CN110790822B - 可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用,所述多肽衍生物可以模拟PDGF蛋白的生物学活性,即促进成纤维细胞增殖、迁移,生产方法简单、分子量较小、产率大、成本低,产物化学结构明确。所述多肽衍生物能够在水溶液中自组装,形成纳米纤维,可有效修复辐射引起的皮肤损伤。所述可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物的序列为X‑Phe‑Phe‑Gly‑Val‑Arg‑Lys‑Lys‑Pro,其中,端基X为含芳香基团的端基。
Description
技术领域
本发明涉及一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用。
背景技术
皮肤是人体面积最大的器官,主要由表皮、真皮和皮下组织构成。一般来说表皮层的破损很容易修复且不会产生疤痕,但一旦真皮层受到了破坏便很难愈合。在癌症的放射治疗中,电离辐射在杀死癌细胞的同时会对人体的正常组织造成损伤,约95%的患者都会出现因电离辐射导致的皮肤损伤等副作用。目前治疗电离辐射损伤的方法主要有两种:细胞因子疗法和干细胞疗法。细胞因子治疗是能够预防或减少急性辐射综合征的主要策略,造血生长因子在刺激造血恢复方面尤其有效。然而,由于辐射损伤后会导致干细胞和祖细胞的大量凋亡,因此细胞因子的治疗只仅限于中等辐射剂量范围内(全身辐射3-7Gy)。干细胞治疗是实验室开发的一种很有前途的方法,可以用于治疗严重辐射损伤,一般选用从骨髓、脂肪组织、脐带等多种人体组织中提取的间充质干细胞(MSCs),通过替代作用和旁分泌作用来治疗辐射损伤。但这两种治疗方式均存在组织特异性差、作用机制不清楚、疗效不稳定等缺点,其临床应用受到了很大的限制。因此亟需开发出一种简单有效的药物来修复辐射造成的皮肤损伤。
血小板衍生因子(PDGF)是一种重要的促有丝***因子,具有刺激特定细胞群***增殖的能力,如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、小鼠成肌细胞、间充质干细胞等。参与调节包括细胞迁移、分化和凋亡在内的众多细胞过程。在原肠胚的形成和发展、早期造血和血管形成中发挥着重要的作用。当人体某个组织受损时,血小板释放出几种生长因子,其中最主要的是血小板衍生因子(PDGF),它能够刺激邻近的***细胞生长。这些***细胞是重建受损组织、愈合创口的先锋队。因此,PDGF对于重度烧伤、伤口愈合、皮肤癌患者等,是很好的良药。
PDGF家族是由PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D这四种不同的单体多肽链二聚形成的PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD这五个成员组成的。其中PDGF-AA和PDGF-BB具有广泛的促进细胞增殖、迁移、抵抗细胞凋亡、创伤修复等众多生物学活性。PDGF-BB作为最具特征的PDGF家族成员,近些年受到了研究人员的广泛关注,X射线衍射的晶体结构表明其每条多肽链都是由两股反向平行的β折叠组成,左右两端由3个LOOP环相连接,其中LOOP1和LOOP3环对于其与受体的结合非常重要。2010年He等人研究发现游离的PDGF-B链上的LOOP1环原本是无序的,当PDGF-BB与受体接触之后才进一步形成有序大环路,再与LOOP3环一起像夹子一样将PDGF受体牢牢的固定住。
受上述研究结果的启发,研究人员试图通过截取PDGF-BB多肽链上与受体结合相关的一段氨基酸序列来模拟其生物学活性。例如,在1992年Heldint等人将PDGF-B链上的第97-180个氨基酸序列进行分段合成得到18个独立的多肽链,再利用放射性标记测定其与PDGF受体的结合能力,最终筛选出第116-121个氨基酸序列ANFLVW和第157-163个氨基酸序列EIVRKKP这两段序列直接与受体结合相关。于是他们简单的将这两段连接到一起直接合成了ANFLVWEIVRKKP这13肽。但遗憾的是,最终发现这是一个PDGF受体拮抗剂,它并不能引起受体的二聚和自磷酸化,进而没有生物学活性。直到2007年Zamora等人第一次合成了PDGF激动剂,它是选取了PDGF-B链上的第153-162个氨基酸序列VRKIEIVRKK和一段能够与肝素结合的区域RKRKLERIAR(肝素能够辅助生长因子与受体结合),通过在序列前各加入半胱氨酸C,利用其侧链上的巯基来形成二硫键促使多肽链成环,来进一步模拟PDGF。这样的设计固然非常巧妙,但较长的序列致使其最终分子量达到了4497.63Da,并且由于需要将两个半胱氨酸再连接成环,所以制作工艺上更加复杂、产率也相应地降低了很多。最终合成出来的多肽虽然与PDGF受体有较强的作用力,但其细胞增殖实验反映出其在1μg/ml的浓度下才能够达到与PDGF蛋白生物学活性相当的水平。综上所述,试图通过截取PDGF中与受体结合相关的序列结构进行简单连接、和/或者模拟PDGF与受体结合中起重要作用的环状结构的方式来获取可以模拟PDGF生物学活性的多肽的研究思路的实际效果并不理想。
目前已经商业化的PDGF蛋白主要是从大肠杆菌或酵母中提取的重组人血小板衍生因子(rhPDGF)。然而其存在诸多问题:生产成本高,生产流程难以严格控制,批次间质量难以保证,工业化有难度;易失活、保存条件苛刻、需要冷链运输;因分子量过大难以透皮吸收,只能通过肌肉注射和静脉注射的方式给药,同时直接注射到体内后很容易降解,组织滞留率低、半衰期短等,这些问题极大地限制了其进一步的实际应用。
发明内容
鉴于此,本发明提供一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用,所述多肽衍生物可以模拟PDGF蛋白的生物学活性,即促进成纤维细胞增殖、迁移,生产方法简单、分子量较小、产率大、成本低,产物化学结构明确。所述多肽衍生物能够在水溶液中自组装,形成纳米纤维,可有效修复辐射引起的皮肤损伤。
具体而言,包括以下的技术方案:
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物,所述多肽衍生物的序列为X-Phe-Phe-Gly-Val-Arg-Lys-Lys-Pro(以下简称为X-FFGVRKKP),其中,端基X为含芳香基团的端基。根据本领域公知常识,所述氨基酸构型未作限定时,均视为L构型。
优选的,所述端基X为Nap、Fbp、Car或Npx。Nap、Fbp、Car、Npx为本领域公知公用的端基。更优选的,所述端基X为Nap。
具体的,所述端基X为Nap时所述短肽的结构式如下:
X为Fbp时所述短肽的结构式如下:
X为Car时所述短肽的结构式如下:
X为Npx时所述短肽的结构式如下:
所述多肽衍生物采用公知的FMOC-短肽固相合成方法合成。具体的,该多肽衍生物的制备方法,包括如下步骤(以端基X为Nap为例):
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合;
(2)Fmoc保护基的脱除,洗涤;
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联,洗涤;
(4)重复(2)~(3)步,直到最后一个氨基酸偶联完毕,脱除Fmoc保护基,洗涤;
(5)2-萘乙酸与树脂上多肽的N端偶联、洗涤;
(6)多肽衍生物从树脂上切除,得到粗产品;
(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。
根据本发明的第二方面,提供了所述多肽衍生物的纳米纤维,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成所述纳米纤维。当所述多肽衍生物的水混合物浓度达到毫摩尔级别时,可以形成超分子水凝胶。作为本领域的公知常识,超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子化合物通过非共价键作用相互聚集,自组装得到网状结构并包裹水分子而形成的凝胶。
进一步的,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的具体方法为:将所述多肽衍生物加入到pH=5.0~9.0的PBS溶液中,用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至6.0~7.0,加热至沸腾使化合物完全溶解,冷却到室温即制得浓度为5nM~1μM的含有多肽衍生物的纳米纤维的混合物。
根据本发明的第三方面,提供了所述纳米纤维在制备修复皮肤损伤药物中的应用。
发明人发现,所述多肽衍生物能够与PDGF蛋白受体结合,激发下游信号通路,促进细胞增殖和迁移。所述细胞可以为小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)、血管平滑肌细胞(VSMC)、小鼠成肌细胞(C2C12)、间充质干细胞(MSC)。
所述药物可以通过本领域常用的肌肉注射的方式进行治疗。同时,由于本发明所述多肽衍生物分子量较小,根据常识,可以通过透皮吸收的方式进行治疗。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果至少包括:
1、本发明制备工艺简单,产物化学结构明确,所用原料均为人体每天所必需的氨基酸,可以通过固相合成的方法制得多肽衍生物,分子量较小、生产工艺简单、产率大、成本低、生物相容性好;
2、所述多肽衍生物能够与PDGF蛋白受体结合,激发下游信号通路,促进小鼠成纤维细胞的增殖和迁移;
3、所述多肽衍生物可有效修复辐射引起的皮肤损伤,实验结果表明治疗效果出乎意料地优于PDGF蛋白。发明人分析,所述多肽衍生物纳米纤维的微观结构可能对于结果有一定贡献,所述纳米纤维微观结构能够在体内缓慢释放,有效抵抗体内蛋白酶的降解,显著延长了其体内半衰期、提高了组织滞留率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Nap-FFGVRKKP的高分辨质谱图。
图2为Nap-FFGVRKKP与PDGF受体蛋白结合常数测定图。
图3为Nap-FFGVRKKP促进小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)增殖的效果图。
图4为Nap-FFGVRKKP促进小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)迁移的效果图。
图5为Nap-FFGVRKKP修复小鼠辐射皮肤损伤的效果图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物,所述多肽衍生物的序列为X-FFGVRKKP,其中,端基X为含芳香基团的端基。
优选的,所述端基X为Nap、Fbp、Car或Npx。Nap、Fbp、Car、Npx为本领域公知公用的端基。更优选的,所述端基X为Nap。
具体的,X为Nap时所述短肽的结构式如下:
X为Fbp时所述短肽的结构式如下:
X为Car时所述短肽的结构式如下:
X为Npx时所述短肽的结构式如下:
所述多肽衍生物采用公知的FMOC-短肽固相合成方法合成。具体的,该多肽衍生物的制备方法,包括如下步骤(以端基X为Nap为例):
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合;
(2)Fmoc保护基的脱除,洗涤;
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联,洗涤;
(4)重复(2)~(3)步,直到最后一个氨基酸偶联完毕,脱除Fmoc保护基,洗涤;
(5)2-萘乙酸与树脂上多肽的N端偶联、洗涤;
(6)多肽衍生物从树脂上切除,得到粗产品;
(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。
根据本发明的第二方面,提供了所述多肽衍生物的纳米纤维,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成所述纳米纤维。当所述多肽衍生物的水混合物浓度达到毫摩尔级别时,可以形成超分子水凝胶。作为本领域的公知常识,超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子化合物通过非共价键作用相互聚集,自组装得到网状结构并包裹水分子而形成的凝胶。
进一步的,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的具体方法为:将所述多肽衍生物加入到pH=5.0~9.0的PBS溶液中,用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至6.0~7.0,加热至沸腾使化合物完全溶解,冷却到室温即制得浓度为5nM~1μM的含有多肽衍生物的纳米纤维的混合物。
根据本发明的第三方面,提供了所述纳米纤维在制备修复皮肤损伤药物中的应用。
发明人发现,所述多肽衍生物能够与PDGF蛋白受体结合,激发下游信号通路,促进细胞增殖和迁移。所述细胞可以为小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)、血管平滑肌细胞(VSMC)、小鼠成肌细胞(C2C12)、间充质干细胞(MSC)。
所述药物可以通过本领域常用的肌肉注射的方式进行治疗。同时,由于本发明所述多肽衍生物分子量较小,根据常识,可以通过透皮吸收的方式进行治疗。
以下实施例中所涉及制剂来源如下:
2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司,活性1.2mmol/mL;
N,N-二异丙基乙胺(以下用DIEPA表示),购自阿达玛斯公司(Adamas),纯度99%;
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度98%;
三氟乙酸(以下用TFA表示),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度99%;
三异丙基硅烷(以下用TIS表示),购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),纯度99%;
所有氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司,纯度98%;
EdU染色试剂盒、1%结晶紫染色液、苏木素-伊红染色液、马氏染色液均购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich);
DMEM高糖培养基、胎牛血清购自天津智得生物科技有限公司;
小鼠成纤维细胞NIH 3T3,购自上海歌凡生物;
6-8周龄雌性Balb/c小鼠、均购自北京维通利华实验动物技术有限公司;
PDGF蛋白,购自Acro biosystems公司,纯度98%。
制备实施例1:
多肽衍生物Nap-FFGVRKKP及其纳米纤维的合成与制备
(1)Nap-FFGVRKKP的固相合成
具体步骤如下:
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中,加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示),放置在摇床上摇晃5min,使2-Cl-Trt树脂充分溶胀;
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净;
3)将0.75mmol Fmoc-Pro溶解在10mL的无水DCM里,加入0.75mmol的DIPEA,然后转移到上述固相合成器中,再补加0.75mmol的DIPEA,在室温下反应1h;
4)封闭:用洗耳球除去固相合成器中的反应液,然后用10mL无水DCM洗涤,每次1min,共洗5次,加入配好的体积比为无水DCM∶DIPEA∶甲醇=17∶1∶2的溶液20mL,在室温下反应10min;
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液,先用无水DCM洗涤,每次DCM用量10mL、洗涤时间1min,共洗5次,再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤,每次DMF用量10mL、洗涤时间1min,共洗5次,加入10mL含体积百分比为20%的哌啶的DMF,反应25min,再用10mL含体积百分比为20%的哌啶的DMF反应5min,然后用DMF洗涤,每次DMF用量10mL、洗涤时间1min,共洗5次,进行下一步反应;
6)加入的Fmoc-Lys 1mmol、HBTU 1.5mmol、DIPEA 2mmol和10mLDMF,把配好的溶液加入到上述固相合成器中,反应2h;
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-Phe、2-萘乙酸,然后用DMF洗涤5遍,DCM洗5遍,进行下步反应;
8)按95%TFA,2.5%TIS,2.5%H2O体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中,反应半小时(或者TFA与DCM的体积比为1∶99,配制成体积百分比浓度为1%的TFA溶液,取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中,共加十次,每次反应时间为1min),把产物从2-Cl-Trt树脂上切下,真空浓缩,除去溶剂,得到粗品,之后用HPLC分离提纯,得到多肽衍生物Nap-FFGVRKKP,产率为80%。图1为Nap-FFGVRKKP的高分辨质谱图。通过分子结构绘制软件Chemdraw计算可得Nap-FFGVRKKP分子量为1146.3821,图中所示主峰分子量为1146.6449,与计算结果差距小于1,以上结果说明使用本发明方法合成的化合物的分子量与计算所得相吻合,证明Nap-FFGVRKKP成功合成。
(2)多肽衍生物的纳米纤维的制备
称取1.0mg纯化后的多肽衍生物Nap-FFGVRKKP,置于2mL的玻璃瓶中,加入500μLPBS溶液(pH=7.4),用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,加热至沸腾使化合物完全溶解,冷却到室温之后即得无色透明可倒置水凝胶。成胶与否通过本领域公知的方法判断,如采用倒置瓶子的方法判断,保留在瓶子底部为水凝胶,如果是流动的则为液体。
称取1.1mg纯化后的多肽衍生物Nap-FFGVRKKP,置于2mL的玻璃瓶中,加入1mL PBS溶液(pH=7.4),用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,加热至沸腾使化合物完全溶解,用微量取样器吸取1μL加入到999μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到1μM的Nap-FFGVRKKP溶液;用微量取样器吸取5μL浓度为1μM的Nap-FFGVRKKP溶液加入到995μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到5nM的Nap-FFGVRKKP溶液。经电镜照片显示浓度为1μM和5nM的Nap-FFGVRKKP溶液的内部结构均为纳米纤维。
采用微尺度热泳法测定多肽衍生物Nap-FFGVRKKP与PDGF受体蛋白的结合常数,使用单分子NT蛋白标记试剂盒,用荧光染料NT-647标记PDGF受体蛋白。采用含0.05%吐温-20(pH 7.4)的PBS缓冲液作为检测缓冲液。保持带有荧光标记的PDGF受体蛋白的浓度为10μM不变,而Nap-FFGVRKKP形成的水凝胶的浓度从2μM开始倍比稀释至0.054nM,得到一系列浓度梯度的溶液。然后将荧光蛋白溶液与不同浓度的溶液按1:1体积比混合。孵育1分钟后,将样品装入NT.115标准玻璃毛细管中,利用NT.115单体体系进行分析。KD值采用NanoTemper软件包计算。图2为Nap-FFGVRKKP与PDGF受体蛋白结合常数测定图。图中所示结合常数为117.96nM,说明Nap-FFGVRKKP与PDGF受体蛋白有特异性的相互结合作用。
对比制备例1
无菌1×PBS
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。用高压灭菌锅灭菌后,保存于室温或4℃冰箱中。
对比制备例2
(1)参照制备实施例1,用FMOC-短肽固相合成方法合成对照多肽衍生物Ac-Val-Arg-Lys-Lys-Pro(以下简称为Ac-VRKKP):区别仅在于(1)固相合成的步骤7)中依次加入Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-Phe、2-萘乙酸,改为依次加入Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-Val、乙酸酐。
(2)称取0.66mg纯化后的对照多肽衍生物Ac-VRKKP,置于2mL的玻璃瓶中,加入1mLPBS溶液(pH=7.4),用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,加热至沸腾使化合物完全溶解,冷却下来后将瓶子倒置过来发现没有形成水凝胶而是流动的溶液,得到浓度为1mM的Ac-VRKKP溶液。用微量取样器吸取1μL浓度为1mM的Ac-VRKKP溶液加入到999μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到1μM的Ac-VRKKP溶液;用微量取样器吸取5μL浓度为1μM的Ac-VRKKP溶液加入到995μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到5nM的Ac-VRKKP溶液。
对比制备例3
称取1.23mg PDGF蛋白粉末,置于2mL的玻璃瓶中,加入1mL PBS溶液(pH=7.4),用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4,得到浓度为50μM的PDGF蛋白溶液。用微量取样器吸取20μL浓度为50μM的PDGF蛋白溶液加入到980μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到1μM的PDGF蛋白溶液;用微量取样器吸取5μL浓度为1μM的PDGF蛋白溶液加入到995μL的PBS溶液中,再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到5nM的PDGF蛋白溶液。
细胞实施例1:
多肽衍生物Nap-FFGVRKKP的纳米纤维在细胞层面的活性测试
(1)成纤维细胞增殖实验
1)把水浴锅提前升温至37℃,将培养基、血清等放入水浴锅预热,并且同时打开超净台紫外灯照射半小时;
2)从液氮罐中取出冻存的小鼠成纤维细胞NIH 3T3,迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻,之后迅速转移到超净台里进行如下操作:把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中,离心3min,去上清,用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基重悬,转移到培养皿中,然后放入37℃培养箱中培养;
3)第二天观察细胞状态,待细胞状态良好后,传一代以后进行下面的实验;
4)加2mL胰酶,轻轻晃动,均匀覆盖,轻敲培养皿底,37℃消化3min,显微镜下观察大多数细胞悬浮,1mL枪吹打5-10下,加2mL培养基,吹打均匀,收集细胞培养液,吸入到离心管中,1000rpm转速下离心3min,之后弃掉上清溶液,加入含有10%的胎牛血清的DMEM培养基用枪吹打均匀,用细胞计数板计数为每毫升含有5×107个细胞。
5)将细胞重悬于96孔板,每孔5000个细胞100μL含有10%的胎牛血清的DMEM培养基,37℃培养箱中过夜培养。第二天吸出DMEM培养基换成无血清的DMEM培养基,进行饥饿处理4h,之后加入含有不同浓度Nap-FFGVRKKP的无血清的DMEM培养基每孔100μL,向Control组中加入1ml的不含任何多肽衍生物并且无血清的DMEM培养基。37℃培养箱中孵育48h之后每孔加入10μL CCK-8和90μL无血清的DMEM培养基,4h后用酶标仪测定450nm处的OD值。
图3为Nap-FFGVRKKP促进小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)增殖的效果图。图中Control柱状图代表NIH 3T3在不含Nap-FFGVRKKP的细胞培养基中培养48小时的细胞数目(设为100%),其他柱状图代表NIH 3T3在含有不同浓度Nap-FFGVRKKP的培养基中培养48小时后的细胞数目(相对于Control组的百分比),在1nM到100nM浓度范围内,含有Nap-FFGVRKKP的培养基中NIH3T3的细胞数目均大于Control组,说明Nap-FFGVRKKP具有促进NIH3T3增殖的功能。
(2)PDGF自组装多肽水凝胶促进小鼠成纤维细胞迁移实验
1)重复上面细胞增殖实验的1)-4)步骤后,将细胞重悬于六孔板,每孔10万个细胞和1mL含有10%的胎牛血清的DMEM培养基,37℃培养箱中过夜培养。
2)第二天通过用移液器枪头笔直在孔板底部划出同一宽度线的方法来人工制造划痕,换成无血清培养基对细胞进行饥饿处理12h之后,再分别加入含5nM的Ac-VRKKP、Nap-FFGVRKKP、PDGF蛋白的无血清DMEM培养基各1mL,向Control组中加入1ml的不含任何多肽衍生物并且无血清的DMEM培养基。继续培养16h后用1%的结晶紫染色,观察细胞向划痕区域的迁移生长情况。
3)每组随机选取3个视野进行拍照,对迁移到划痕内部的细胞进行计数,统计各组之间的差异性。
图4为Nap-FFGVRKKP促进小鼠的成纤维细胞(NIH 3T3)迁移的效果图。人工制造划痕后在无血清的培养基继续培养16小时后,用1%的结晶紫对细胞进行染色,观察细胞向划痕区域的迁移生长情况。图中Control柱状图代表NIH 3T3在无血清细胞培养基中培养16小时后细胞迁移的数目,其他柱状图依次代表在含有5nM的Ac-VRKKP、Nap-FFGVRKKP、PDGF蛋白的无血清培养基中培养16小时后细胞迁移的数目,能够发现含有Nap-FFGVRKKP的培养基中NIH 3T3的迁移数量最多,说明Nap-FFGVRKKP具有促进NIH 3T3迁移的功能。
损伤修复实施例1:
PDGF自组装多肽水凝胶对辐射皮肤损伤的修复实验
1)模型建立:选用6~8周龄雌性BALB/c小鼠,150μL 4%的水合氯醛麻醉后,将其左后肢皮肤暴露于40Gy X射线照射下,剂量率为2Gy/min,持续20min(生物X射线照射器,Rad源,RS2000)。
2)给药治疗与统计:建模成功后,将小鼠随机分为四组,每组10只,在不同组别小鼠的损伤皮肤分别原位肌肉注射100μL含1μM的Ac-VRKKP、Nap-FFGVRKKP、PDGF蛋白溶液,Control组中为加入100μL的PBS。之后每周观察损伤部位状况并拍照,利用激光多普勒超声仪定期监测表面的炎症变化情况,统计小鼠皮肤修复情况。其中未照射组的小鼠没有被照射X射线,也不被肌肉注射多肽或PBS等任何溶液。
3)组织切片染色:在第60天实验结束后将所有小鼠脱颈处死,选取损伤处皮肤制作石蜡切片,用苏木素-伊红染色观察皮肤表皮层和真皮层受损后的修复情况,用马氏染色观察胶原纤维的合成和沉积情况,用CD68标记巨噬细胞免疫荧光染色观察炎症情况。
图5为Nap-FFGVRKKP修复小鼠辐射皮肤损伤的效果图。在辐射损伤的第0天,每组小鼠分别原位注射1μM的Ac-VRKKP、Nap-FFGVRKKP、PDGF蛋白进行治疗,之后利用激光多普勒超声仪定期监测表面的血液灌注量。炎症是具有血管***的活体组织对损伤因子所发生的防御反应,血管反应是炎症过程的中心环节,所以皮肤表面的血液灌注量的高低可以反应炎症的强弱。从图中可以看出在第18天的时候除了未照射组外均出现了一定的炎症情况且各组之间相差不大,在第30天的时候Control组炎症进一步加剧,但Nap-FFGVRKKP组的炎症得到了极大的缓解,和未照射组相差不大,效果甚至出乎意料地优于PDGF组,表明Nap-FFGVRKKP能够有效修复小鼠辐射皮肤损伤。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案,并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物,其特征在于,所述多肽衍生物的序列为X- Phe- Phe- Gly- Val- Arg- Lys- Lys- Pro,其中,所述端基X为Nap。
2.包含权利要求1所述多肽衍生物的纳米纤维,其特征在于,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成所述纳米纤维。
3. 如权利要求2所述的纳米纤维,其特征在于,将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的具体方法为:将所述多肽衍生物加入到pH=5.0~9.0的PBS 溶液中,用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其 pH 值调节至6.0~7.0,加热至沸腾使化合物完全溶解,冷却到室温即制得浓度为5 nM~1 μM的含有多肽衍生物的纳米纤维的混合物。
4.权利要求2或3所述的纳米纤维在制备修复皮肤损伤药物中的应用。
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