kD，优选的重均分子量为20kD或40kD；
所述rhNGF来源于重组DNA技术制备，由2条相同的单链形成二聚体结构，单链氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。即，rhNGF由两条SEQ ID NO.1所示序列的单链氨基酸组成，或者两条SEQ ID NO.2所示序列的单链氨基酸组成。
修饰rhNGF(式B)的制备方法研究
将式A与rhNGF进行连接的反应中，需要解决的最大技术难点是，为了保留rhNGF蛋白质原有的生物学活性，得到均一的单修饰产物，需要控制反应更多的向单修饰方向进行。本发明进行了如下研究工作：
采用试验设计(DESIGN OF EXPERIMENT，简称DOE)响应面分析法，对式A修饰rhNGF的各反应条件进行了全面探索，得到了优化的各条件，包括：
实现高效修饰的式A与rhNGF摩尔比；pH值的优选范围，以及合适的反应溶剂、反应温度和反应时间等。
本发明提供了一种修饰rhNGF(式B)的制备方法，rhNGF与式A在还原剂氰基硼氢化钠作用下进行反应，得到式B。其中：
式A与rhNGF摩尔比为1～2：1；
还原剂氰基硼氢化钠的终浓度为20mM；
反应溶剂为醋酸/醋酸钠缓冲液，pH值为5.0～5.8；
反应温度：5±3℃或25±2℃；
反应时间：2h～24h。
本发明的有益效果
1、延长了rhNGF的体内半衰期
在大鼠体内进行修饰重组人神经生长因子的药代动力学研究，证实：本发明提供的修饰rhNGF，相较于未修饰的rhNGF以及单甲氧基聚乙二醇修饰的rhNGF，均具有更高的体内血药浓度、更长的体内半衰期(见实施例5)；
2、保留了修饰前rhNGF的原有活性
采用TF-1细胞/MTS比色法测定修饰重组人神经生长因子的生物学活性。证实：保留了促TF-1细胞增殖的生物学活性(见实施例6)。即保留了修饰前rhNGF的原有活性。
3、制备方法成本低，修饰产物均一性高
本发明提供的修饰重组人神经生长因子的方法，反应活率高，所需原料用量少，修饰产物均一性高，单修饰产物比例＞83％(见实施例1、2、3、4)。
附图说明
图1：SDS-PAGE检测式A与rhNGF修饰反应结果。图中M为分子量标准蛋白；1～5依次为rhNGF、式A-20K、修饰产物LAP2-20K、式A-40K、修饰产物LAP2-40K；
图2：式A-20K与rhNGF修饰反应DOE试验单修饰率等高线图；
图3：式A-20K与rhNGF修饰反应DOE试验多修饰率等高线图；
图4：式A-20K与rhNGF修饰反应DOE试验等高线叠加图；
图5：式A-40K与rhNGF修饰反应DOE试验单修饰率等高线图；
图6：式A-40K与rhNGF修饰反应DOE试验多修饰率等高线图；
图7：式A-40K与rhNGF修饰反应DOE试验等高线叠加图；
图8：SDS-PAGE检测反应温度对式A与rhNGF修饰反应影响的结果。图中M为分子量标准蛋白；1～2依次为5±3℃温度下修饰产物LAP2-20K、25±2℃温度下修饰产物LAP2-20K；
图9：SDS-PAGE检测反应时间对式A与rhNGF修饰反应影响的结果。图中M为分子量标准蛋白；1～9依次为rhNGF、式A-20K、反应1h、2h、4h、6h、8h、16h、24h修饰产物LAP2-20K；
图10：修饰产物LAP2-20K、修饰产物LAP2-40K刺激TF-1细胞增殖曲线。
序列表信息
SEQ ID NO.1：一种rhNGF的单链氨基酸序列。
SEQ ID NO.2：另一种rhNGF的单链氨基酸序列。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。所用的两种分子量的式A聚合物：“式A-20K”、“式A-40K”来源于北京键凯公司的试剂，产品代号是Y-PALD-20K、Y-PALD-40K。
实施例1式A与rhNGF反应，得到修饰rhNGF
反应1修饰产物LAP2-20K的制备(一)
在pH值为5.5的醋酸/醋酸钠缓冲体系中，加入5mL由SEQ ID NO.1组成的rhNGF原液，使蛋白含量为0.5mg/mL；
再加入氰基硼氢化钠，至终浓度为20mM；
再加入分子量为20kD的式A(式A-20K)使其与rhNGF的摩尔比为1:1；
在5±3℃反应16h。
对反应混合物进行SDS-PAGE检测，通过碘化钡和考马斯亮蓝分别进行染色，结果见图1。
反应2修饰产物LAP2-40K的制备(一)
方法同反应1，仅加入的式A分子量为40kD(式A-40K)。
两个反应的反应混合物根据修饰前后rhNGF所带电荷的差异经离子交换层析纯化，得到的修饰产物分别命名为LAP2-20K、LAP2-40K。
从图1可以看出，修饰产物LAP2-20K、LAP2-40K可以同时被碘化钡和考马斯亮蓝染色，其分子量与rhNGF以及对应的式A-20K、式A-40K相比均增大，且小于2倍的式A-20K、式A-40K分子量，请见图1泳道2、3、4、5，即式A-20K、式A-40K在所述条件下均与rhNGF共价连接，实现高效修饰，且修饰产物以单修饰为主。
反应3修饰产物LAP2-20K的制备(二)
方法同反应1，仅使用的rhNGF的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
反应4修饰产物LAP2-40K的制备(二)
方法同反应2，仅使用的rhNGF的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
以下多项试验确定了反应的最优pH值、摩尔比、温度、反应时间，以及各种原料试剂的优选用量。
实施例2基于DOE响应面分析法优化式A修饰rhNGF的反应条件
基于DOE响应面分析法设计试验方案，考察缓冲液pH值、式A(式A-20K、式A-40K)与rhNGF摩尔比对修饰率的影响，以单修饰率、多修饰率为响应值，利用分子筛高效液相色谱SEC-HPLC进行样品修饰率的检测。
(1)式A-20K与rhNGF修饰反应DOE试验结果
SEC-HPLC分析各条件下样品修饰率如表1所示。
表1式A-20K与rhNGF修饰反应SEC-HPLC检测修饰率结果
通过方差分析单修饰率、多修饰率模型的Prob＞F值＜0.05，证实模型显著，建模成功，说明缓冲液pH值、式A-20K与rhNGF摩尔比对修饰率有极显著的影响。
通过等高线分析结果如图2、图3：修饰率随摩尔比、pH值增加而提高，在摩尔比＞1.3：1、pH值在4.5～6.0范围内有较高的单修饰率。
将修饰率限定范围：单修饰率≥80％，多修饰率≤15％，满足条件的叠加区域如图4所示，可以选定修饰条件pH值5.0～5.5，摩尔比1.3～1.8：1。
(2)式A-40K与rhNGF修饰反应DOE试验结果
SEC-HPLC分析各条件下样品修饰率如表2所示。
表2式A-40K与rhNGF修饰反应SEC-HPLC检测修饰率结果
通过方差分析单修饰率、多修饰率模型的Prob＞F值＜0.05，证实模型显著，建模成功，说明缓冲液pH值、式A-40K与rhNGF摩尔比对修饰率有极显著的影响。
通过等高线分析结果如图5、图6：修饰率随摩尔比、pH值增加而提高，在摩尔比＞1.7：1、pH值在5.0～6.0范围内有较高的单修饰率。
将修饰率限定范围：单修饰率≥85％，多修饰率≤10％，满足条件的叠加区域如图7所示，可以选定修饰条件pH值5.25～5.75，摩尔比1.7～2.0：1。
实施例3 DOE试验选定的修饰rhNGF优势反应条件的确证
根据DOE响应面分析法选定的LAP2-20K、LAP2-40K修饰条件pH值、摩尔比区间范围，设计如表3的LAP2-20K、LAP2-40K修饰条件的确证试验，
利用分子筛高效液相色谱SEC-HPLC进行样品修饰率的检测，结果如表3所示，可以看出，LAP2-20K在pH值5.0～5.5，摩尔比1.5～1.8：1范围内均可实现单修饰率＞83％，多修饰率＜13％；LAP2-40K在pH值5.25～5.75，摩尔比1.7～2.0：1范围内均可实现单修饰率＞85％，多修饰率＜12％。
表3 LAP2-20K、LAP2-40K修饰条件确证SEC-HPLC检测
实施例4反应温度对式A-20K与rhNGF修饰反应的影响
方法同反应1，仅在反应1基础上增加温度25±2℃反应条件，结果见图8。从结果可以看出，在温度5±3℃、25±2℃条件下均可实现式A-20K与rhNGF的高效修饰。
实施例5反应时间对式A-20K与rhNGF修饰反应的影响
方法同反应1，仅在反应1基础上增加1h、2h、4h、6h、8h、24h反应时间点，结果见图9。从结果可以看出，反应时间≥2h均可实现式A-20K与rhNGF的高效修饰。
实施列5式A修饰的rhNGF在大鼠体内的药代动力学研究
一、实验目的：未修饰和不同聚合物修饰的rhNGF在大鼠体内半衰期比较
二、对照药物和实验药物：
未修饰的rhNGF
LAP1-20K(单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰rhNGF，分子量为20KDa)
式A修饰的rhNGF：LAP2-20K和LAP2-40K
三、实验方法：
采用7-9周龄SD大鼠，每组6只，雌雄各半，分别单次肌肉注射30μg/kg rhNGF、LAP1-20K、LAP2-20K、LAP2-40K；
分别于注射前、注射后5min，10min，30min，1h，2h，4h，6h，8.167h，12h，24h，48h采血，分离血清；
利用ELISA法测定药物浓度，将药物浓度与时间数据按照非房室模型法(NCA)进行代谢动力学参数计算，分析rhNGF修饰前后在大鼠体内的药代动力学特征。
四、实验结果：如表4所示。
表4大鼠单次肌肉注射修饰前后rhNGF的药代动力学参数(n＝6)
从结果可以看出，
1、半衰期
rhNGF的半衰期为2.674小时；
对照药物LAP1-20K(单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰rhNGF)半衰期为9.814小时；
本发明的两个式A修饰的rhNGF LAP2-20K、LAP2-40K的半衰期分别为19.862、42.858小时，比未修饰的rhNGF的半衰期分别延长7.4倍、16倍；
比对照药物半衰期也有显著延长约2～5倍。
2、血药浓度
本发明的两个式A修饰rhNGF分子有效血药浓度提高8倍以上，AUC提高至少30倍，且LAP2-20K、LAP2-40K各项药代动力学参数均优于LAP1-20K。
五、实验结论：
本发明的修饰rhNGF，相较于未修饰的rhNGF以及单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的rhNGF，均具有更高的体内血药浓度、更长的体内半衰期。
实施例6 TF-1细胞/MTS比色法测定修饰的重组人神经生长因子的生物学活性
一、实验目的：
考察本发明的修饰rhNGF对rhNGF生物学活性的影响
二、实验材料和方法：
将生长状态良好的人红细胞白血病细胞(TF-1细胞，已驯化的NGF依赖型，来源为中国食品药品检定研究院重组蛋白室)，用基础培养基(1640+10％FBS)以5000个细胞每孔的量接入96孔板，每孔体积100μL；
然后每孔分别加入100μL以基础培养基3倍梯度稀释的待测rhNGF、LAP2-20K、LAP2-40K溶液，浓度设置为36、12、4、1.33、0.44、0.15、0.049、0.016nM，每浓度两个复孔；
混匀后放入37℃，5％CO2培养箱中培养72h；
每孔加入20μL MTS，37℃，混匀孵育3h；
于酶标仪492nm处检测各孔的OD值；以OriginPro 8软件拟合各组的吸光值-浓度关系曲线。
三、实验结果：
如图10所示，从刺激TF-1细胞增殖曲线可以看出，LAP2-20K、LAP2-40K均可剂量依赖性刺激TF-1细胞的增殖。
四、实验结论：
本发明提供的修饰的rhNGF保留了rhNGF促TF-1细胞增殖的生物学活性。
序列表
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<120> 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法
<160> 2
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
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115 118
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
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Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val
115 117

Claims (8)

1.一种修饰的重组人神经生长因子，结构如式B所示：
式B
式B中，rhNGF 是重组人神经生长因子，是由2条相同的单链氨基酸形成的二聚体；所述单链氨基酸选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列；
所述式B化合物的制备方法，由式A聚合物与重组人神经生长因子进行反应得到：
所述式A聚合物是N-二取代氨基乙酰胺基醛衍生物的聚合物，重均分子量为10kD~40kD；
式A
式A和式B中，m为1或2。
2.权利要求1所述的修饰的重组人神经生长因子，所述式A聚合物的重均分子量为20kD或40kD。
3.式A聚合物在制备延长半衰期的重组人神经生长因子的用途，
式A
所述式A聚合物是N-二取代氨基乙酰胺基醛衍生物的聚合物，重均分子量为10kD~40kD；式A中，m为1或2；
所述重组人神经生长因子是由2条相同的单链氨基酸形成的二聚体；所述单链氨基酸选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
4.权利要求1所述的修饰的重组人神经生长因子在制备延长半衰期的促神经生长的药物中的用途。
5.含权利要求1所述的修饰的重组人神经生长因子的药物。
6.权利要求1所述的修饰的重组人神经生长因子的制备方法，由式A聚合物与重组人神经生长因子进行反应得到；所述反应是在还原剂氰基硼氢化钠作用下进行，其中：式A聚合物与重组人神经生长因子的摩尔比为1~2：1；还原剂氰基硼氢化钠的终浓度为20mM；
所述重组人神经生长因子是由2条相同的单链氨基酸形成的二聚体；所述单链氨基酸选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
7.权利要求6所述的制备方法，反应溶剂为醋酸/醋酸钠缓冲液，反应体系的pH值为5.0~5.8。
8.权利要求6所述的制备方法，反应温度：5±3℃或25±2℃；反应时间：2h~24h。
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