CN112816578B - 一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒。本发明采用芴甲氧羰酰氯对含氨基小分子蘑菇毒素进行衍生化，并使用二氯甲烷进行富集净化，通过液相色谱串联质谱对待测液进行分析。本发明采用芴甲氧羰酰氯对含氨基小分子蘑菇毒素进行衍生化，衍生反应速度快，所需时间短，效率远高于现有检测方法，并且衍生化产物的色谱峰峰形及分离度能够得到有效改善和提高，明显提高了方法的准确度和灵敏度；本发明将含氨基小分子蘑菇毒素衍生物进行富集净化，能够减少样品的基质效应，提高检测结果的准确性。本发明提供的试剂盒能够方便快捷的实现含氨基小分子蘑菇毒素的检测。

Description

一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒。

背景技术

近年来因误食野生蘑菇引发的中毒事件在我国呈蔓延趋势，引起社会广泛关注，也成为食品安全领域极为突出的问题。2020年国家食品安全风险评估中心基于我国食源性疾病暴发监测***的数据统计发现，2003～2017年间31.8％的食源性中毒事件由毒蘑菇中毒引起，位居各类食源性中毒诱发因素之首。目前已鉴定出的蘑菇毒素有100多种，涉及环肽类及小分子类化合物等。其中鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid)是一种小分子氨基酸类蘑菇毒素，毒蝇母(Muscimol)为其脱羧基的化合物。这两种毒素的主要产毒菌为毒蝇鹅膏菌(Amanita muscaria)和豹斑鹅膏菌(Amanita pantherina)。摄入该类毒蘑菇后呈现出神经精神类症状，表现为头晕、紧张、兴奋、知觉改变、肌肉抽搐等。在体内鹅膏蕈氨酸可迅速以母体形式***至尿液，部分会转化为毒蝇母。另外日本学者Yamaura等从球基鹅膏菌中分离出两种致死小分子氨基酸类蘑菇毒素：2-氨基-5-己炔酸(2-amino-5-hexynoic acid)和2-氨基-4-戊炔酸(2-amino-4-pentynoic acid)(Toxicology,1986,38,161-173)。这两种氨基酸类蘑菇毒素具有较强的水溶性和极性，但其在动物体内的代谢和致死机理尚未明确。鉴于我国毒蘑菇中毒事件频发的现状，开发稳健的蘑菇毒素检测方法，对蘑菇毒素的溯源以及毒蘑菇的鉴定具有重要意义。

目前，国内外关于鹅膏蕈氨酸和毒蝇母的检测方法仅有少量研究，尚无2-氨基-5-己炔酸和2-氨基-4-戊炔酸检测方法的任何报道。利用液相色谱串联质谱法定量检测鹅膏蕈氨酸和毒蝇母已有报道(Forensic Toxicology,2013,322-327；食品安全质量检测学报,2019,22,7656-7664)。然而这两种毒素在电喷雾离子源中均只产生一个有效二级质谱产物离子(鹅膏蕈氨酸：159→113；毒蝇母：115→98)，定性能力较差，极易产生假阳性结果。Kenji Tsujikawa等采用丹磺酰氯对鹅膏蕈氨酸和毒蝇母进行两步衍生化，整个衍生化时间约为150min，衍生化产物通过液相色谱紫外检测(Journal of chromatography B,2007,852,430-435)。Xu等采用类似的衍生化方案在5％NaHCO₃条件下60℃反应30min生成2-丹磺酰氯-鹅膏蕈氨酸和2-丹磺酰氯-毒蝇母，然后通过液相色谱串联质谱法进行定量(Journalof Chromatography B,2020,1146,122128)。然而，此类衍生化方法需进行加热处理、反应时间长、操作繁琐，且仅对鹅膏蕈氨酸和毒蝇母进行检测，对2-氨基-5-己炔酸和2-氨基-4-戊炔酸等致死性小分子蘑菇毒素不能进行检测。

鉴于此，开发一种操作简单且定量准确的含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法是亟需解决的技术难点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒。本发明提供的检测方法前处理简单、省时快捷、灵敏度和准确度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测样本用提取溶剂进行提取，将所得提取液离心，得到上清液；

(2)将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，将所得衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液；所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；

(3)将所述下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液；

(4)将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液；

(5)将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图，根据谱图峰面积和标准曲线计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物峰面积的关系曲线。

优选的，所述含氨基小分子蘑菇毒素为鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2-氨基-5-己炔酸、2-氨基-4-戊炔酸和2-氨基-4,5-己二烯酸中的一种或几种。

优选的，所述待测样本为蘑菇、尿液或血浆，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈水溶液或甲醇水溶液；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈；所述提取为超声提取或振荡提取，所述提取的时间为5～10min。

优选的，所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液的体积比为1～5:1:1～2；所述四硼酸钠缓冲液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述四硼酸钠缓冲液的pH值为8～9；所述芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为0.5～5mg/mL；所述衍生化反应的温度为25～45℃，时间为10～20min。

优选的，所述第一萃取的次数为1～3次，单次萃取用有机溶剂和衍生化反应液的体积比为1～3:1。

优选的，调节所述下层溶液pH值用调节剂为盐酸溶液，将所述下层溶液的pH值调节至2～3；所述下层溶液和二氯甲烷的体积比为1:1～2。

优选的，所述复溶用溶剂为甲醇水溶液。

优选的，所述液相色谱串联质谱分析使用的质谱为三重四级杆质谱，采用的模式为多反应监测质谱模式；

所述液相色谱串联质谱分析的液相色谱条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，流动相B为含氨水的醋酸铵水溶液，所述含氨水的醋酸铵水溶液中氨水的质量分数为0.05％，醋酸铵的浓度为5mmol/L；流动相的流速为0.3～0.4mL/min；色谱柱为ZORBAX eclipse plus C18柱，柱温为40℃；

所述液相色谱串联质谱分析的质谱条件包括：检测方式为电喷雾离子源负离子模式，喷雾电压为-4500V，离子源温度为500℃，气帘气压力为40psi，鞘气压力为50psi，辅助气压力为50psi。

优选的，所述含氨基小分子蘑菇毒素的衍生化产物的质谱参数如表1所示：

表1含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物的质谱参数

本发明还提供了一种用于检测含氨基小分子蘑菇毒素的试剂盒，包括独立分装的提取试剂、衍生化试剂、第一萃取试剂、第二萃取试剂和复溶试剂；所述提取试剂为乙腈、乙腈水溶液或甲醇水溶液，所述衍生化试剂包括四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液；所述第一萃取试剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；所述第二萃取试剂为二氯甲烷，所述复溶试剂为甲醇水溶液。

本发明提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，本发明首先对待测样本进行提取，将提取液离心，得到上清液，上清液在四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液中进行衍生化，所得衍生化反应液经过第一萃取、第二萃取、吹干和复溶后得到待测液，将待测液进行液相色谱串联质谱分析。本发明提供的检测方法采用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)对含氨基小分子蘑菇毒素进行衍生化，衍生反应速度快，所需时间短，反应不需加热，室温下仅需10min即可完全衍生化，效率远高于现有检测方法，极大缩短了检测时间，提高了检测通量，并且衍生化产物的色谱峰峰形及分离度能够得到有效改善和提高，明显提高了方法准确度和灵敏度。

本发明提供的检测方法对第一萃取所得下层溶液的pH值进行调节，然后采用二氯甲烷将含氨基小分子蘑菇毒素的衍生化产物进行富集分离，本发明通过调节体系的pH值能够降低衍生化产物在反应液中的溶解度，从而提高萃取效率，增加富集倍数，提高检测灵敏度；本发明通过二氯甲烷萃取能够将含氨基小分子蘑菇毒素衍生物进行分离富集，减少样品的基质效应，提高检测结果的准确性。

本发明提供的检测方法采用液相色谱串联质谱对待测液进行检测，具有操作简单、样品通量高、灵敏度高、检测准确度高等优点，能精准定量待测样本中痕量的含氨基小分子蘑菇毒素，适用于小分子蘑菇毒素的溯源以及含毒素蘑菇的鉴定。

此外，本发明提供的方法能够同时检测多种含氨基小分子蘑菇毒素，大大降低检测难度，省时快捷。

本发明还提供了一种用于检测含氨基小分子蘑菇毒素的试剂盒，利用本发明的试剂盒能够方便快捷的实现含氨基小分子蘑菇毒素的检测。

附图说明

图1为为尿液样本中四种含氨基小分子蘑菇毒素(浓度均为20ng/mL)的衍生化产物的代表性MRM图谱；

图2为尿液中四种含氨基小分子蘑菇毒素的标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测样本用提取溶剂进行提取，将所得提取液离心，得到上清液；

(2)将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，将所得衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液；所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；

(3)将所述下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液；

(4)将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液；

(5)将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图，根据谱图峰面积和标准曲线数据计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素衍生物浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生物峰面积的关系曲线。

在本发明中，所述含氨基小分子蘑菇毒素优选为鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2-氨基-5-己炔酸、2-氨基-4-戊炔酸和2-氨基-4,5-己二烯酸中的一种或几种；本发明提供的检测方法能够同时检测样本中的多种小分子蘑菇毒素。

本发明将待测样本用提取溶剂提取，将所得提取液离心，得到上清液。在本发明中，所述待测样本优选为蘑菇、血浆或尿液；当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂优选为乙腈水溶液或甲醇水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为50％，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂优选为乙腈；当所述待测样本为蘑菇样本时，本发明优选将蘑菇样本提前进行粉碎，将所述粉碎物进行提取；当所述待测样本为血浆或尿液时，本发明提供的检测方法目的仅限于检测得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量，不涉及后续的诊断和治疗，提供的是一种非治疗目的含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法。

在本发明中，当所述待测样本为蘑菇时，所述待测样本和提取溶剂的用量比优选为1g：4～5mL，当所述待测样本为血浆或尿液时，所述待测样本和提取溶剂的体积比优选为1:1；所述提取的方法优选为超声提取或振荡提取，所述提取的时间优选为5～10min；本发明对所述超声提取的功率和振荡提取的频率没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的条件即可。

在本发明中，所述离心的转速优选为4000r/min以上，更优选为5000～12000r/min，所述离心的时间优选为5min。

得到上清液后，本发明将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，得到衍生化反应液。在本发明中，所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液的体积比优选为1～5:1:1～2；所述四硼酸钠缓冲液的浓度优选为0.1～0.5mol/L，更优选为0.2～0.3mol/L，所述四硼酸钠缓冲液的pH值优选为8～9；所述芴甲氧羰酰氯溶液的浓度优选为0.5～5mg/mL，更优选为1～4mg/mL；所述芴甲氧羰酰氯溶液的溶剂优选为丙酮；本发明以芴甲氧羰酰氯为衍生化试剂，利用四硼酸钠缓冲液为衍生化反应提供碱性环境。

在本发明中，所述衍生化反应的温度优选为25～45℃，更优选为25～30℃，在本发明的具体实施例中，优选直接在室温下进行衍生化反应，无需进行额外的加热或降温；所述衍生化反应的时间优选为10～20min，更优选为10min；本发明优选将上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合后剧烈涡旋振荡1min，然后置于室温下进行衍生化反应；在所述衍生化反应过程中，含氨基小分子蘑菇毒素和芴甲氧羰酰氯发生反应，所得衍生化产物的色谱峰峰型好，分离度高，能够显著提高检测准确度和灵敏度。

在本发明中，所述衍生化反应的方程式如下：

得到所述衍生化反应液后，本发明将所述衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液。在本发明中，所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；所述第一萃取的次数优选为1～3次，更优选为3次，单次萃取用有机溶剂和衍生化反应液的体积比优选为1～3:1，更优选为1.5:1；本发明通过第一萃取将对衍生化反应液进行净化，去除未反应的芴甲氧羰酰氯；第一萃取完成后，有机溶剂层以及杂质、未反应的衍生试剂等在上层，衍生化产物在下层溶液中。

第一萃取完成后，本发明将所得下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液。在本发明中，调节所述下层溶液pH值用调节剂优选为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度优选为1mol/L；本发明优选将所述下层溶液的pH值调节至2～3；所述第二萃取的次数优选为1次，所述下层溶液和二氯甲烷的体积比优选为1:1～2；萃取分层后，取二氯甲烷相，即为本发明的二氯甲烷萃取液。本发明通过调节pH值降低衍生化产物在溶液中的溶解度，提高二氯甲烷的萃取率，通过第二萃取将衍生化产物萃取到二氯甲烷相中，实现衍生化产物的分离富集，减少样品的基质效应，提高检测结果的准确性。

得到二氯甲烷萃取液后，本发明将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液。本发明对所述氮气吹干的具体条件没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中，所述复溶用溶剂优选为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％。

得到待测液后，将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图。在本发明中，所述液相色谱串联质谱分析使用的质谱优选为三重四级杆质谱，采用的模式优选为多反应监测质谱模式。

在本发明中，所述液相色谱串联质谱分析的液相色谱条件优选包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，流动相B为含氨水的醋酸铵水溶液，所述含氨水的醋酸铵水溶液中氨水的质量分数为0.05％，醋酸铵的浓度为5mmol/L；所述流动相的流速为0.3～0.4mL/min；色谱柱为ZORBAX eclipse plus C18柱，色谱柱规格优选为3.5μm×150mm，柱温为40℃，进样体积优选为5μL；

所述液相色谱串联质谱分析的质谱条件优选包括：检测方式为电喷雾离子源负离子模式，喷雾电压为-4500V，离子源温度为500℃，气帘气压力为40psi，鞘气压力为50psi，辅助气压力为50psi。

在本发明的具体实施例中，使用的仪器优选为Waters Acquity UPLC液相色谱仪和AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪。

在本发明中，所述含氨基小分子蘑菇毒素的衍生化产物的质谱参数如表1所示：

表1含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物的质谱参数

在本发明的质谱条件下，各种含氨基小分子蘑菇毒素的衍生化产物能够被准确的检测出，图1为尿液样本中四种含氨基小分子蘑菇毒素(浓度均为20ng/mL)的衍生化产物的代表性MRM图谱，根据图1可以看出，四种含氨基小分子蘑菇毒素的衍生化产物在MRM谱图中的峰型较好，且具有较好的分离度。

得到谱图后，本发明根据谱图峰面积和标准曲线计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生物峰面积的关系曲线。本发明对所述标准曲线的获得方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可，在本发明的具体实施例中，优选使用含氨基小分子蘑菇毒素的标准品和空白基质配制梯度标准液，按照上述方案所述的方法进行衍生化处理和净化后进行检测，根据标准液的浓度和测得的峰面积绘制标准曲线。

本发明还提供了一种用于检测含氨基小分子蘑菇毒素的试剂盒，所述试剂盒包括独立分装的提取试剂、衍生化试剂、第一萃取试剂、第二萃取试剂和复溶试剂；所述提取试剂为乙腈、乙腈水溶液或甲醇水溶液，所述衍生化试剂包括四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液；所述第一萃取试剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；所述第二萃取试剂为二氯甲烷，所述复溶试剂为甲醇水溶液；所述试剂盒在应用时按照上述上述方案所述的方法进行应用即可，利用本发明的试剂盒能够方便快捷的对样本中的含氨基小分子蘑菇毒素进行检测。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1衍生化反应条件的优化

1、仪器设备

Waters Acquity UPLC液相色谱仪(美国Waters公司)、AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)、涡旋混合器、高速离心机、氮气吹干仪、电子分析天平、移液枪等。

2、材料和试剂

鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2-氨基-5-己炔酸和2-氨基-4-戊炔酸等标准品购买自天津阿尔塔公司；芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、醋酸铵(色谱级)、氨水购自Sigma-Aldrich公司；四硼酸钠缓冲溶液(0.5mol/L，pH＝8.0)购自上海麦克林公司；色谱纯乙腈、甲醇和丙酮购自上海泰坦科技股份有限公司。

3、溶液配制

(1)分别准确称取5mg鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2-氨基-5-己炔酸和2-氨基-4-戊炔酸的标准品至容量瓶，使用超纯水定容至10mL，作为标准贮备液，避光保存于-20℃。混合工作溶液使用50％甲醇水溶液对标准贮备液进行梯度系列稀释得到。

(2)准确称取100mg芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)至50mL容量瓶中，使用丙酮进行定容，遮光保存于室温条件下。

(3)准确称取0.3985g醋酸钠溶液至1L容量瓶中，使用超纯水定容后超声5min，配置成5mmol/L醋酸铵水溶液，现用现配。

4、衍生化过程

(1)衍生化时间的考察

取200μL尿液样本或蘑菇提取液至2mL试管中，分别加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5mol/L，pH＝8.0)和400μL Fmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应5、10、15和20min，然后使用正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，取下层溶液，本实施例仅验证衍生化反应的条件，为简化实验操作，直接将下层溶液稀释并过滤后进行分析，不进行后续的净化处理，具体为：将所得下层溶液使用甲醇倍比稀释后过滤膜，然后进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断衍生化效率。

(2)衍生化温度的考察

取200μL尿液样本或蘑菇提取液至2mL试管中，分别加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5mol/L，pH＝8.0)和400μL Fmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置15℃、25℃、35℃、45℃、55℃条件下反应10min，然后使用正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液使用甲醇倍比稀释后过滤膜进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断衍生化效率。

5、液相色质谱条件

(1)色谱条件

流动相：甲醇(A)和含0.05％氨水的5mmol/L醋酸铵水溶液(B)；流速为0.3mL/min；色谱柱为ZORBAX eclipse plus C18柱(3.5μm×150mm)；柱温为40℃；进样体积为5μL。梯度洗脱程序如下：0min，10％A；1min，10％A；9min,100％A；12min,100％A；12.2min,10％A；15min,10％A。

(2)质谱条件

电喷雾离子源负离子模式(ESI^-)；离子源参数为：喷雾电压为-4500V；离子源温度为500℃；气帘气压力为8psi；鞘气压力为50psi；辅助气压力为50psi；气帘气为40psi。含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物的质谱参数如上文表1所示。

6、结果分析

(1)以尿液为样本，不同衍生化时间条件下所得检测结果如表2所示。

表2不同衍生化时间对四种蘑菇毒素信号响应的影响

根据表2可以看出，当衍生化时间为5min时，四种蘑菇毒素的信号响应值低于其他衍生化时间的产物，衍生化时间超过10min时，各蘑菇毒素的信号响应值相差不大，说明衍生化时间为10min以上时都能衍生完全，为节省检测时间，选择衍生化10min作为最佳反应时间。

(2)以尿液为样本，不同衍生化温度条件下所得检测结果如表3所示。

表3不同衍生化温度对四种蘑菇毒素信号响应的影响

根据表3可以看出，衍生化温度在25～45℃条件下，四种蘑菇毒素的信号响应值无明显差异；当衍生化温度达55℃时，四种蘑菇毒素的信号值反而降低，推测可能原因为在较高的温度下，衍生化试剂可继续与蘑菇毒素中的仲胺发生反应，从而生成其他的衍生化产物，导致检测信号的降低。因此，选择室温条件下进行衍生化反应。

(3)以蘑菇为样本，对蘑菇提取液进行衍生化条件的优化时，结果和(1)～(2)中相似，后续均在室温下进行衍生化，衍生时间设置为10min。

实施例2含氨基小分子蘑菇毒素的提取净化

1、pH对萃取效率的影响

取200μL尿液样本或蘑菇提取液至2mL试管中，分别加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5mol/L，pH＝8.0)和400μL Fmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应10min，然后正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为2、5、8，然后使用二氯甲烷进行萃取，萃取液氮气吹干后复溶于50％甲醇水溶液中，进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断pH对萃取效率的影响。

2、提取方法的优化

(1)直接衍生化尿液样本

取200μL尿液样本至2mL试管中，分别加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5mol/L，pH＝8.0)和400μL Fmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应10min，然后正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液使用1mol/L盐酸溶液调节pH至2-3，然后加入等体积二氯甲烷进行萃取，萃取液氮气吹干后复溶于50％甲醇水溶液中，进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断提取净化效率。

(2)乙酸乙酯萃取净化尿液样本

取200μL尿液样本至2mL试管中，加入2倍体积乙酸乙酯剧烈涡旋后移除乙酸乙酯层，重复上述操作3次，然后下层溶液加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5M，pH＝8.0)和400μLFmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应10min，然后使用正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液使用1mol/L盐酸溶液调节pH至2-3，然后加入等体积二氯甲烷进行萃取，萃取液氮气吹干后复溶于50％甲醇水溶液中，进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断提取净化效率。

(3)乙腈提取净化尿液样本

取200μL尿液样本至2mL试管中，加入等体积乙腈剧烈涡旋后12000r/min离心5min，转移上清液至5mL试管中并加入400μL四硼酸钠缓冲溶(0.5M，pH＝8.0)和400μLFmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应10min，然后使用正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液使用1mol/L盐酸溶液调节pH至2-3，然后加入等体积二氯甲烷进行萃取，萃取液氮气吹干后复溶于50％甲醇水溶液中，进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断提取净化效率。

(4)蘑菇样本的提取

准确称取充分粉碎的蘑菇样本0.5g至5mL试管中，加入2mL不同提取溶液(乙腈、甲醇、50％甲醇水溶液和50％乙腈水溶液)超声提取10min后12000r/min离心5min，取200μL上清液至2mL试管中，加入200μL四硼酸钠缓冲溶(0.5M，pH＝8.0)和400μL Fmoc-Cl溶液，剧烈震荡涡旋1min后置室温条件下反应10min，然后使用正戊烷反复萃取3次，移除正戊烷层，下层溶液使用1mol/L盐酸溶液调节pH至2-3，然后加入等体积二氯甲烷进行萃取，萃取液氮气吹干后复溶于50％甲醇水溶液中，进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断提取效率。

3、结果分析

(1)以尿液为样本，不同pH条件和萃取次数下的检测结果如表4所示

表4不同萃取条件对4种蘑菇毒素峰面积响应的影响

根据表4可以看出，在pH＝8条件下，二氯甲烷对蘑菇毒素的萃取回收率较低；当pH＝5条件下，对鹅膏蕈氨酸的萃取回收率不足50％；当pH＝2时，二氯甲烷萃取1次四种蘑菇毒素的回收率即可达到95％以上。因此，选择pH＝2条件下使用二氯甲烷萃取1次对样本进行富集浓缩。

以蘑菇提取液为样本时，不同pH条件和萃取次数下的检测结果和表4中相似，结果显示当pH＝2时，二氯甲烷萃取1次四种蘑菇毒素的回收率均能达到95％以上。

(2)不同净化方式下的检测结果如表5所示：

表5不同净化方式对4种蘑菇毒素峰面积响应的影响

根据表5可以看出，相较于未净化和乙酸乙酯净化方式，在相同添加浓度下，乙腈萃取净化可明显提高毒蝇母、2-氨基-4-戊炔酸和2-氨基-5-己炔酸的信号响应值。因此，选择乙腈对生物样本进行提取净化。

(3)不同提取溶液对蘑菇中4种毒素的提取效率如表6所示：

表6不同提取溶液对蘑菇样本中蘑菇毒素峰面积的影响

根据表6可以看出，使用乙腈或甲醇作为提取溶液时，对蘑菇样本中4种毒素提取效率较低，各毒素峰面积较低；当使用50％乙腈水或50％甲醇水溶液作为提取溶剂时，4种蘑菇毒素的提取效率显著提高。最终，选择50％甲醇水溶液作为蘑菇样本最佳的提取溶液。

实施例3检测含氨基小分子蘑菇毒素的方法学验证

1、线性

空白尿液样本使用含四种蘑菇毒素的混标加标分别配置成浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100ng/mL的标准液。采用实施例1和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，然后进液相色谱串联质谱仪分析测定。以峰面积作为Y轴，蘑菇毒素的浓度作为X轴，绘制标准曲线，所得结果如图2所示。

根据图2可以看出，四种蘑菇毒素标准曲线的R²值均大于0.99，在尿液基质中线性良好。

另外，以蘑菇和血浆为空白样本，采用相同的方法处理并绘制标准曲线，结果表明四种蘑菇毒素标准曲线的R²值也均大于0.99，表明在蘑菇和血浆基质中线性良好。

2、回收率

在空白尿液、血浆、蘑菇样品中加标四种蘑菇毒素，测试回收率，加标浓度分别为1、10、100ng/mL，采用实施例1和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，然后进液相色谱串联质谱仪进行分析测定。根据待测物的峰面积，使用步骤1中绘制的标准曲线进行定量，结果如表7所示。

表7尿液、血浆和蘑菇中四种蘑菇毒素的加标回收率

根据表7可以看出，尿液、血浆和蘑菇中四种蘑菇毒素的回收率良好，均在83％～104％之间。

3、灵敏度

定量限(LOQ)是指在样品基质相应溶液中目标物定量离子为10倍信噪比(S/N＝10)时的浓度。通过在尿液、血浆和蘑菇基质中添加四种蘑菇毒素混合标准溶液并进行梯度稀释，得出在鹅膏蕈氨酸的定量限为0.5ng/mL，毒蝇母的定量限为1ng/mL，2-氨基-4-戊炔酸和2-氨基-5-己炔酸定量限为0.1ng/mL。

实施例4盲样测试

尿液、血浆和蘑菇样品经盲样加标后，由其他试验人员按照本发明的检测方法进行测试，提取条件和衍生化条件均为实施例1～2中确定的最佳条件。测试结果如表8所示：

表8盲样加标测试结果

表8中的结果表明，所有定量结果均达到满意结果，本发明提供的检测方法具有较高的准确度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将待测样本用提取溶剂进行提取，将所得提取液离心，得到上清液；

（2）将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，将所得衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液；所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；

（3）将所述下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液；

（4）将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液；

（5）将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图，根据谱图峰面积和标准曲线计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物峰面积的关系曲线；

所述含氨基小分子蘑菇毒素为鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2-氨基-5-己炔酸、2-氨基-4-戊炔酸和2-氨基-4,5-己二烯酸；所述衍生化反应的温度为25~45 ℃，时间为10~20 min；

所述待测样本为蘑菇、尿液或血浆，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈水溶液或甲醇水溶液；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈；

所述液相色谱串联质谱分析的液相色谱条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，流动相B为含氨水的醋酸铵水溶液，所述含氨水的醋酸铵水溶液中氨水的质量分数为0.05%，醋酸铵的浓度为5 mmol/L；色谱柱为ZORBAX eclipse plus C18柱；梯度洗脱程序为：0min，10%A；1min，10%A；9min，100%A；12min，100%A；12.2min，10%A；15min，10%A。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取为超声提取或振荡提取，所述提取的时间为5~10 min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液的体积比为1~5: 1 : 1~2；所述四硼酸钠缓冲液的浓度为0.1~0.5 mol/L，所述四硼酸钠缓冲液的pH值为8~9；所述芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为0.5~5 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一萃取的次数为1~3次，单次萃取用有机溶剂和衍生化反应液的体积比为1~3 : 1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，调节所述下层溶液pH值用调节剂为盐酸溶液，将所述下层溶液的pH值调节至2~3；所述下层溶液和二氯甲烷的体积比为1:1~2。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复溶用溶剂为甲醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱分析使用的质谱为三重四级杆质谱，采用的模式为多反应监测质谱模式；

所述流动相的流速为0.3~0.4 mL/min；所述色谱柱的柱温为40 ℃；

所述液相色谱串联质谱分析的质谱条件包括：检测方式为电喷雾离子源负离子模式，喷雾电压为-4500 V，离子源温度为500 ℃，气帘气压力为40 psi，鞘气压力为50 psi，辅助气压力为50 psi。

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