CN113755395B

CN113755395B - 一株促进水稻耐盐生长的越南蔷薇菌rl-wg62菌株及其应用

Info

Publication number: CN113755395B
Application number: CN202111178319.XA
Authority: CN
Inventors: 任磊; 王冠; 翁丽云; 张宇轩; 胡贤燚; 胡汉桥; 黄永相; 郭建夫; 薛迎斌
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2021-10-09
Filing date: 2021-10-09
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2041-10-09
Also published as: CN113755395A

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，本发明公开了一株促进水稻耐盐生长的越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis)RL‑WG62菌株及其应用，所述菌株于2021年7月26日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC NO：61835。本申请发现，菌株RL‑WG62能明显缓解水稻的盐害现象，在盐胁迫下，该菌能够使“海稻86”的耐盐能力由0.4％提升至0.8％，存活率在95％以上；含有菌RL‑WG62的水稻耐盐促生剂可以使水稻的成活率、叶绿素含量、根长部生长情况和干鲜重都有显著的提升，能促进水稻的生长。本发明能够应用于盐渍化的土壤种植业，对于水稻盐渍土壤的修复与利用具有较好的经济价值。

Description

一株促进水稻耐盐生长的越南蔷薇菌RL-WG62菌株及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株促进水稻耐盐生长的越南蔷薇菌RL-WG62菌株及其应用。

背景技术

我国是世界上最大的粮食生产国和消费国，我国粮食安全面临着粮食需求迅速增长、产量提升空间日益收窄、耕地面积不断减少、淡水资源日益稀缺、生态环境污染严重等多重挑战，粮食安全问题亟待解决。而土壤盐碱化是一个导致耕地面积减少的全球性问题，全球约有10亿公顷盐碱地，且估计全球的盐碱土壤每年以1.0～1.5×10⁶公顷的速度增长。我国盐碱地面积大、分布广、类型丰富，主要分布在东北、西北、华北及沿海海滨滩涂地区，盐荒地约2亿公顷，约占全国耕地面积的四分之一，其中盐碱耕地达到670万公顷。因此，如何减缓土地的盐碱化及充分改造、利用已盐碱化的土地，成为保障粮食安全的新途径。

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。PGPR参与了土壤生态***的各项生物活动，某些植物根际促生菌可合成某些对植物生长发育有直接作用的物质或改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于植物吸收(如固氮、解磷等)，还能间接的使某些植物根际促生菌抑制或减轻某些植物病害对植物生长发育和产量的不良影响。

而利用这些微生物本身可以减轻盐土农业方面的压力，并促进可持续农业的良性发展，如专利CN110904001B公开了一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用，采用野生稻根际细菌巨大芽孢杆菌GW8，可以在高盐碱条件下溶解难溶性Ca₃(PO₄)₂，同时对于盐碱土栽培水稻具有较强的促生作用，且无致病性。目前，报道的PGPR在改善盐土、促进植物耐盐性的研究主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、黄杆菌属(Flavobacteria)和固氮菌属(Azotobacter)等的菌株筛选上，并对它们在调整植物内源激素平衡、抗氧化、离子稳态和光合作用等方面做了一些机理性的探讨。

发明内容

本发明提供一种新的水稻耐盐的根际促生菌，为盐渍土壤的修复提供更多更高效的耐盐促生菌选择。

本发明第一个目的是提供一株越南蔷薇菌RL-WG62菌株。

本发明第二个目的是提供一种水稻耐盐促生剂。

本发明第三个目的是提供菌RL-WG62在盐胁迫下促进水稻生长的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从耐盐水稻“海稻86”根际土壤中分离得到到一种耐盐促生菌，所述菌株于2021年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏编号为GDMCC NO：61835。

本发明对水稻幼苗进行盐胁迫的实验中发现，在盐胁迫下，水稻的成活率、叶绿素含量、水稻幼苗根生的长都受到了明显的抑制，而在含菌RL-WG62的水稻耐盐促生剂使用后，成活率显著提升，分别提升到了100％、100％、96.7％和95％；其叶绿素含量和水稻幼苗的根长部生长情况，干鲜重都有明显的提升，能明显缓解盐害现象，促进水稻的生长。

因此，本发明提供菌RL-WG62在促进水稻生长中的应用。

本发明提供菌RL-WG62在制备水稻促生剂中的应用。

本发明提供菌RL-WG62在盐胁迫下促进水稻生长中的应用。

本发明提供菌RL-WG62在制备水稻耐盐促生剂中的应用。

本发明还提供一种水稻耐盐促生剂，以菌株RL-WG62菌株或其菌液为活性成分。

优选地，所述菌株RL-WG62菌液浓度为1×10⁸CFU/mL。

本发明提供一种促进水稻生长的方法，将耐盐促生菌RL-WG62配置成终浓度为1×10⁸CFU/mL的水溶液，注入水稻幼苗根际土壤中，每株水稻幼苗根际注入1mL水稻耐盐促生剂。

优选地，所述水稻为海稻86。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株促进水稻耐盐生长的越南蔷薇菌(Rossellomoreavietnamensis)RL-WG62菌株，该菌株RL-WG62能在盐胁迫下显著提高水稻的耐盐能力；用菌株RL-WG62制成的水稻耐盐促生剂，注入水稻幼苗根际土壤中，能明显增大水稻的株型、株高和茎粗，显著促进水稻幼苗的干物质积累，并对水稻幼苗的根长、表面积、根体积、根尖数的均有促进作用，减缓了盐害现象，从而促进水稻幼苗的生长，有助于提高水稻的耐盐性，减少化学肥料的使用。

附图说明

图1为本发明越南蔷薇菌RL-WG62在LB固体培养基上的菌落形态。

图2为本发明越南蔷薇菌RL-WG62在16S rRNA基因***发育树图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株的分离和筛选

称取2.0g海稻86根际土壤样本(连带植物根系)置于装有100mL无菌水的锥形瓶内，以隔菌膜封口后，在200rpm摇床内30℃恒温振荡1h，即得土壤悬液。吸取1mL土壤悬液转接于含50g/L NaCl的LB平板内，以200rpm转速30℃恒温培养48h后，待培养基中有单菌落长出后，根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照(如图1所示)并转接于含100g/L NaCl的LB液体培养基中，30℃振荡180rpm培养24h后，摇菌至细菌指数生长期时保存于25％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2菌株的鉴定

1.菌株的形态学特征：菌株在LB培养基上菌落为橙色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑。

2.细菌DNA提取：

将实施例1中分离得到的菌株接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下培养3d，取1mL菌液，离心收集菌体，用宝日生物技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

3.菌株16s rRNA基因序列的PCR扩增：

以上述细菌DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物：

正向引27(F)5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

反向引物1492(R)5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

采用50μL PCR扩增体系：21μL无菌水，正向和反向引物各1μL，25μL r-Taq mix，2μL目标微生物基因组DNA。

扩增反应程序：①94℃预变性2min，②94℃变性30s，③52℃退火30s，④72℃延伸1.5min，步骤②～④进行30个循环后，体系在72℃继续延伸10min，扩增产物保存于4℃。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶(含0.01％GelRed)电泳检测，以DNA Marker 2000作为参照，并置于1×TAE缓冲液内130V恒压电泳30min。随后在凝胶成像***下观察PCR扩增产物条带。

4.菌株16s rRNA基因序列测序与菌种鉴定：

将上述PCR扩增产物送由南京金唯智生物公司进行测序，并将所得16S rRNA基因序列上传至NCBI并进行比对，筛选亲缘关系较近的种属进行基于16S rRNA基因序列的***发育分析，***发育树如图2所示。

同时，基于16S rRNA基因序列分析结果，以《常见细菌***鉴定手册》为基础对菌株进行生理生化特征分析，最终将该菌株鉴定为越南蔷薇菌(Rossellomoreavietnamensis)，命名为RL-WG62。该菌株于2021年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO：61835，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3菌株RL-WG62的耐盐性试验

挑选大小一致、饱满的水稻种子用2％的NaClO溶液表面消毒15min，用去离子水反复冲洗种子多次，置于去离子水中浸种24h，再将其置于铺有湿润纱布的培养皿上，27℃催芽2d。选取出芽一致的种子播种于水稻田，待幼苗长至三叶一心时移植到塑料盆(670×410×150mm)中，其中栽培土为稻田土，盐水为海水。

水稻耐盐促生剂的配制：将菌株RL-WG62接种于LB液体培养基，180rpm、30℃下培养至OD₆₀₀为1，得到菌液浓度为1.0×10⁸CFU/mL；将菌液在6000rpm离心10min，弃上清液，再注入等体积0.01M的PBS缓冲液，振荡重悬后，6000rpm离心10min，弃上清液，重复2次，重悬后即得水稻耐盐促生剂。

实验设0、0.2％、0.4％、0.6％和0.8％五个盐度处理，以适当稀释后的海水对稻田土进行浇灌，充分混匀后测定水层盐度，制备得测试用含盐土壤。实验设置非盐胁迫组(盐度浓度为0，采用自来水浇灌)，盐胁迫组(盐度浓度为0.2％、0.4％、0.6％和0.8％)，以及水稻耐盐促生剂处理组(采用上述制备得到的水稻耐盐促生剂)。各处理组按设定的盐浓度浇灌，而水稻耐盐促生剂处理组在盐浓度处理后1d施用，每株幼苗根际注入1mL水稻耐盐促生剂。实验水稻设置一组20棵苗，每组三个重复，处理15d后采样进行指标测定。整个培养过程在温室中进行，温度：白天26±5℃及夜间21±5℃，相对湿度：白天50％±10％及夜间60％±6％。

以下试验均按照非盐胁迫组、盐胁迫组和水稻耐盐促生剂处理组进行试验。

1.水稻成活率实验测试：

取上述水稻幼苗，移植到含盐土壤中，从全部水稻幼苗种下开始，记录成活率，随后每天记录各植株生长情况，实验结果见表1所示。

表1水稻耐盐促生剂对植株成活率的影响

结果如表1所示，在盐胁迫下，水稻的成活率受到了明显的抑制；在0.2％、0.4％、0.6％和0.8％盐度处理下，水稻的成活率比对照组分别降低了10％、15％、95％和100％；在加了水稻耐盐促生剂的处理组中，水稻的成活率显著提升，分别提升到了100％、100％、96.7％和95％。

2.叶绿素含量测定：

取上述耐盐实验的水稻的叶片，采用分光光度法测定叶绿素含量浓度，将水稻的叶片洗净并吸干外附水分，用打孔器准确在主脉两侧钻取健康绿色叶圆片并剪碎叶片，称取0.20g，每株苗3个重复，分别放置于研钵中，在研磨前加入用80％丙酮和少量石英砂，研磨至匀浆后，再加入5ml 80％丙酮，混合均匀，静置得提取液。再进行比色测定，以80％丙酮液为空白，透光率为100％，分别于663nm和645nm等波长下比色测定，记录吸光度。按照公式(1)和(2)计算结果，并根据标准曲线得到色素提取液的浓度。

A₆₆₃＝82.04C_a+9.27C_b (1)

A₆₄₅＝16.76C_a+45.6C_b (2)

表2水稻耐盐促生剂对植株叶绿素的影响

检测结果如表2所示，在盐胁迫下，水稻的叶绿素含量明显被抑制；其中，在0.2％、0.4％和0.6％盐度处理下，叶绿素a含量比对照组分别降低了19％、26％和43％，而在0.8％盐度下水稻完全死亡；叶绿素b含量比对照组分别降低了1％、14％和26％；而在水稻耐盐促生剂处理组中：在0.2％盐度下，水稻耐盐促生剂处理组植株较未施加水稻耐盐促生剂植株的叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了16％和20％；在0.4％盐度下，水稻耐盐促生剂处理植株较未施加水稻耐盐促生剂植株的叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了50％和35％；在0.6％盐度下，水稻耐盐促生剂处理植株较未施加水稻耐盐促生剂植株的叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了68％和40％。

3.根系形态分析：

取上述耐盐实验的水稻的根部，采用爱普生V800扫描仪对根系进行扫描，并采用WinRHIZO根系分析***软件(RegentInstruments，Inc.，Quebec，Canada)对根系的图像进行分析，获得根系总长度、根系总表面积和根总体积，测试结果如表3所示。

表3水稻耐盐促生剂对植株根部生长情况

结果由表3可知，盐胁迫显著抑制了水稻幼苗根生长，随着盐度的升高抑制效果越明显，0.4％盐胁迫后的水稻根部变化尤为突出；在0.8％盐度下，水稻完全死亡，根部全部枯萎。在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的总根长与对照组相比提高了11％；0.2％盐度下施加水稻耐盐促生剂的总根长与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了21.87％，0.4％盐度下施加水稻耐盐促生剂的总根长与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了177％，0.6％盐度施加水稻耐盐促生剂的总根长与与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了616％；在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与对照组相比提高了2％，0.2％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了48.09％，在0.4％和0.6％两个盐度下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与未施加水稻耐盐促生剂的相比分别提高了132％和342％；在0.4％和0.6％盐胁迫下，两者施加水稻耐盐促生剂对水稻幼苗根体积无显著差异而与不施加水稻耐盐促生剂的相比，根体积分别提高了44％和120％。

4.水稻干鲜重：

取上述耐盐实验的水稻幼苗，将水稻幼苗植株洗净，吸干表面水分，将水稻幼苗分为地上部分和地下部分，使用千分之一天平秤量，即为鲜重。随后将材料置于烘箱，直至烘干至恒重，称取干重，具体测量数据如下表4所示。

表4水稻耐盐促生剂对水稻干鲜重的影响

结果由表4可知，非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的植株地上部干重比对照组增长11％；同时，与非盐胁迫下相比，0.2％、0.4％和0.6％盐度处理地上部干重分别下降0.5％、35％和74％，水稻耐盐促生剂处理后的地上部干重只比对照组下降了1％、5％和37％；0.4％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的地上部与不施加水稻耐盐促生剂的地上部干重相差30％，而在0.6％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的地上部与不施加水稻耐盐促生剂的地上部干重相差37％；与非盐胁迫下相比，0.4％和0.6％盐度处理地下部干重分别下降42％和73％，而水稻耐盐促生剂处理后的地下部干重只比对照组下降了14％和41％；在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂后的地下部干重提升了18％。

非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的植株地上部鲜重比对照组增长8％；同时，与非盐胁迫下相比，不施加水稻耐盐促生剂的0.2％、0.4％和0.6％盐度下地上部鲜重分别下降0.7％、57％和85％，0.2％盐度下水稻耐盐促生剂处理后的地上部鲜重只比对照组增加了3％，0.4％和0.6％盐度下只比对照组下降了8％和46％；0.4％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的地上部与不施加水稻耐盐促生剂的地上部鲜重相差49％，而在0.6％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的地上部与不施加水稻耐盐促生剂的地上部鲜重相差39％；与非盐胁迫下相比，0.4％和0.6％盐度处理地下部鲜重分别下降43％和75％，而水稻耐盐促生剂处理后的地下部鲜重只比对照组下降了6％和34％；在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂后的地下部鲜重提升了7％。

综上所述，分离得到的越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis)RL-WG62菌株能明显缓解水稻的盐害现象；使用菌RL-WG62后的海稻86在0.2％、0.4％、0.6％和0.8％盐胁迫下，成活率显著提高，分别提升到了100％、100％、96.7％和95％。而盐胁迫显著抑制了水稻幼苗叶绿素含量、根的生长和根部物质的积累，随着盐度的升高抑制效果越明显，但施用了菌RL-WG62后，水稻幼苗的叶绿素含量和根长部生长情况，干鲜重都有明显的提升，能明显缓解盐害现象，促进水稻的生长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株越南蔷薇菌（Rossellomorea vietnamensis）RL-WG62菌株，其特征在于，所述菌株于2021年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏编号为GDMCCNO：61835。

2.权利要求1所述RL-WG62菌株在海水盐碱环境下促进水稻生长中的应用，其特征在于，所述海水盐碱环境指海水的盐浓度为0.2%~0.8%。

3.权利要求1所述RL-WG62菌株在制备水稻耐海水盐碱的促生剂中的应用。

4.一种水稻耐海水盐碱的促生剂，其特征在于，以权利要求1所述RL-WG62菌株为活性成分。

5.权利要求4所述促生剂在海水盐碱环境下促进水稻生长中的应用。

6.一种在海水盐碱环境下促进水稻生长的方法，其特征在于，将权利要求1所述RL-WG62菌株的菌液注入水稻苗根际土壤中，所述RL-WG62菌株的菌液浓度不低于1.0×10⁸CFU/mL，海水的盐浓度为0.2%~0.8%。