CN113820429A - 采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，包括如下步骤：配制试剂‑配制标准溶液‑设定液质联用仪参数‑提取试样‑净化‑结果分析。本发明采用液质联用仪建立了酿酒原料大麦小麦中苯磺隆及2甲4氯的检测方法，样品前处理简单，仪器灵敏度高，降低了仪器检测限和方法定量限；检测灵敏度高、重复性好、分析速度快，检测效率高，适合企业对酿酒原料中苯磺隆及2甲4氯的检测。
Description
技术领域
本发明属于物理测量测试色谱法测定技术领域，具体涉及一种采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法。
背景技术
白酒酿造时需要用到酒曲，酒曲主要又分为大曲、小曲和麸曲。大曲的原料主要是大麦和小麦；小曲的主要原料有大米、高粱、玉米、稻谷、小麦等。因此，从白酒常见的酒曲来看，大麦和小麦为酿酒原粮的主要原料。而酿酒的大麦、小麦制品中，除草剂的残留问题一直存在，亟待解决。现有技术中，大麦小麦中检测苯磺隆和2甲4氯除草剂的方法样品处置较为复杂；仪器灵敏度检测有时无法满足检测需求；原粮加标回收率较低；检测灵敏度、重复性、分析速度无法满足检测要求。对此，现提出如下改进技术方案。
发明内容
本发明解决的技术问题：提供一种采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，解决大麦小麦中苯磺隆和2甲4氯检测样品处置复杂；仪器灵敏度无法满足检测需求；检测重复性、分析速度无法满足检测要求的技术问题。
本发明采用的技术方案：采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，包括如下步骤：
S001、配制试样提取试剂；
S002、配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液；
S003、设定液质联用仪参数；
S004、提取试样；
S005、净化；
S006、结果分析。
上述技术方案中，进一步地：步骤S001包括如下步骤：
S0011、制备0.1％甲酸溶液；
S0012、制备体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸溶液。
上述技术方案中，进一步地：步骤S002包括如下步骤：
S0021、配制苯磺隆标准储备液和2甲4氯标准储备液；
S0022、移取苯磺隆标准储备液配制苯磺隆标准中间液；移取2甲4氯标准储备液配制2甲4氯标准中间液；
S0023、移取磺隆标准中间液和2甲4氯标准中间液配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液。
上述技术方案中，进一步地：步骤S0021中的苯磺隆标准储备液浓度为100μg/mL；步骤S0021中的2甲4氯标准储备液浓度为100μg/mL；步骤S0022中的苯磺隆标准中间液浓度为1μg/mL；步骤S0022中的2甲4氯标准中间液浓度为2μg/mL；步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液浓度包括：200/1000ng/mL、100/500ng/mL、50/100ng/mL、20/50ng/mL、10/20ng/mL、5/10ng/mL、1/5ng/mL。
上述技术方案中，进一步地：步骤S003液质联用仪的参数包括：液相色谱条件参数和质谱条件参数；所述液相色谱条件参数包括色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII；进样量：10μL；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动相B：甲醇；柱温：30℃；流速：0.25mL/min；驻留时间：100ms；洗脱方式：二元高压梯度；所述质谱条件参数包括检测方式：多级反应监测MRM；离子源：ESI；苯磺隆采用正离子扫描模式，2甲4氯采用负离子扫描模式；加热块温度：400℃；雾化气流量：3.0L/min；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min；驻留时间：100ms。
上述技术方案中，进一步地：步骤S004中：称取粉碎后的酿酒原料于离心管中，加入体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸，漩涡提取5min后加入氯化钠，漩涡振荡后离心处理得到待净化的上清液。
上述技术方案中，进一步地：步骤S005中：取步骤S004得到的上清液，将上清液转入加有C18的离心管中涡旋离心处理，将旋涡离心处理后的上清液过有机滤膜后置于进样瓶中，等待检测。
上述技术方案中，进一步地：步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液按照步骤S003设定的液质联用仪参数进行外标法定量测定；以苯磺隆、2甲4氯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；苯磺隆在1～200ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝67472.1X+74967.9，相关系数r为0.9998379，方法定量限为0.44μg/kg；2甲4氯在5～1000ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝40828.5X-108813，相关系数r分别为0.9999770，方法定量限为0.84μg/kg；苯磺隆和2甲4氯的检出限均＜0.05μg/kg。
上述技术方案中，进一步地：步骤S006包括精密度试验：选择步骤S0023中浓度为50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液，分别连续测定至少6次；浓度50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液的保留时间、峰面积、浓度的相对标准偏差RSD值均小于5％。
上述技术方案中，进一步地：步骤S006包括回收率试验：在粉碎后的酿酒原料中加入不同浓度的苯磺隆-2甲4氯标准溶液，得到多个不同浓度的样品；将多个不同浓度的样品按照步骤S004、步骤S005的方法对样品进行处理，测定样品回收率；测定的回收率在89％～110％之间。
本发明与现有技术相比的优点：
1、本发明采用液质联用仪建立了酿酒原料大麦、小麦中苯磺隆及2甲4氯的同时检测方法，样品前处理相对简单，流动相选择甲醇—0.1％甲酸溶液，仪器灵敏度高，且降低了仪器检测限和方法定量限。
2、本发明所绘制标准曲线线性关系良好，r>0.999；苯磺隆、2甲4氯方法定量限分别为0.44μg/kg、0.84μg/kg；检出限＜0.05μg/kg，均低于国标及其他检测方法。
3、本发明原粮加标回收率均在89％-110％之间，完全符合要求。
4、本发明方法采用HPLC-MS/MS检测灵敏度高、重复性好、分析速度快，8min即可完成样品中苯磺隆和2甲4氯的检测；相比于UPLC-MS/MS检测成本低，效率高，更适合企业对酿酒原料中苯磺隆及2甲4氯的检测。
附图说明
图1为本发明苯磺隆MRM色谱图一；
图2为本发明苯磺隆离子质谱图二；
图3为本发明2甲4氯MRM色谱图一；
图4为本发明2甲4氯离子MRM质谱图二；
图5为本发明苯磺隆标准曲线；
图6为本发明2甲4氯标准曲线；
图7为本发明苯磺隆和2甲4氯MRM色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图1-7，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是：本发明的试样原粮为小麦、大麦。
本发明使用的材料：50mL、10mL的离心管、0.22μm有机滤膜、C18硅胶交联吸附剂、天津博纳艾杰尔科技有限公司的石墨化炭黑吸附剂GCB和N-丙基乙二胺键合固相吸附剂PSA。
本发明使用的标准品：苯磺隆(安谱，纯度≥98％)、2甲4氯(纯度≥97％，)
本发明使用的试剂：乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、超纯水、甲酸、经130℃烘干6h，冷却后备用的氯化钠；除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。
本发明使用的仪器设备：岛津LCMS-8045高效液相色谱串联质谱仪、梅特勒-托利多，感量0.0001g的分析天平、涡旋混合器、LXJ-ⅡB上海安亭科学仪器厂的低速大容量多管离心机、DH-2000R上海德洋意邦仪器有限公司的台式高速冷冻离心机。
本发明采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，包括如下步骤：
步骤S001、配制试样提取试剂。步骤S001配制试样提取试剂包括如下步骤：
步骤S0011、制备0.1％甲酸溶液：移取1mL甲酸溶于水中，定容至1000mL，得到0.1％甲酸溶液。
步骤S0012、制备体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸溶液：移取999mL乙腈和1mL甲酸混合混匀得到体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸溶液。
步骤S002、配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液。
上述实施例中，步骤S002配制标准溶液包括如下步骤：
步骤S0021、配制苯磺隆标准储备液和2甲4氯标准储备液。
具体地：配制苯磺隆标准储备液：准确称取1.0mg(精确至0.0001g)苯磺隆标准品，用丙酮溶解并定容至10mL，配成100μg/mL的标准储备液，－18℃避光保存6个月，得到苯磺隆标准储备液。
具体地：配制2甲4氯标准储备液：准确称取1.0mg(精确至0.0001g)2甲4氯标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配成100μg/mL的标准储备液，0～4℃避光保存90d，得到2甲4氯标准储备液。
即上述实施例中，步骤S0021中的苯磺隆标准储备液浓度为100μg/mL。步骤S0021中的2甲4氯标准储备液浓度为100μg/mL。
步骤S0022、移取步骤S0021配制的苯磺隆标准储备液配制苯磺隆标准中间液；移取步骤S0021配制的2甲4氯标准储备液配制2甲4氯标准中间液。
具体地：配制苯磺隆标准中间液：准确移取步骤S0021配制的苯磺隆标准储备液0.1mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容，配成1μg/mL苯磺隆标准中间液，－18℃避光保存3个月得到苯磺隆标准中间液。
具体地：配制2甲4氯标准中间液：准确移取步骤S0021配制的2甲4氯标准储备液1mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，配成2μg/mL标准中间液，0～4℃避光保存30d，得到2甲4氯标准中间液。
即上述实施例中，步骤S0022中的苯磺隆标准中间液浓度为1μg/mL。步骤S0022中的2甲4氯标准中间液浓度为2μg/mL。
步骤S0023、移取步骤S0022配制的磺隆标准中间液和2甲4氯标准中间液配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液。
且步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液浓度包括：200/1000ng/mL、100/500ng/mL、50/100ng/mL、20/50ng/mL、10/20ng/mL、5/10ng/mL、1/5ng/mL。
具体地：准确移取步骤S0022配制的苯磺隆标准中间液2mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL、0.05mL、0.01mL分别至10mL容量瓶中，再依次分别加入步骤S0022配制的2甲4氯标准中间液5mL、2.5mL、0.5mL、0.25mL、0.1mL、0.05mL、0.025mL，用甲醇定容，配成浓度分别为200/1000ng/mL、100/500ng/mL、50/100ng/mL、20/50ng/mL、10/20ng/mL、5/10ng/mL、1/5ng/mL的苯磺隆/2甲4氯系列混合标准工作液，现配现用。
S003、设定液质联用仪参数。
上述实施例中，步骤S003液质联用仪的参数包括：液相色谱条件参数和质谱条件参数。
具体地：所述液相色谱条件参数包括色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII；C18(2.0mmI.D*150mm 3.0μm)。进样量：10μL；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动相B：甲醇；柱温：30℃；流速：0.25mL/min；驻留时间：100ms；洗脱方式：二元高压梯度。梯度洗脱条件参见表1：梯度洗脱条件
具体地：所述质谱条件参数包括检测方式：多级反应监测(MRM)；离子源：ESI；苯磺隆采用正离子扫描模式，2甲4氯采用负离子扫描模式。加热块温度：400℃；雾化气流量：3.0L/min；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min；驻留时间：100ms。
S004、提取试样。
具体地：步骤S004中：称取5g精确到0.01g粉碎后的酿酒原料大麦、小麦于50mL具塞离心管中，加入体积比为99.9：0.1的10ml乙腈-甲酸溶液，漩涡提取5min后加入1g氯化钠，漩涡振荡1mim后在4000r/min条件下离心5min处理得到待净化的上清液。
S005、净化。
具体地：步骤S005中：取步骤S004得到的待净化的上清液，将上清液转入加有50mgC18的10ml离心管中，涡旋离心处理1min，并在4000m/min条件下离心处理5min，将旋涡离心处理后的上清液过0.22μm有机滤膜后置于进样瓶中，等待检测。
S006、结果分析。
需要说明的是：关于样品提取溶剂的选择：本发明发明人分别研究了乙腈、甲醇；乙腈-甲酸(V：V＝99.9：0.1)；甲醇-甲酸(99.9：0.1)；含0.1％乙酸的乙腈-水(4：1)各自的提取效果。
试验结果表明：乙腈、甲醇；甲醇-甲酸(99.9：0.1)；含0.1％乙酸的乙腈-水(4：1)回收率为60％左右，偏低。而苯磺隆和2甲4氯属于酸性除草剂，在中性或碱性条件下呈离子状态，不易被乙腈提取，但在乙腈中添加体积分数为0.1％的甲酸可以抑制其在溶液中电离形成离子的速度，回收率得到明显改善，高于80％，能够满足残留分析要求。因此，最终选用乙腈-甲酸(体积比99.9：0.1)溶液作为提取溶剂。
关于净化方法的优化：采用分散固相萃取进行净化时，常用的三种吸附剂包括C18、GCB和PSA。其中，C18主要用于除去样品中的脂肪、胆固醇和色素。GCB可有效去除色素。PSA能有效去除极性脂肪酸类杂质。本发明通过在小麦中分别添加20μg/kg的苯磺隆和0.1mg/kg的2甲4氯，对比了50mg C18、GCB和PSA对杂质的净化效果及对目标农药的吸附作用。结果表明：使用PSA对小麦样品进行净化时，2甲4氯被完全吸附；而使用GCB和C18进行净化时，C18对目标农药的吸附较小，回收率高于使用GCB净化，苯磺隆和2甲4氯的回收率均在90％以上。因此最终选用50mg C18作为固相萃取吸附剂。
关于高效液相色谱条件：流动相不仅运载样品，而且对于物质的分离响应至关重要。本发明中苯磺隆-2甲4氯液质检测采用的流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液，该条件下的苯磺隆和2甲4氯响应值最高，色谱图、质谱图分别参见图1、图2，以及图3、图4所示。
关于质谱条件优化：本发明分别采用ESI正、负离子的多反应检测模式，对苯磺隆、2甲4氯MS条件进行优化，最终确定加热块温度400℃，DL温度250℃，雾化气流量3.0L/min，干燥气流量10L/min，驻留时间为100ms，在以上质谱条件下，对产物离子进行了自动优化，得到的MRM优化参数如表2。
表2化合物信息和MRM参数
上述实施例中，进一步地：步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液按照步骤S003设定的液质联用仪参数进行外标法定量测定；以苯磺隆、2甲4氯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；参见图5、图6。
其中：苯磺隆在1～200ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝67472.1X+74967.9，相关系数r为0.9998379，方法定量限为0.44μg/kg；2甲4氯在5～1000ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝40828.5X-108813，相关系数r分别为0.9999770，方法定量限为0.84μg/kg。苯磺隆和2甲4氯的检出限均＜0.05μg/kg。均低于国标检测方法。
上述实施例中，步骤S006包括精密度试验：选择步骤S0023中浓度为50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液，分别连续测定至少6次，以考察液质联用仪的精密度；检测结果如下表3：
表3精密度试验结果(n＝6)
结果显示：浓度50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液的保留时间、峰面积、浓度的相对标准偏差RSD均小于5％，精密度良好。
上述实施例中，进一步地：步骤S006包括回收率试验：在粉碎后的酿酒原料大麦小麦中加入不同浓度的苯磺隆-2甲4氯标准溶液，得到多个不同浓度的样品；将多个不同浓度的样品按照步骤S004、步骤S005的方法对样品进行处理，测定样品回收率；结果参见表4、表5。测定的回收率在89％～110％之间，安全符合要求。
表4回收率试验结果
表5回收率试验结果
通过以上描述可以发现：本发明采用液质联用仪建立了酿酒原料大麦小麦中苯磺隆及2甲4氯的检测方法，样品前处理相对简单，流动相选择甲醇—0.1％甲酸溶液，仪器灵敏度高，且降低了仪器检测限和方法定量限。本发明所绘制标准曲线线性关系良好，r>0.999；苯磺隆、2甲4氯方法定量限分别为0.44μg/kg、0.84μg/kg；检出限＜0.05μg/kg，均低于国标检测方法。再者，本发明原粮加标回收率均在89％-110％之间，完全符合要求。
综上所述，本发明方法检测灵敏度高、重复性好、分析速度快，检测效率高，检测成本较低，适合企业对酿酒原料中苯磺隆及2甲4氯的检测。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S001、配制试样提取试剂；
S002、配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液；
S003、设定液质联用仪参数；
S004、提取试样；
S005、净化；
S006、结果分析。
2.根据权利要求1所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S001包括如下步骤：
S0011、制备0.1％甲酸溶液；
S0012、制备体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸溶液。
3.根据权利要求1所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S002包括如下步骤：
S0021、配制苯磺隆标准储备液和2甲4氯标准储备液；
S0022、移取苯磺隆标准储备液配制苯磺隆标准中间液；移取2甲4氯标准储备液配制2甲4氯标准中间液；
S0023、移取磺隆标准中间液和2甲4氯标准中间液配制苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液。
4.根据权利要求3所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于：步骤S0021中的苯磺隆标准储备液浓度为100μg/mL；步骤S0021中的2甲4氯标准储备液浓度为100μg/mL；
步骤S0022中的苯磺隆标准中间液浓度为1μg/mL；步骤S0022中的2甲4氯标准中间液浓度为2μg/mL；
步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液浓度包括：200/1000ng/mL、100/500ng/mL、50/100ng/mL、20/50ng/mL、10/20ng/mL、5/10ng/mL、1/5ng/mL。
5.根据权利要求1所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于：步骤S003液质联用仪的参数包括：液相色谱条件参数和质谱条件参数；
所述液相色谱条件参数包括色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII；进样量：10μL；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动相B：甲醇；柱温：30℃；流速：0.25mL/min；驻留时间：100ms；洗脱方式：二元高压梯度；
所述质谱条件参数包括检测方式：多级反应监测MRM；离子源：ESI；苯磺隆采用正离子扫描模式，2甲4氯采用负离子扫描模式；加热块温度：400℃；雾化气流量：3.0L/min；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min；驻留时间：100ms。
6.根据权利要求1所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S004中：称取粉碎后的酿酒原料于离心管中，加入体积比为99.9：0.1的乙腈-甲酸，漩涡提取5min后加入氯化钠，漩涡振荡后离心处理得到待净化的上清液。
7.根据权利要求1所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S005中：取步骤S004得到的上清液，将上清液转入加有C18的离心管中涡旋离心处理，将旋涡离心处理后的上清液过有机滤膜后置于进样瓶中，等待检测。
8.根据权利要求4所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S0023中的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液按照步骤S003设定的液质联用仪参数进行外标法定量测定；以苯磺隆、2甲4氯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；苯磺隆在1～200ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝67472.1X+74967.9，相关系数r为0.9998379，方法定量限为0.44μg/kg；2甲4氯在5～1000ng/mL范围内线性良好，曲线方程为：Y＝40828.5X-108813，相关系数r分别为0.9999770，方法定量限为0.84μg/kg；苯磺隆和2甲4氯的检出限均＜0.05μg/kg。
9.根据权利要求4所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S006包括精密度试验：选择步骤S0023中浓度为50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液，分别连续测定至少6次；浓度50/100ng/mL和20/50ng/mL的苯磺隆/2甲4氯混合标准工作液的保留时间、峰面积、浓度的相对标准偏差RSD均小于5％。
10.根据权利要求4所述采用液质联用仪同时检测苯磺隆和2甲4氯的方法，其特征在于，步骤S006包括回收率试验：在粉碎后的酿酒原料中加入不同浓度的苯磺隆-2甲4氯标准溶液，得到多个不同浓度的样品；将多个不同浓度的样品按照步骤S004、步骤S005的方法对样品进行处理，测定样品回收率；测定的回收率在89％～110％之间。
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