CN107205403A - 果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(pgpr)菌株促进植物和动物生长和健康的效力的用途 - Google Patents

果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(pgpr)菌株促进植物和动物生长和健康的效力的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了包含或利用植物促生根际细菌(PGPR)以改善植物和动物生长和健康的组合物和方法。所述组合物和方法包括或利用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)、以及包含果胶或果胶相关糖类的糖类。

Description

果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(PGPR)菌株促进 植物和动物生长和健康的效力的用途
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年9月30日提交的美国临时申请No.62/057,667的优先权权益，所述申请的内容通过引用以其整体并入本文中。
技术领域
本公开的主题涉及植物促生根际细菌(PGPR)领域。特别是，本主题涉及使用果胶或果胶相关糖类提高PGPR在促进植物和动物生长和健康方面的效力。
背景技术
植物伴生微生物在天然和诱导性抑制土传病害中的作用已被广泛研究。在很多个这样的有机体群当中包括根部伴生细菌，其通常代表土壤细菌的一个亚类。根际细菌是在再引入种子或有生长力的植物部分(例如马铃薯块茎)后、在竞争性土壤微生物区系存在下具有定殖于发育中的根系的能力的全体根围细菌的一个亚类。根部定殖通常通过定量根表面上的细菌数进行研究；然而，有些根际细菌也可以进入根部并建立至少一个受限的内生相。因此，根部定殖可以看做从根部的根围到根面至内部组织的连续体。
对被定殖的植物发挥有益效应的根际细菌被称为“植物促生根际细菌”或“PGPR”。PGPR可通过引起促植物生长或生物病害控制而有益于宿主。同一个PGPR菌株既可引起促生长也可引起生物控制。在被证明受PGPR负面影响的土传病原体之中有丝嚢霉某些种(Aphanomyces spp.)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)、疫霉某些种(Phytophthora spp.)、腐霉某些种(Pythium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、和轮枝孢某些种(Verticillium spp.)。在大部分这些情况下，生物控制来自于细菌产生的直接抑制所述病原体的代谢产物，例如抗生素、氰化氢、铁螯合性铁载体和细胞壁降解酶。PGPR的促植物生长并且可以是间接生物控制机制，当所述促生长导致植物在易感染状态中的时间缩短时造成植物染病机率降低，例如在PGPR引起出苗率提高，从而减少出苗前立枯病易感染时间的情况下。PGPR生物控制的另一个机制是诱导性***抗病性。现有技术中公开了PGPR及其应用。(参见，例如，美国专利No.8,445,255；6,524,998；5,935,839；5,640,803；5,503,652；和5,503,651；其内容通过引用以其整体并入本文中)。
除了在自然界观察到它们与植物伴生外，PGPR还可以用作动物益生菌以改善动物成长或动物健康。例如，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)AP193已被描述为鱼的益生菌。(参见美国公布申请No.2012/0328572)。
在猪中，益生菌已经用于对肠道微生物群平衡、肠上皮完整性和肠道相关组织的成熟进行正面影响。(参见Corcionivoshi等，Animal Science and Biotechnologies，2010，43(1))。在家禽中，益生菌已经用于保持消化道微生物平衡和减少潜在的病原菌，这导致生长、产蛋量和饲料转化率改善。(参见，同上)。在牛中，益生菌已经用于预防和对抗消化紊乱例如哺乳期间的腹泻，用于影响瘤胃的营养素代谢，这有助于保持健康和改善生产性能。(参见，同上)。在绵羊中，益生菌已经用于预防和对抗起因于消化平衡的病理性状况。(参见，同上)。
因此，希望有用于PGPR促进植物和动物的生长和健康的新组合物和使用方法。
发明内容
本发明公开了包括或利用植物促生根际细菌(PGPR)以改善植物和动物生长和健康的组合物和方法。所述组合物和方法包括或利用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)、以及包含果胶或果胶相关糖类的糖类。
所公开的组合物可以包括接种剂，其包含：(a)表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)；和(b)包含果胶或果胶相关糖类的糖类。合适的PGPR可以包括芽孢杆菌(Bacillus)物种例如解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubspecies plantarum)。所述果胶或果胶相关糖类可以包括果胶衍生糖类，例如水解果胶、D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronate)、或其混合物。任选地，所述果胶或果胶相关糖类起到所述PGPR的载体的功能和/或所述接种剂包括所述果胶或果胶相关糖类以外的载体。
所公开的组合物可用于处理植物、种子和土壤，以求改善植物生长或植物健康。所公开的组合物可以配制为植物处理组合物、种子包衣、或土壤调理组合物。
所公开的组合物也可以施用于动物，以求改善动物成长或动物健康。所公开的组合物可以配制为动物饲料，例如颗粒动物饲料。
还公开了利用果胶或果胶相关糖类来改善PGPR在促进植物和动物生长或健康方面的效力的方法。所公开的改善植物生长或植物健康的方法可以包括：(a)用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)处理植物、种子或土壤和(b)用包含果胶或果胶相关糖类的糖类处理植物、种子或土壤，其中所述植物、种子或土壤可以用所述PGPR和所述糖类同时处理或用所述PGPR和糖类以任何顺序非同时处理。所公开的改善动物生长或动物健康的方法可以包括(a)向动物施用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)和(b)向所述动物施用包含果胶或果胶相关糖类的糖类，其中所述动物可以同时施用所述PGPR和糖类或用所述PGPR和糖类以任何顺序非同时处理。
还公开了利用果胶或果胶相关糖类制备如本文中公开的的组合物和接种剂的方法。所述方法可以包括将PGPR和已经从含果胶的植物材料中提取的果胶、或果胶相关糖类合并，制备所公开的组合物和接种剂。任选地，载体可以与所述PGPR和果胶或果胶相关糖类合并，制备所公开的组合物和接种剂。
附图说明
图1.实施例1中评价的PGPR芽孢杆菌某些种的种系发生。(图A)利用蜡样芽孢杆菌(B.cereus)ATCC 14579T作为外群，基于gyrB序列的近邻结合种系发生树。(图B)25个枯草芽孢杆菌(B.subtilis)种群菌株基于核心基因组的729,383bp序列的最大似然性种系发生树。属于解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)和解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(B.amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)的两个聚类由括号指示。
图2.芽孢杆菌属(n＝81)、枯草芽孢杆菌子群(n＝53)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)物种(n＝32)和植物亚种(subsp.plantarum)(n＝28)特异性的四种不同核心基因组的不同子***类别的分布。(图A)各核心基因组的不同子***类别内基因的总计数。(图B)各核心基因组的不同子***类别内基因的％相对丰度。(图C)由存在于解淀粉芽孢杆菌植物亚种核心基因中但在解淀粉芽孢杆菌物种水平的核心基因组中不存在的73个解淀粉芽孢杆菌植物亚种特异性基因编码的功能类别。该饼图的每个子群旁边的数字表示编码所述功能的基因的数量。
图3.如琼脂扩散试验表明，芽孢杆菌某种(Bacillus sp.)AP193及其突变体——表面活性素表达缺陷的ΔsrfAA、杀艰菌素(Difficidin)表达缺陷的ΔdfnD、和多种次级代谢产物(包括杀艰菌素)表达缺陷的Δsfp针对植物病原体丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringe pv.tabaci)、放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.campestris)的抗微生物活性。
图4.来自(A)野生型解淀粉芽孢杆菌AP193和(B)它的等基因dfnD突变体在TSB中生长72小时时的无细胞上清液的代谢产物LC-MS谱。注意在负离子模式下，细菌培养上清液中在m/z 559.3处只检测到羟基杀艰菌素(oxydifficidin)的去质子化形式。
图5.由PGPR Bap菌株AP193表达的果胶裂解酶活性。注意在生长的Bap菌株周围由于果胶降解的变透明晕圈。
图6.在TSS培养基中PGPR菌株AP143和AP193使用1％果胶作为唯一的C源。由非PGPR菌株HD73引起的OD600小幅增加应归于来自之前的TSB培养物存在的残留营养素。
具体实施方式
所公开的本发明主题可以利用如下所述的各种术语来描述。
除非上下文另有说明或指示，没有数量指示的指称物和术语“所述”是指“一或多”。例如，除非上下文另有说明或指示，“糖”应该解释为是指“一种或多种糖”。
用在本文中时，“约”、“大约”、“实质”和“显著”将是本领域普通技术人员所理解的并且根据使用它们的语境将在一定程度上变化。如果所述术语的使用，考虑到使用它的语境而言，对本领域普通技术人员是不明确的，则“约”和“大约”将是指所述具体项加减≤10％，“实质”和“显著”将是指所述具体项加减>10％。
用在本文中时，“约”、“大约”、“实质”和“显著”将是本领域普通技术人员所理解的并且根据使用它们的语境将在一定程度上变化。如果所述术语的使用，考虑到使用它的语境而言，对本领域普通技术人员是不明确的，则“约”和“大约”将是指所述具体项加减≤10％，“实质”和“显著”将是指所述具体项加减>10％。
用在本文中时，术语“包括”具有与术语“包含”同样的含义。术语“包含”应该解释为是“开放式”过渡术语，其容许包含权利要求中列举的那些组分之外的其他组分。术语“组成”和“由...组成”应该解释为“封闭式”过渡术语，其不容许包含权利要求中列举的组分以外的其他组分。术语“基本上由...组成”应该解释为部分封闭式的并允许只包含不会根本上改变所主张的主题的本质的其他组分。
术语“植物”用在本文中时应被广义解释并可以包括被子植物和裸子植物、双子叶植物和单子叶植物、和树。被子植物的双子叶植物的例子可以包括但不限于番茄、烟草、棉花、油菜籽、蚕豆、大豆、胡椒、莴苣、豌豆、紫花苜蓿、苜蓿、卷心菜、西兰花、菜花、抱子甘蓝、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、哈蜜瓜和向日葵。被子植物单子叶植物的例子可以包括但不限于芦笋、非甜和甜玉米、大麦、小麦、水稻、高粱、洋葱、珍珠稷、黑麦、燕麦和甘蔗。木本植物可以包括但不限于果树、金合欢、桤木、山杨、山毛榉、桦树、枫香树、悬铃木、白杨、柳树、冷杉、松树、云杉、落叶松、雪松和铁杉。
术语“动物”用在本文中时应被广义解释并可以包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物可以包括人类和非人类哺乳动物，例如母牛、猪、绵羊等。非哺乳动物可以包括禽类(例如鸡、火鸡、鸭等)和鱼。
本发明人已经鉴定了很多能够改善植物生长并还具有病害和虫害控制活性的植物促生根际细菌(PGPR)。根据表现最佳的解淀粉芽孢杆菌植物亚种PGPR菌株的基因组序列分析，本发明人鉴定了在这些芽孢杆菌PGPR菌株内始终存在而在其他非植物相关的芽孢杆菌物种中不存在的一些遗传编码的功能。特别是，这些PGPR菌株可利用由植物果胶衍生的糖作为碳源和/或能源。通过对接种了芽孢杆菌孢子的植物种子补充果胶，或通过在种子萌芽后补充芽孢杆菌PGPR菌株可利用的果胶量，这将导致以下提高：1)芽孢杆菌菌株的植物根围定殖和/或2)芽孢杆菌在植物根围内的更好的持久性和/或3)响应PGPR菌株+果胶施用的更好的植物生长性能和/或4)由于PGPR菌株+果胶施用，对病害(例如细菌、真菌、病毒)或虫害(例如线虫)的生物控制更好。
PGPR
术语“植物促生根际细菌”或“PGPR”是指定殖在植物根部并且在这样做时促进植物生长和/或减少病害或来自捕食者的损害的细菌群。作为PGPR的细菌可以属于包括但不限于下列的属：不动杆菌属(Actinobacter)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，芽孢杆菌属(Bacillus)，伯克氏菌属(Burkholderia)，布丘氏菌属(Buttiauxella)，肠杆菌属(Enterobacter)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)，假单胞菌属(Pseudomonas)，拉恩氏菌属(Rahnella)，劳尔氏菌属(Ralstonia)，根瘤菌属(Rhizobium)，沙雷氏菌属(Serratia)，窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，和赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)。用在所公开的方法和组合物中的PGPR可以是单一的细菌株、种或属，或可以包含细菌株、种或属的混合物。例如，所述PGPR可以选自包括但不限于下列的属：不动杆菌属(Actinobacter)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，芽孢杆菌属(Bacillus)，伯克氏菌属(Burkholderia)，布丘氏菌属(Buttiauxella)，肠杆菌属(Enterobacter)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)，假单胞菌属(Pseudomonas)，拉恩氏菌属(Rahnella)，劳尔氏菌属(Ralstonia)，根瘤菌属(Rhizobium)，沙雷氏菌属(Serratia)，窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，和赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)。
芽孢杆菌属用在本文中时是指革兰氏阳性的棒形细菌，其是厚壁菌门的成员。在逆境条件下，所述芽孢杆菌细菌产生卵圆形的内生孢子，其可长时间停留在休眠状态。芽孢杆菌细菌可以基于它们的16S rRNA或其片段的核苷酸序列(例如，16S rRNA或rDNA核苷酸序列的大约1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt或1500nt片段)来表征和鉴别。芽孢杆菌细菌可以包括但不限于酸快生芽孢杆菌(B.acidiceler)、酸居芽孢杆菌(B.acidicola)、产酸芽孢杆菌(B.acidiproducens)、B.aeolius、空气芽孢杆菌(B.aerius)、嗜气芽孢杆菌(B.aerophilus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、艾丁湖芽孢杆菌(B.aidingensis)、秋叶氏芽孢杆菌(B.akibai)、嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、藻居芽孢杆菌(B.algicola)、B.alkalinitrilicus、B.alkalisediminis、碱土芽孢杆菌(B.alkalitelluris)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis)、香鱼海槽芽孢杆菌(B.alveayuensis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、海水芽孢杆菌(B.aquimaris)、砷芽孢杆菌(B.arsenicus)、阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai)、丰井氏芽孢杆菌(B.asahii)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、橙黄色芽孢杆菌(B.aurantiacus)、产氮芽孢杆菌(B.azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(B.badius)、罕见芽孢杆菌(B.barbaricus)、巴达维亚芽孢杆菌(B.bataviensis)、北京芽孢杆菌(B.beijingensis)、食苯芽孢杆菌(B.benzoevorans)、B.beveridgei、博戈里亚芽孢杆菌(B.bogoriensis)、嗜硼芽孢杆菌(B.boroniphilus)、食丁酸芽孢杆菌(B.butanolivorans)、B.canaveralius、嗜碳芽孢杆菌(B.carboniphilus)、科研中心芽孢杆菌(B.cecembensis)、解纤维芽孢杆菌(B.cellulosilyticus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、恰甘诺湖芽孢杆菌(B.chagannorensis)、长安芽孢杆菌(B.chungangensis)、食物芽孢杆菌(B.cibi)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克氏芽孢杆菌(B.clarkii)、克劳芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、B.coahuilensis、科氏芽孢杆菌(B.cohnii)、腐叶芽孢杆菌(B.decisifrondis)、脱色芽孢杆菌(B.decolorationis)、钻特省芽孢杆菌(B.drentensis)、混料芽孢杆菌(B.farraginis)、苛求芽孢杆菌(B.fastidiosus)、坚固芽孢杆菌(B.firmus)、弯曲芽孢杆菌(B.flexus)、小孔芽孢杆菌(B.foraminis)、福氏芽孢杆菌(B.fordii)、强壮芽孢杆菌(B.fortis)、B.fumarioli、绳索状芽孢杆菌(B.funiculus)、解半乳糖芽孢杆菌(B.galactosidilyticus)、B.galliciensis、明胶芽孢杆菌(B.gelatini)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、人参芽孢杆菌(B.ginsengi)、人参土芽孢杆菌(B.ginsengihumi)、草芽孢杆菌(B.graminis)、盐敏芽孢杆菌(B.halmapalus)、B.halochares、嗜盐芽孢杆菌(B.halodurans)、解半纤维素芽孢杆菌(B.hemicellulosilyticus)、B.herbertsteinensis、堀越氏芽孢杆菌(B.horikoshi)、B.horneckiae、花园芽孢杆菌(B.horti)、土地芽孢杆菌(B.humi)、花津滩芽孢杆菌(B.hwajinpoensis)、病研所芽孢杆菌(B.idriensis)、印度芽孢杆菌(B.indicus)、婴儿芽孢杆菌(B.infantis)、下层芽孢杆菌(B.infernus)、伊氏芽孢杆菌(B.isabeliae)、B.isronensis、咸海鲜芽孢杆菌(B.jeotgali)、韩国芽孢杆菌(B.koreensis)、库尔勒芽孢杆菌(B.korlensis)、胶冻样芽孢杆菌(B.kribbensis)、克鲁氏芽孢杆菌(B.krulwichiae)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、岸滨芽孢杆菌(B.litoralis)、盐地芽孢杆菌(B.locisalis)、路西法芽孢杆菌(B.luciferensis)、浅黄芽孢杆菌(B.luteolus)、澳门芽孢杆菌(B.macauensis)、马氏芽孢杆菌(B.macyae)、解甘露醇糖芽孢杆菌(B.mannanilyticus)、黄海芽孢杆菌(B.marisflavi)、B.marmarensis、马赛芽孢杆菌(B.massiliensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、甲醇芽孢杆菌(B.methanolicus)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)、莫哈维芽孢杆菌(B.mojavensis)、壁芽孢杆菌(B.muralis)、马丁教堂芽孢杆菌(B.murimartini)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、南海芽孢杆菌(B.nanhaiensis)、南海沉积物芽孢杆菌(B.nanhaiisediminis)、尼氏芽孢杆菌(B.nealsonii)、雷州芽孢杆菌(B.neizhouensis)、农研所芽孢杆菌(B.niabensis)、烟酸芽孢杆菌(B.niacini)、休闲地芽孢杆菌(B.novalis)、海泥芽孢杆菌(B.oceanisediminis)、奥德赛芽孢杆菌(B.odysseyi)、奥哈芽孢杆菌(B.okhensis)、奥飞騨芽孢杆菌(B.okuhidensis)、蔬菜芽孢杆菌(B.oleronius)、大岛芽孢杆菌(B.oshimensis)、B.panaciterrae、巴塔哥尼亚芽孢杆菌(B.patagoniensis)、B.persepolensis、海绵芽孢杆菌(B.plakortidis)、抱川芽孢杆菌(B.pocheonensis)、B.polygoni、假嗜碱芽孢杆菌(B.pseudoalcaliphilus)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、假真菌芽孢杆菌(B.pseudomycoides)、忍冷芽孢杆菌(B.psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、青岛芽孢杆菌(B.qingdaonensis)、井水芽孢杆菌(B.rigui)、农庄芽孢杆菌(B.ruris)、沙福芽孢杆菌(B.safensis)、盐芽孢杆菌(B.salarius)、喜盐芽孢杆菌(B.saliphilus)、施氏芽孢杆菌(B.schlegelii)、硒砷芽孢杆菌(B.selenatarsenatis)、还原硒酸盐芽孢杆菌(B.selenitireducens)、西岸芽孢杆菌(B.seohaeanensis)、沙氏芽孢杆菌(B.shackletonii)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)、简单芽孢杆菌(B.simplex)、青贮窖芽孢杆菌(B.siralis)、史氏芽孢杆菌(B.smithii)、土壤芽孢杆菌(B.soli)、盐土芽孢杆菌(B.solisalsi)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐热芽孢杆菌(B.sporothermodurans)、同温层芽孢杆菌(B.stratosphericus)、地下芽孢杆菌(B.subterraneus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、B.taeansis、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、热南极芽孢杆菌(B.thermantarcticus)、热嗜淀粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)、B.thermocloacae、B.thermolactis、产硫芽孢杆菌(B.thioparans)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、B.tripoxylicola、B.tusciae、死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)、威氏芽孢杆菌(B.vedderi)、越南芽孢杆菌(B.vietnamensis)、原野芽孢杆菌(B.vireti)、和光芽孢杆菌(B.wakoensis)、威恩施蒂芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)、小溪芽孢杆菌(B.xiaoxiensis)，及其混合物和掺合物。
在本文中公开的PGPR及其接种剂可以包括解淀粉芽孢杆菌或与解淀粉芽孢杆菌密切相关的芽胞杆菌物种。与解淀粉芽孢杆菌密切相关的芽胞杆菌物种可以定义为具有包含SEQ ID NO：26的16S rDNA序列或包含与SEQ ID NO：26有至少约98％或99％序列同一性的16S rDNA序列的物种。所述PGPR优选是解淀粉芽孢杆菌植物亚种或与解淀粉芽孢杆菌植物亚种密切相关的芽胞杆菌物种。解淀粉芽孢杆菌植物亚种是定殖在植物根部并通常表现淀粉酶活性的解淀粉芽孢杆菌亚种。对所公开的方法和组合物合适的PGPR菌株可包括所具有的gyrB基因与来自解淀粉芽孢杆菌植物亚种的菌株的gyrB基因表现出序列同一性的PGPR菌株。在一些实施方式中，用于所公开的方法和组合物中的PGPR菌株在gyrB基因处与SEQ ID NO：25的多核苷酸序列具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，SEQ ID NO：25的多核苷酸序列是来自解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株的gyrB基因的多核苷酸序列。
用于所公开的组合物和方法中的合适的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株可包括但不限于解淀粉芽孢杆菌植物亚种AS43.3、解淀粉芽孢杆菌植物亚种TrigoCor1448、解淀粉芽孢杆菌植物亚种UCMB5033、解淀粉芽孢杆菌植物亚种UCMB5113、解淀粉芽孢杆菌植物亚种EBL11、解淀粉芽孢杆菌植物亚种W2、解淀粉芽孢杆菌植物亚种UCMB5036、解淀粉芽孢杆菌植物亚种IT-45、解淀粉芽孢杆菌植物亚种UASWS BA1、解淀粉芽孢杆菌植物亚种LFB112、解淀粉芽孢杆菌植物亚种CAUB946、解淀粉芽孢杆菌植物亚种M27、解淀粉芽孢杆菌植物亚种B1895、解淀粉芽孢杆菌植物亚种SQR9、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AH159-1、解淀粉芽孢杆菌植物亚种DC-12、解淀粉芽孢杆菌植物亚种YAU B9601-Y2、解淀粉芽孢杆菌植物亚种Y2、解淀粉芽孢杆菌植物亚种EGD_AQ14、解淀粉芽孢杆菌植物亚种NAU-B3、解淀粉芽孢杆菌植物亚种FZB42、解淀粉芽孢杆菌植物亚种CC178、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP79、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP71、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP143、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP193、解淀粉芽孢杆菌植物亚种AB01、和解淀粉芽孢杆菌植物亚种GB03。
对在本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株和其接种剂可包括表达一种或多种果胶代谢相关蛋白的PGPR菌株。在一些实施方式中，所述PGPR菌株可表达一种或多种果胶代谢相关蛋白，所述蛋白可包括但不限于由选自下列的基因编码的蛋白：uxaA(阿卓糖酸脱水酶)，uxaB(阿卓糖氧化还原酶)，uxaC(糖醛酸异构酶)，uxaA(甘露糖酸脱水酶)，uxuB(D-甘露糖酸氧化还原酶)，kdgA(4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶)，kdgK(2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶)，exuR(己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白)，exuT(己糖醛酸转运蛋白)，及其组合。在一些实施方式中，所述PGPR菌株可表达一种或多种选自果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的果胶酶。
uxaA基因编码的酶是阿卓糖酸脱水酶(EC：4.2.1.7)，其将D-阿卓糖酸转化为2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸和水。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达阿卓糖酸脱水酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：1提供了编码阿卓糖酸脱水酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：2提供了阿卓糖酸脱水酶的氨基酸序列。
uxaB基因编码的酶是阿卓糖酸氧化还原酶(EC：5.3.1.12)，其将D-阿卓糖酸和NAD+转化为D-塔格糖酮酸和NADH。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达阿卓糖酸氧化还原酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：3提供了编码阿卓糖酸氧化还原酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：4提供了阿卓糖酸氧化还原酶的氨基酸序列。
uxaC基因编码的酶是糖醛酸异构酶(EC：1.3.1.12)，其将D-葡萄糖醛酸转化为D-果糖酮酸和将D-半乳糖醛酸转化为D-塔格糖酮酸。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达糖醛酸异构酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：5提供了编码阿卓糖酸氧化还原酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：6提供了阿卓糖酸氧化还原酶的氨基酸序列。
uxuA基因编码的酶是甘露糖酸脱水酶(EC：4.2.1.8)，其将D-甘露糖酸转化为2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达甘露糖酸脱水酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：7提供了编码甘露糖酸脱水酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：8提供了甘露糖酸脱水酶的氨基酸序列。
uxuB基因编码的酶是D-甘露糖酸氧化还原酶(EC：1.1.1.57)，其将D-甘露糖酸和NAD+转化为D-果糖酮酸和NADH。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达D-甘露糖酸氧化还原酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：9提供了编码阿卓糖酸氧化还原酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：10提供了阿卓糖酸氧化还原酶的氨基酸序列。
kdgA基因编码的酶是4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)，其将4-羟基-2-酮戊二酸转化为丙酮酸和乙醛酸，和将2-脱氢-3-脱氧-6-磷酸-D-葡萄糖酸转化为丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：11提供了编码4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：12提供了4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶的氨基酸序列。
kdgK基因编码的酶是2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶(EC 2.7.1.45)，其使2-酮-3-脱氧葡糖酸(KDG)磷酸化以产生2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶的PGPR菌株。SEQ ID NO：13提供了编码2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：14提供了2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶的氨基酸序列。
exuR基因编码己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白的PGPR菌株。SEQ ID NO：15提供了编码己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白的多核苷酸序列。SEQID NO：16提供了己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白的氨基酸序列。
exuT基因编码表现出己糖醛酸跨膜转运蛋白活性的己糖醛酸转运蛋白。因此，对本文中公开的方法和组合物合适的PGPR菌株及其接种剂可包括表达己糖醛酸转运蛋白的PGPR菌株。SEQ ID NO：17提供了编码己糖醛酸转运蛋白的多核苷酸序列。SEQ ID NO：18提供了己糖醛酸转运蛋白的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述PGPR菌株可表达一种或多种选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)和果胶酯酶(EC3.1.1.11)的果胶酶。SEQ ID NO：19提供了编码果胶酸裂解酶前体的多核苷酸序列。SEQ IDNO：20提供了果胶酸裂解酶前体的氨基酸序列。SEQ ID NO：21提供了编码果胶裂解酶样蛋白的多核苷酸序列。SEQ ID NO：22提供了果胶裂解酶样蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：23提供了编码果胶裂解酶的多核苷酸序列。SEQ ID NO：24提供了果胶裂解酶的氨基酸序列。
“序列同一性百分比”可以通过利用在国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(NCBI)网站可得到的基本局部比对搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)(BLAST)(即，如Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，"Blast 2 sequences-比较蛋白和核苷酸序列的新工具(Blast 2 sequences-anew tool for comparing protein and nucleotide sequences)"，FEMS MicrobiolLett.174：247-250中所述的“bl2seq”，所述文献通过引用以其整体并入本文中)比对相等长度的两个序列来确定。例如，SEQ ID NO：1和另一个比较序列之间的序列同一性百分比可以通过利用NCBI网站提供的联机BLAST软件比对这两个序列确定。
两个脱氧核糖核苷酸序列之间的“序列同一性百分比”也可以利用对多次命中进行校正的Kimura 2-参数距离模型确定，将过渡和颠换取代率纳入考虑，同时假定四种核苷酸的频率是相同的并且取代率在位点之中不变化(Nei和Kumar，2000)，如在MEGA 4中实施的那样(Tamura K，Dudley J，Nei M&Kumar S(2007)MEGA 4：分子进化遗传学分析(MEGA)软件4.0版(MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)softwareversion4.0).Molecular Biology and Evolution 24：1596-1599)，优选4.0.2或更新的版本。空位开放和空位延伸罚分分别设成15和6.66。末端空位不罚分。延时发散序列开关(delaydivergent sequences switch)设定为30。转变加权分数是35设置为0.5，作为完全失配和配对分数之间的平衡。使用的DNA加权矩阵是IUB评分矩阵，其中x's和n's与任何IUB歧义符号匹配，并且所有匹配评分为1.9，所有失配评分为O。
果胶和果胶相关的糖类
为了以糖提高PGPR在促进植物生长和植物健康方面的效力，所公开的组合物和方法包括或利用果胶或果胶衍生的糖。“果胶”是陆生植物的初生细胞壁中天然存在的杂多糖，典型的分子量为60–130,000g/mol，该分子量基于果胶的来源和提取条件而异。用在本文中时，“果胶”意味着包括从它的天然状态提取的提取果胶(例如，来自陆生植物的初生细胞壁的提取果胶)。
用于所公开的组合物和方法中的果胶或果胶相关糖类可以是分离的或基本纯化的。术语“分离的”或“基本纯化的”是指果胶或果胶相关糖类已经从自然环境取出并已经分离或离析，并且与它们天然相伴的其他组分至少60％游离、优选至少75％游离、更优选至少90％游离、更加优选至少95％游离并最优选至少100％游离，所述其他组分可以包括但不限于纤维素。
虽然果胶的组成在植物之中可以变化，但果胶通常具有D-半乳糖醛酸是主要单体成分的组成(即，通常D-半乳糖醛酸占果胶的单体成分的>50％)。果胶的D-半乳糖醛酸残基可以被D-木糖或D-芹菜糖取代，从而分别形成从D-半乳糖醛酸残基分支的木糖半乳糖醛酸聚糖和芹半乳糖醛酸聚糖。所谓的“鼠李糖半乳糖醛酸聚糖果胶”含有D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖的重复二糖骨架。
在自然界，果胶中半乳糖醛酸的大部分羧基被甲醇酯化(即，果胶中半乳糖醛酸的>50％和多达80％的羧基被甲醇酯化)。在提取期间，在提取可导致酯键水解的情况下，该百分比可降低，并且提取的果胶可以分类为高酯对比被酯化的半乳糖醛酸残基<50％的低酯果胶。未酯化的半乳糖醛酸单元可以是游离的酸(即，羧基)或与钠、钾或钙的盐(即，半乳糖醛酸盐)。
在自然界，D-半乳糖醛酸可以从D-葡萄糖醛酸衍生物合成(例如，从UDP-D-葡萄糖醛酸经由4-差向异构化)并且反之，果胶中的D-半乳糖醛酸可以代谢而形成D-葡萄糖醛酸衍生物(例如，经由低聚半乳糖醛酸裂解的5-脱氢-4-脱氧-D-葡萄糖醛酸)。用在本文中时，果胶相关的糖类包括果胶衍生的糖类，例如水解果胶、D-半乳糖醛酸(或D-半乳糖醛酸盐)、和D-葡萄糖醛酸(或D-葡萄糖醛酸盐)、或其组合。
本文中公开的组合物和方法可以包括或利用作为由选自下列的基因编码的酶或转运蛋白的底物的糖类：uxaA(阿卓糖酸脱水酶)，uxaB(阿卓糖氧化还原酶)，uxaC(糖醛酸异构酶)，uxuA(甘露糖酸脱水酶)，uxuB(D-甘露糖酸氧化还原酶)，kdgA(4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶)，kdgK(2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶)，exuR(己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白)，exuT(己糖醛酸转运蛋白)，及其组合。本文中公开的组合物和方法可以包括或利用作为果胶酶(例如，选自果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的果胶酶)的底物的糖类。
这样的底物可以包括但不限于源自于果胶的糖类，例如D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸。所述糖类可以包含糖的混合物或者所述糖类可以包含杂多糖。在所述糖类是糖的异质混合物或者所述糖类是杂多糖的实施方式中，优选D-半乳糖醛酸单体单元、D-葡萄糖醛酸单体单元、或D-半乳糖醛酸单体单元和D-葡萄糖醛酸单体单元的总和占所述糖的异质混合物或所述杂多糖中总单体单元的>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、或>95％。
所公开的果胶和果胶相关物质可包括合成果胶。合成果胶可包括通过体外聚合果胶单体(例如糖醛酸)以形成被称为合成果胶的果胶样物质而合成的果胶(参见，例如，美国专利No.2,156,223。此外，所公开的果胶和果胶相关物质可包括天然和非天然存在的聚糖醛酸。
接种剂
本公开的PGPR可以配制为用于植物的接种剂。术语“接种剂”是指包括分离的PGPR培养物和任选的载体的制剂。包含PGPR和载体的接种剂是本领域已知的。(参见，例如，Bashan，“用于农业中的植物促生菌的接种剂(Inoculants of Plant Growth-PromotingBacteria for use in Agriculture)”，Biotechnology Advances，Vol.16，No.4，729-770页，1998)。PGPR接种剂可以施用于植物(例如植物的根部)、种子(例如，作为种子的包衣或在所述种子栽种时施用)、或土壤(例如，要处理的植物周围的土壤)。
PGPR接种剂可以描述为在载体材料中含有一个或多个PRPR物种的制剂，所述载体材料可以是有机载体、无机载体、或从规定的分子合成的载体。任选地，所述载体可以是无菌的或在与所述PGPR配制在一起形成所述PGPR接种剂之前灭菌。优选地，所述载体是无毒的、可生物降解的和非污染性的。在所公开的包含果胶糖类的接种剂中，所述果胶糖类任选可起载体的作用或任选所述接种剂可包含所述果胶糖类以外的载体。
所述PGPR接种剂的载体是活PGPR到所述植物、种子或土壤的传递介质。所述载体占所述接种剂体积或重量的大部分。合适的载体可以包括具有将足够数量的活PGPR细胞传递给所述植物、种子或土壤的能力的液体、粉末(例如，平均有效粒径0.075至0.25mm)、颗粒(例如，平均有效粒径0.35至1.18mm)、和浆液。优选地，所述载体延长了所述PGPR的保存期(例如，致使所述PGPR在室温下具有至少1或2年的保存期)。载体的例子包括但不限于泥炭、煤、粘土、无机土壤材料、植物废料、堆肥、农家肥、大豆粕、豆油、花生油、麦麸、惰性材料例如蛭石、珍珠岩、磷酸盐、聚丙烯酰胺、藻酸盐珠子、油脱水的细菌(oil-dried bacteria)。在一些实施方式中，所述PGPR可以被载体囊封，例如，在所述载体是在所述PGPR周围形成基质的碳水化合物的情况下。
所述接种剂包括相对于载体适量的PGPR。在一些实施方式中，所述接种剂包括102-1012cfu PGPR/ml载体(或/克载体)，或104-1010cfu PGPR/ml载体(或/克载体)，或106-108cfu PGPR/ml载体(或/克载体)。所述组合物可以包括其他添加剂，包括缓冲剂、表面活性剂、佐剂或涂层剂。
用于所公开的组合物和方法中的PGPR可以是分离的或基本纯化的。术语“分离的”或“基本纯化的”是指PGPR已经从自然环境取出并已经分离或离析，并且与它们天然相伴的其他组分至少60％游离、优选至少75％游离、更优选至少90％游离、更加优选至少95％游离并最优选至少100％游离。“分离培养物”是指不包括显著量的其他材料的所述PGPR培养物，例如正常存在于所述PGPR生长和/或正常可以从中得到所述PGPR的土壤中的其他材料。“分离培养物”可以是不包括其量足以干扰所述“分离培养物”复制的任何其他生物、微生物和/或细菌物种的培养物。PGPR的分离培养物可以合并以制备PGPR的混合培养物。
处理植物、种子或土壤的方法
还公开了利用果胶或果胶相关糖类来改善PGPR在促进植物生长或健康方面的效力的方法。所公开的方法可包括向植物、种子或土壤施用上述包含PGPR和果胶糖类的接种剂。在一些实施方式中，所述公开的改善植物生长或植物健康的方法可包括：(a)用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)处理植物、种子或土壤和(b)用包含果胶或果胶相关糖类(例如水解果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、或其混合物)的糖类处理所述植物、种子或土壤，其中所述植物、种子或土壤可以用所述PGPR和所述糖类同时或以任何顺序(即，所述PGPR可以在所述糖类施用之前、同时或之后施用)处理。所述PGPR和果胶糖类可以配制为接种剂并同时施用以处理植物(例如，施用于植物根部)、种子(例如，作为种子包衣)、或土壤(例如，作为土壤调理剂)。
所公开的方法可以用于通过控制土传虫害来改善植物生长或植物健康。通过所公开的方法控制的土传虫害可包括但不限于线虫和草食性昆虫。所公开的方法可用于通过控制或处理病害来改善植物生长或植物健康。通过所公开的方法控制或处理的病害可包括但不限于细菌病、真菌病和病毒病。
本公开的PGPR和果胶糖类可以作为用于处理植物的接种剂施用。本文中考虑的处理方法可包括直接处理植物，包括直接处理植物的叶、茎或根。本文中考虑的处理方法可包括处理植物的种子，例如，在所述种子栽种之前将所述种子包衣以产生处理的植物。本文中考虑的方法也可以包括间接处理植物，例如，通过处理所述植物周围的土壤或环境(例如，在犁沟内施加颗粒或液体)。合适的处理方法可包括经由高或低压喷洒、浇灌和/或注射来施加包括所述PGPR和所述糖类的接种剂。植物种子可以通过应用低或高压喷洒、包衣、浸泡和/或注射来处理。在如此处理植物种子后，可以栽种和栽培所述种子以产生植物。从这样的种子繁殖的植物可以进一步以一或多次施加来处理。适当的施加浓度可以凭经验决定。在所述PGPR和果胶糖类作为喷雾剂施加于植物的一些实施方式中，适当的施加浓度可包括喷洒106-1018集落形成单位(cfu)/公顷植物，更普遍是107-1015cfu/公顷。对于包衣的种子，在一些实施方式中，适当的施加浓度可以在102-108cfu/种子之间，优选104-107cfu/种子。在其他实施方式中，所述PGPR和果胶糖类可以在约102-1012cfu/ml、104-1010cfu/ml或约106-108cfu/m l的浓度下以苗木浸根或以土壤浇灌来施加。
处理动物的方法
还公开了利用果胶或果胶相关糖类来改善PGPR在促进动物生长或健康方面的效力的方法。所公开的方法可包括向动物施用前述的包含PGPR和果胶糖类的接种剂(例如，以动物饲料组合物例如包含前述接种剂的颗粒饲料组合物的形式)。在一些实施方式中，所述公开的改善动物生长或动物健康的方法可包括：(a)向动物施用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)和(b)向所述动物施用包含果胶或果胶相关糖类(例如水解果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、或其混合物)的果胶糖类，其中所述动物可以同时或以任何顺序施用所述PGPR和所述果胶糖类(即，所述PGPR可以在所述糖类施用之前、同时或之后施用)。
包含所述PGPR和果胶糖类的饲料组合物可以经口施用于动物。经口施用包括但不限于在饲料、水中递送、通过经口管饲法或气溶胶喷雾递送。如果在动物饲料中供给的话，所述饲料可包含104和109cfu PGPR/g成品饲料之间。合适地，所述饲料包含105和5×107cfuPGPR/g之间的饲料。所述PGPR和果胶糖类可以在生产期间、在生产后由供应商、或由饲养动物的人员在临向动物提供食物之前添加于饲料。
为了增加全面胃肠健康、改善产出性能、以及减少对动物健康和人类食品安全两方面都重要的肠道细菌性病原体，可以实践所公开的促进动物生长或健康的方法。如果所述细菌或益生菌组合物是连续施用的，为了最佳包合率，这些PGPR和果胶糖类可以以104至109PGPR/克成品饲料的比率添加到动物饮食中，如果所述PGPR或所述组合物是间断性提供的，更高的包合率可能是必要的。虽然通过饲料施用是优选的施用途径，但所述PGPR和果胶糖类也可经由饮用水、通过路线喷雾、通过气溶胶喷雾、或通过农业动物可以摄入这些PGPR和果胶糖类的任何其他手段施用。
制备所公开的组合物和接种剂的方法
还公开了利用果胶或果胶相关糖类来制备如本文中公开的组合物和接种剂的方法。所述方法可以包括将PGPR和已经从含果胶的植物材料中提取的果胶、或果胶相关糖类合并，以制备所公开的组合物和接种剂。任选地，载体可以与所述PGPR和果胶或果胶相关糖类合并，以制备所公开的组合物和接种剂。
在一些实施方式中，所述方法可包括合并102-1012cfu PGPR/ml载体(或/克载体)，或104-1010cfu PGPR/ml载体(或/克载体)，或106-108cfu PGPR/ml载体(或/克载体)。在一些实施方式中，所述方法可包括合并已经从含有果胶的植物材料中提取的果胶，或果胶相关糖类可以与PGPR和任选的载体合并以制备所公开的组合物和接种剂，其中所述果胶或果胶相关糖类在所制备的组合物和接种剂中以至少约0.1％、0.5％、1.0％、1.5％或2.0％(w/w或w/v)至约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％或5.0％(w/w或w/v)的浓度存在。在一些实施方式中，所述方法可包括PGPR和果胶以至少约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014cfu PGPR/克果胶或果胶相关糖类至约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015cfu PGPR/克果胶或果胶相关糖类的浓度(例如，在此考虑例如107至1012cfu PGPR/克果胶或果胶相关糖类的范围)合并。在所述方法中，包括缓冲剂、表面活性剂、佐剂和包衣剂在内的其他添加剂可以与所述PGPR、果胶或果胶相关糖类、和任选的载体合并，以便制备所公开的组合物和接种剂。本文中也考虑了通过前面公开的方法制备的组合物和接种剂。
实施例
以下实施例是说明性的，并不打算限制所主张的主题的范围。参考Hossain等，“通过解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株的比较基因组破译牵涉植物病害的保守遗传基因座(Deciphering the conserved genetic loci implicated in plant disease throughcomparative genomics of Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum strains)”，Frontiers in Plant Science，2015年8月17日；6：631doi：10.3389/fpls.2015.00631.eCollection 2015，(以下称为“Hossain等，Frontiers Plant Science2015”)，其内容通过引用以其整体并入本文中。
实施例1–通过解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株的比较基因组破译牵涉植物病害的 保守遗传基因座
摘要
为了了解植物促生根际细菌(PGPR)菌株的促生长和病害抑制活性，对12个有PGPR活性的枯草杆菌群菌株的基因组进行测序和分析。这些枯草芽孢杆菌菌株表现出高基因组多样性，而解淀粉芽孢杆菌菌株(枯草芽孢杆菌群的成员)的基因组高度保守。成对BLASTp矩阵揭示，在芽孢杆菌基因组之中基因家族相似性范围从32-90％，在解淀粉芽孢杆菌植物亚种的核心基因组内有2,839个基因。解淀粉芽孢杆菌菌株的比较基因组分析鉴定了与生物控制和根部和/或叶片定殖相关联的基因，包括唯一与植物亚种菌株相关的73个基因，其具有与信号传导、转运、次级代谢产物生产和碳源利用相关的预测功能。虽然解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株含有编码许多不同次级代谢产物的基因簇，但只有编码杀艰菌素和大环内酰亚胺(macrolactin)的聚酮生物合成簇在这个亚种内是保守的。为了评价它们在植物病原体生物控制中的作用，在解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株中删除了参与次级代谢产物生物合成的基因揭示了杀艰菌素表达在减轻由地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种在番茄植物中引起的病害的严重度上是至关重要的。本实施例定义了PGPR菌株的基因组特征并将它们与生物控制活性和宿主定殖联系起来。
引言
对植物生长和发育发挥有益效应的植物根部伴生细菌被称为植物促生根际细菌(PGPR)(Kloepper和Schroth，1978；Kloepper等，2004)。芽孢杆菌和假单胞菌某些种(Pseudomonas spp.)在与PGPR活性有关的多个细菌属之中是突出的(Podile和Kishore，2006)。枯草芽孢杆菌群的成员，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、莫哈维芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌，已经因它们刺激植物生长和抑制根围和叶围内病原体的能力而被鉴定为PGPR菌株(Kloepper等，2004；Hao等，2012；Kim等，2012)。解淀粉芽孢杆菌的菌株因它们对植物生长的正面效应而被广泛使用(Idriss等，2002)。Reva等(Reva等，2004)报告了来自植物或土壤的七种芽孢杆菌分离物密切相关，然而与解淀粉芽孢杆菌型菌株DSM7T截然不同。另外，这些菌株对根围定殖比枯草芽孢杆菌群的其他成员更熟练。GB03(Nakkeeran等，2005)、INR7(Kokalis–Burelle等，2002)和FZB42(Chen等，2007a)是枯草芽孢杆菌群内已经在不同的商业制剂中广泛用于促进植物生长的PGPR菌株。
除了促进植物生长之外，PGPR菌株还可以表现出植物病害的生物控制。通过产生抑制性生物活性化合物的抗生作用、和诱导的***性抗病性是广泛报告的芽孢杆菌某些种PGPR菌株的生物控制机制(Ryu等，2004)。PGPR芽孢杆菌某些种菌株产生与观察到的针对植物病原体的生物控制活性相关的多种抗微生物化合物，包括抗生素(Emmert等，2004)、挥发性有机物(VOC)(Yuan等，2012)、和脂肽(Ongena等，2007)。例如，解淀粉芽孢杆菌NJN-6产生11种提供针对尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)的杀真菌活性的VOC(Yuan等，2012)。类似地，枯草杆菌菌株产生脂肽(例如表面活性素和丰原素(fengycin))，其在豆类植物中诱导***性抗病性(Ongena等，2007)。PGPR菌株通常需要广泛定殖植物根部以利用直接和间接两种机制发挥促植物生长的效应(Lugtenberg和Kamilova，2009)，但诱导***性抗病性(ISR)不需要广泛的根部定殖(Kamilova等，2005)。在一些PGPR菌株中，根部定殖是通过抗生作用的生物控制活性的先决条件(Chin等，2000)。例如，解淀粉芽孢杆菌植物亚种FZB42通过有效的植物根部定殖发挥促生长活性(Fan等，2011)。以前，已经证明了参与DegU——解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9的双组分反应调节剂——的磷酸化的基因的过表达，正面影响根部定殖以及通过PGPR菌株的其他促生长活性来控制黄瓜萎蔫病(Xu等，2014)。此外，可通过克隆有效根部定殖所需要的的基因来改善差根部定殖者的根部定殖能力(Dekkers等，2000)。PGPR的竞争性根部定殖受许多基因和/或遗传基因簇的控制(Dietel等，2013)，因此如果缺乏那些PGPR菌株的基因组序列，鉴定这些参与竞争性根部定殖的遗传基因座是挑战性的(Lugtenberg和Kamilova，2009)。分析更多的PGPR菌株将有助于阐明竞争性根部定殖的机制、PGPR菌株的抗生作用和ISR、并形成增加这些细菌促植物生长能力的遗传工程和其他策略的基础。
在本实施例中，我们对来自多个场所的12个枯草杆菌群分离物的基因组进行测序。PGPR菌株和没有针对植物病原体的生物控制活性的任何报告的所述枯草芽孢杆菌群的对照菌株的比较性基因组分析提供了对参与PGPR活性的基因组特征的深入了解。PGPR菌株AP193，其抑制植物和动物细菌性病原体的生长(Ran等，2012)，是评价预测参与有助于生物控制活性的生物活性次级代谢产物特别是杀艰菌素(dfnD突变体)、表面活性素(srfAA突变体)的生物合成的基因以及通过非核糖体肽合成产生的所有聚酮和脂肽、包括杀艰菌素(sfp突变体)的相对贡献的理想候选者。然后测试突变体体外抑制植物病原体和在番茄中控制细菌性斑点病的能力。
材料和方法
菌株、质粒和生长条件本实施例中使用的菌株和质粒在表1中列出。大肠杆菌(E.coli)和芽孢杆菌菌株在Luria-Bertani(LB)培养基中生长；然而，为了制备电感受态细胞，解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP193在NCM培养基(17.4g K2HPO4，11.6g NaCl，5g葡萄糖，5g胰蛋白胨、1g酵母抽提物、0.3g柠檬酸三钠、0.05g MgSO4·7H2O和91.1g山梨糖醇在1L去离子水中，pH 7.2)中生长。为了产生次级代谢产物，芽孢杆菌培养物在胰蛋白大豆肉汤(TSB)中30℃下生长48h。另外，氨苄西林(100μg/ml)、氯霉素(12.5μg/ml)、或红霉素(大肠杆菌200μg/ml或芽孢杆菌5μg/ml)根据需要用作生长培养基中的选择剂。
测序，装配和注释.芽孢杆菌某些种基因组的新一代测序使用Illumina andRoche 454测序平台进行。使用Nextera DNA样品制备试剂盒(Epicentre，Madison，WI)制备AP71、AP79和AB01菌株的索引Illumina文库并利用Illumina MiSeq与2×250双端测序试剂盒生成序列。利用DNA样品制备试剂盒(Lucigen，Middleton，WI)构建菌株AP143、AP193和AP254的条码Illumina文库，并在EnGenCore(南加州大学(Univ.of SouthCarolina))利用454-焦磷酸测序平台测序。枯草芽孢杆菌GB03、短小芽孢杆菌INR7、莫哈维芽孢杆菌KCTC 3706T、特基拉芽孢杆菌KCTC 13622T、暹罗芽孢杆菌KCTC 13613T和索诺拉沙漠芽孢杆菌KCTC 13918T的基因组DNA文库构建和测序在国家环境管理设备中心(National Instrument Center for Environmental Management)(首尔，韩国)利用Illumina HiSeq 2000测序平台进行。修整序列读本以求质量，然后利用CLC基因组工作台(CLCBio，Cambridge，MA)从头装配。基因预测和注释分别利用GeneMark(Lukashin和Borodovsky，1998)和RAST注释服务器(Aziz等，2008)进行。各个开放阅读框(ORF)与次级代谢产物生物合成基因簇的同一性依靠GenBank数据库通过BLASTx证实。AB01、AP71、AP79、AP143、AP193、AP254、GB03(Choi等、2014)、INR7(Jeong等、2014)、KCTC 3706T、KCTC 13613T(Jeong等、2012)、KCTC 13918T、和KCTC 13622T菌株的基因组序列读本保藏在NCBI的短读本档案(Short Read Archive)(SRA)中，登录号分别为SRR1176001、SRR1176002、SRR1176003、SRR1176004、SRR1176085、和SRR1176086、SRR1034787、SRR1141652、SRR1141654、SRR1144835、SRR1144836和SRR1144837。
确定平均核苷酸同一性基因组之间的平均核苷酸同一性(ANI)利用根据以前描述的方法(Goris等，2007)估算ANI的ANI计算器来计算。
芽孢杆菌物种的种系发生分析对于种系发生分析，从序列数据检索各菌株的gyrB基因序列(图1中呈现了25个菌株的名单)。菌株AS43.3、FZB42、YAU B9601-Y2、CAU B946、和5B6用作解淀粉芽孢杆菌植物亚种的代表性菌株；菌株DSM7、LL3和TA208用作解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种的代表性菌株。所述gyrB种系发生树用MEGA5.05(Tamura等，2011)利用近邻结合(Saitou和Nei，1987)和最大似然性(ML)方法(Felsenstein，1981)推导。含有空位或缺失数据的所有位置从最终数据集中淘汰，产生gyrB序列的1911bp的位置。我们使用729,383bp的DNA来呈现在跨枯草芽孢杆菌群的25个菌株发现的保守核心基因组，以利用RAxML(v 7.2.7)生成种系基因组树(Pfeiffer和Stamatakis，2010)。所述种系基因组树然后用iTOL(http：//itol.embl.de)(Letunic和Bork，2011)显现。
BLAST矩阵BLAST矩阵算法利用以前描述的方法(Friis等，2010)，用于芽孢杆菌PGPR菌株蛋白质组的逐对比较。BLAST矩阵通过测量菌株之间共有的保守基因家族与各菌株内基因家族总数的比率，来确定蛋白质组之间的平均相似度百分比。各菌株的共有和总基因家族的绝对数在矩阵输出中显示。这种矩阵显示了各蛋白质组之间共有的蛋白质数量。
核心基因组分析利用编码和非编码序列生成13个芽孢杆菌某些种菌株的核心基因组。来自这些菌株的全基因组序列利用progressive Mauve(Darling等，2004)比对，其在XMFA格式中鉴别和比对局部在同一直线上的区段(LCB)。来自比对的LCB利用500bp的最小长度，用stripSubsetLCB(http：//gel.ahabs.wisc.edu/mauve/snapshots/)收集。所有LCB都利用Perl脚本解释器连接和转化为multifasta格式。同样的方案用于得到所有核心序列，除了LCB的最小长度是50bp，而不是500bp。从2014年8月为止在GenBank中可得到的所有的芽孢杆菌某些种全基因组(n＝81个基因组)的比较性比对，得到芽孢杆菌某些种核心基因组。从包括41个得自GenBank的基因组和12个在本实施例中测序的PGPR基因组在内的53个枯草芽孢杆菌菌株全基因组的比较性分析，得到枯草芽孢杆菌群的核心基因组。解淀粉芽孢杆菌物种水平和解淀粉芽孢杆菌植物亚种水平核心基因组从32个解淀粉芽孢杆菌和28植物亚种基因组生成。核心基因组输出到CLC基因组工作台(v 4.9)以利用RAST服务器(Aziz等，2008)评价比对和注释。用于核心基因组判定的芽孢杆菌某些种菌株的名单提供在表？中。另外，为了鉴定GPR特异性的核心基因，根据以前描述的方法(Hossain等，2013)，在本实施例中测序的PGPR菌株的原始序列读本针对非PGPR菌株枯草芽孢杆菌枯草亚种(B.subtilis subsp.subtilis)菌株168的基因组序列顺序地参考定位。.
在解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株中独有存在的核心基因的鉴定32个解淀粉芽孢杆菌菌株和28个解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株(其包括在所述解淀粉芽孢杆菌菌株内)的比对的基因组序列利用CLC基因组工作台分析以得到各个物种和亚种水平的核心基因组。植物亚种菌株AP193的修整序列读本针对植物亚种核心基因组参考定位以得到核心基因组特异性的序列读本。参考定位的参数如下：错配成本＝2，***成本＝3，缺失成本＝3，长度分数＝0.5，和相似度＝0.8。相对于植物亚种核心基因组定位的序列读本然后针对解淀粉物种核心基因组定位，以得到未被定位的序列读本。这些未被定位的序列读本，代表了在解淀粉物种水平核心基因组中不存在的植物亚种核心基因组，利用CLC基因组工作台从头装配，然后由此产生的重叠群上传给RAST以供基因预测和注释。每个由植物乳杆菌核心基因组专一编码的ORF，利用BLASTn分析，针对补充表1中列出的28个解淀粉芽孢杆菌植物亚种和四个解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种菌株的基因组序列进一步证实独有性。
PGPR菌株AP193中次级代谢产物生物合成基因簇的预测利用次级代谢产物鉴定工具antiSMASH(Blin等，2013)预测菌株AP193的次级代谢产物生物合成基因簇。使用引物步移PCR填补含有编码次级代谢产物生物合成的基因簇的重叠群之间的空位。分别通过GeneMark(Lukashin和Borodovsky，1998)和BLASTx(NCBI)进行基因预测和注释。
PGPR菌株AP193诱变的DNA操纵和质粒构建染色体DNA用E.Z.N.A.细菌DNA分离试剂盒(Omega Biotek，Atlanta，GA)分离，质粒用E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒II(OmegaBiotek)分离。本实施例中使用的引物在表2中列出。通过重叠延伸PCR(Horton等，1989)，利用剪接装配基因缺失构建物。装配的产物用凝胶/PCR DNA片段提取试剂盒(IBI)凝胶提纯，用适当的限制性内切酶消化，并克隆到pNZT1载体中以构建用于基因置换的运载质粒。
利用解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP193的无细胞提取物的体外质粒甲基化为了在转化到解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP193内之前甲基化质粒，使用为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)开发的方法，有少许修改(Alegre等，2004)。来自菌株AP193的100ml过夜培养物(OD600＝1.3-1.5)的细胞通过离心(8000×g)沉淀，用100ml冷PENP缓冲液(10mM磷酸钾，10mM EDTA，50mM NaCl，和0.2mM PMSF，pH 7.0)洗涤，然后重悬浮至最终体积4ml。通过利用Vibra-Cell声波仪进行两次冲击(振幅50，脉冲3和瓦数25-30)，每次5min，有2min停顿，来破坏细胞，并用冰冷却以防过热。通过4℃下离心(8000×g)除去细胞碎片，通过倾析收集提取物。3ml的提取物等份与3ml甘油(100％v/v)和0.6ml牛血清清蛋白(1mg/ml)混合，然后储存在-20℃。
在以下成分的100μl最终体积中进行DNA修饰测定：53μl TNE缓冲液[50mM Tris(pH 7.5)，50mM NaCl，10mM EDTA]，10μl S-腺苷甲硫氨酸(0.8mM)，2μl BSA(5mg/ml)，25μl源自于菌株AP193的无细胞提取物和10μl从大肠杆菌K12ER2925提取的质粒DNA(0.5-1μg/μl)。所述混合物在37℃温育16h。用DNA Clean&Concentrator试剂盒(Zymo Research，CA)提取甲基化的DNA，然后重悬浮在水中并储存在-20℃。
解淀粉芽孢杆菌植物亚种AP193的电转化为了制备电感受态细胞，菌株AP193在TSB中生长过夜，然后在NCM中稀释100倍以接种传代培养物。所述培养物在旋转振荡器上37℃下生长直到OD600达到0.7。细胞培养物在冰上冷却15min并在4℃以8000×g进行离心5min。用冰冷的ETM缓冲液(0.5M山梨糖醇，0.5M甘露糖醇，和10％甘油)洗涤四次后，电感受态细胞重悬浮在1/100体积的原培养物中(Zhang等，2011)。为了电穿孔，100μl细胞与100ng质粒DNA在冰冷的电穿孔皿(1mm电极间隙)中混合。细胞暴露于由Gene-Pulser(Bio-RadLaboratories)生成的单个21kV/cm脉冲，电阻和电容分别设置为200Ω和3μF。所述细胞立即稀释到1ml恢复培养基(NCM加上0.38M甘露糖醇)(Zhang等，2011)中并在30℃或37℃温和振荡3h以允许抗生素抗性基因的表达。等份的所述恢复培养物然后涂布在补充了适当抗生素的LB琼脂上。
用于菌株AP193基因组修饰的两步置换重组程序两步置换重组按以前所述进行，有少许修改(Zakataeva等，2010)。为了将所述质粒整合到AP193的染色体中，必须发生靶基因和所述质粒的同源序列之间的单交换。为此，含有带缺失构建物的运载质粒的AP193首先在LB肉汤中37℃下生长24h(质粒复制的非许可温度)。接着，连续稀释所述培养物，在有红霉素的LB琼脂板上铺板，并在37℃温育。通过菌落PCR利用两组引物筛选克隆。每组引物退火所述同源片段之一和紧挨另一个同源片段之外的染色体区域特异性的序列。如果PCR产物相对于任一引物组的野生型基因型的尺寸减小，这表明所述质粒的染色体整合成功。在第二步中，整合体的克隆在30℃下伴充气在LB中培养24-48h以启动第二个单交换事件，导致所述质粒切除，产生红霉素敏感(EmS)克隆，其在所述染色体上有亲本或突变的等位基因。利用菌落PCR，通过位于所删除序列的侧翼的引物组来检查所需突变的存在。
次级代谢产物生物合成缺陷的菌株AP193的构建本实施例中生成的所有突变株在表1中指示。如下实现dfnD基因的破坏：利用AP193基因组DNA作为模板，PCR扩增相对于dfnD翻译起始位点-867至+247和+643至+1570位所对应的DNA片段。这两个片段然后通过融合PCR装配。在融合期间引入移码突变以确保完全破坏所述基因。所述缺失构建物用XhoI和SpeI消化，然后克隆到pNZT1中，产生pNZ-dif。所述质粒如上所述在体外甲基化并通过电穿孔被引入菌株AP193中。一旦被引入菌株AP193，则质粒pNZ-dif通过两步置换重组生成AP193ΔdfnD等基因突变体。
为了生成sfp缺失突变体，相对于sfp翻译起始位点-781至+29位和相对于sfp翻译终止位点+95至+935位所对应的DNA片段利用AP193基因组DNA作为模板进行PCR扩增，通过融合PCR装配，用HindIII和PstI消化，并克隆到pNZT1中以构建pNZ-sfp。所述质粒pNZ-sfp用于利用上述程序生成突变体AP193Δsfp。
如下得到ΔsrfAA突变体：PCR扩增相对于srfAA翻译起始位点+5375至+6091和+6627至+7366位所对应的DNA片段，通过融合PCR融合，用HindIII和PstI消化，并克隆到pNZT1中成为pNZ-srf。同样地，在所述靶缺失序列的上游和下游片段融合期间引入移码突变，以确保完全破坏所述基因。所述质粒pNZ-srf用于利用上述程序生成突变体AP193ΔsrfAA。
PGPR菌株AP193及其突变体针对植物病原体的体外抗微生物活性植物病原体丁香假单胞菌烟草致病变种、放射型根瘤菌、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种在TSB中生长直至OD600达到1.0。野生型菌株AP193，以及在本实施例中开发的三种等基因突变体ΔdfnD、Δsfp和ΔsrfAA，在TSB中30℃下以220rpm生长48h。培养物然后10,000×g离心2min，然后上清液通过0.2μm尼龙过滤器(VWR，PA)。为了抗生作用测定，每种植物病原体的100μl过夜培养物分别涂布在TSA板(Thermo Scientific，NY)上，然后使用无菌木塞钻孔器(10mm直径)在琼脂板中钻孔。分别添加AP193和它的三种突变体的过滤上清液来填充孔。让板干燥，然后在30℃温育过夜。测量抑制区并在突变体和野生型菌株AP193之间比较以确定它们针对植物病原体的抗微生物活性。
细菌上清液的LC-MS分析细菌培养物在2ml TSB中生长72小时，然后以10,000x g离心10min除去细胞，继之以0.2μm过滤所述培养物上清液。样品通过在以3.03kv喷雾电压和100℃的源温运行的超高压液相色谱/QTof-质谱(Waters Acquity UPLC和Q-TofPremier，Milford，MA)上从m/z 50-1200直接注射来分析。所述MS分析以负离子模式进行，流动相为95％乙腈、5％水和0.1％甲酸。
菌株AP193和它的突变体针对植物病原体的体内抗生作用Rutgers番茄种子(ParkSeed，USA)种在泡沫聚苯乙烯盘中。栽种后三周，秧苗移植到4.5英寸用商业盆栽基材的方形盆(Sunshine mix，Sun Gro Horticulture，Agawam，Maine)中。移植后三天，用无菌水或PGPR细胞悬液(106CFU/ml)喷洒植物，所述PGPR细胞悬液洗涤三次，然后重悬浮于无菌水中并以OD600＝1.0归一化。PGPR-接种的植物放入暗处100％湿度的露舱中在24℃下两天，然后转移到温室。一天后，植物用地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种(X.axonopodispv.vesicatoria)通过在每株植物上喷洒大约10ml的107CFU/ml病原体悬液进行攻击接种。病原体接种的植物放入露舱两天，然后放入温室。植物每天浇水一次。在攻击接种的14天后进行病害严重度评级和收获。为了病害严重度评级，从每株植物下部选择四片复叶。各复叶的病害严重度通过评级每个小叶的病害严重度并计算所述复叶的平均评级来确定。小叶利用0-4评级标度来评级，其中0＝健康小叶，1＝小叶的坏死面积<20％，2＝小叶的坏死面积20-50％，3＝小叶的坏死面积51-80％，4＝小叶的坏死面积80-100％。另外，测定枝条和根部的干重。所述试验设计是随机完全区组，十份重复/处理。所述试验进行两次。
数据分析所有数据通过方差分析(ANOVA)来分析，并且所述处理均值使用SAS 9.3(SAS Institute，Gary，NC，USA)，利用Fisher保护性最小显著差数(LSD)检验在P＝0.05下分离。
结果
芽孢杆菌物种的基因组统计和遗传相关性利用新一代测序测定12个不同的PGPR芽孢杆菌某些种菌株的基因组序列。每个芽孢杆菌某些种基因组序列和它们的装配的概括统计在表2中提供。芽孢杆菌某些种基因组的大致大小范围从2.95-4.43Mbp，平均基因组大小为3.93Mbp，其与GenBank中可得到的枯草芽孢杆菌全基因组的4.09Mbp平均基因组大小(2015年4月)相似。所述12个PGPR芽孢杆菌某些种菌株的G+C含量百分比范围从41.3-46.6％，平均45.15％，其与GenBank中可得到的枯草芽孢杆菌基因组序列的平均G+C含量百分比(43.72％)(2015年3月)相似。计算13个芽孢杆菌PGPR菌株的成对平均核苷酸同一性(ANI)，新提出的原核生物物种定义的标准(Richter和Rosselló-Móra，2009)，以确定它们在芽孢杆菌物种之中的种间相关性。PGPR芽孢杆菌某些种菌株AB01、AP71、AP79、AP143、AP193和GB03相对解淀粉芽孢杆菌FZB42(Chen等，2007a)的ANI值大于98％(数据未显示)，表明这些PGPR菌株与解淀粉芽孢杆菌物种有关系。PGPR菌株AP254相对于枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168的ANI为98.88％提示AP254与枯草芽孢杆菌有关系(数据未显示)。PGPR菌株INR7、KCTC 3706T、KCTC 13613T、KCTC 13918T和KCTC 13622T针对互相的成对ANI比较产生ANI值小于95％(数据未显示)，提示它们相互关系较远并代表了芽孢杆菌物种多样性。
芽孢杆菌菌株的种系***基于gyrB基因序列的种系发生分析显示在芽孢杆菌门类之中足够的分辩力并与ANI比较一致。菌株AP71、AP79、AP143、AP193、AB01和GB03与参考菌株解淀粉芽孢杆菌植物亚种以很高的自引支持度分类在一起，表明它们与植物亚种有关系。解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种的三个菌株DSM7、TA208和LL3聚类为单进化枝，与植物亚种分开，支持解淀粉芽孢杆菌中两个亚种的分支(Borriss等，2011)。菌株AP254的位置与枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168一起为有高自引支持度的单进化枝，提示它与枯草芽孢杆菌群的成员有关系(图1A)。利用最大似然性(ML)方法构建的基于gyrB基因的种系发生树也与利用近邻结合方法构建的种系发生一致(数据未显示)。除了基于gyrB的种系发生之外，我们还利用25个枯草芽孢杆菌群分离物的基因组内存在的核心基因组序列的729,383bp构建了种系基因组树，以提供更精细的PGPR菌株种系发生位置。所述gyrB种系发生中菌株对进化枝的布局和分布与种系基因组树相似(图1B)。一个显著的差异是所述树关于暹罗芽孢杆菌KCTC13613菌株位置的布局在所述基于gyrB的树和所述种系基因组树之间有明显差异，所述基于gyrB的种系发生将KCTC13613定位在单独的进化枝中，而所述种系基因组树将它包括在包括菌株解淀粉芽孢杆菌植物亚种的单种系群内。
BLAST矩阵利用全体对全体(all-against-all)BLASTp途径进行的13个PGPR芽孢杆菌菌株的全基因组蛋白质组比较，通过PGPR芽孢杆菌某些种基因组之间的基因家族相似性范围从32-90％(数据未显示)，证明了PGPR芽孢杆菌某些种菌株是高度多样的。与种系发生分析一致，在菌株AP71、AP79、AP193、AB01、GB03和FZB42之中发现高相似性，蛋白质组相似性范围从70-90％。
核心基因组分析利用渐进式Mauve(progressive Mauve)分析基因组序列比对确定了13个PGPR芽孢杆菌某些种菌株的核心基因组含有1,407,980bp的基因组DNA，其编码1,454个ORF(数据未显示)。芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌子群、解淀粉芽孢杆菌物种和植物亚种的核心基因组序列比较证明了随着基因组数量增加，每个相应的核心基因组内不同子***的数量减少(图2A-C)。除芽孢杆菌属核心基因组之外，各核心基因组类别中最高数量的子***，致力于碳水化合物代谢。这些发现提示芽孢杆菌属的菌株利用多样的碳源。另外，芽孢杆菌属的核心基因组具有与碳水化合物代谢相比更多的致力于RNA、DNA和蛋白质代谢的子***(图2A-C)。
来自包括在本实施例中测序的六个植物亚种菌株在内的28个不同植物亚种菌株的基因组比对鉴定了2,550,854bp的核心基因组序列，预测是编码2,839个ORF。包括28个植物亚种菌株在内的32个解淀粉芽孢杆菌菌株的基因组比对鉴定了2,418,042bp的核心基因组序列，预测编码2,773个ORF。
包括在本实施例中测序的12个菌株在内的53个枯草芽孢杆菌群菌株的基因组比对鉴定了578,872bp的核心基因组序列，预测编码674个ORF。在所述芽孢杆菌某些种的基因组内存在的蛋白编码基因的数量(～4,000)和由它们的核心基因组编码的ORF的低数量(674)提示，在经历经常性的基因获得和丢失的芽孢杆菌基因组之中大量的基因组可塑性。观察到所述解淀粉芽孢杆菌核心基因组缺乏可动遗传因子，例如原噬菌体、转座因子和质粒(数据未显示)。此外，所述枯草芽孢杆菌核心基因组也缺乏与铁获得和代谢、次级代谢产物生物合成、信号转导和磷代谢相关的基因或遗传基因簇(图2A-C)。
在本实施例中，还通过分析来自GenBank中现有的芽孢杆菌属的所有全基因组序列，来确定所述芽孢杆菌属核心基因组。我们确定了芽孢杆菌属含有194,686bp的核心序列，预测编码201个不同的ORF。存在于所有芽孢杆菌菌株中的预测功能限于以下子***特征：辅因子合成，维生素合成，辅基和色素生物发生，细胞壁和被膜生物发生，膜转运，RNA代谢，核苷代谢，蛋白质代谢，调节和细胞信号传导，DNA代谢，呼吸，氨基酸和衍生物，硫代谢，和碳水化合物利用。
解淀粉芽孢杆菌植物亚种中独有存在的核心基因的比较分析PGPR特异性基因组与非PGPR枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168特异性基因组的比较没有鉴定出在所述PGPR菌株的基因组内保守的必需管家基因以外的任何基因(数据未显示)。来自28个解淀粉芽孢杆菌植物亚种和32个解淀粉芽孢杆菌物种的核心基因组的比较分析鉴定了在所述植物亚种核心基因组内存在但在解淀粉芽孢杆菌核心基因组中不存在的193,952bp序列。在这些遗传基因座之中，有73个基因是所有28个植物亚种菌株共有的但在任何解淀粉亚种菌株中不存在。这些基因的推定功能包括转运(7个基因)、调节(7个基因)、信号传导(1个基因)、碳降解(10个基因)、次级代谢产物合成(19个基因)、和假定蛋白质(12个基因)(图2C)。这些基因产物中的一些可以参与与植物的相互作用和植物亚种菌株的根围感受态(例如果胶利用)。例如，摄取和利用D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸所需要的基因在解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株之中是共有的。这些包括uxuA(甘露糖酸脱水酶(EC 4.2.1.8))，kdgA(4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16))，kdgK(2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶(EC 2.7.1.45))，exuT(己糖醛酸转运蛋白)，exuR(己糖醛酸利用操纵子转录阻遏蛋白)，和uxuB(D-甘露糖酸氧化还原酶(EC 1.1.1.57))。另外，在PGPR植物亚种菌株中一致地发现所述聚酮杀艰菌素和大环内酰亚胺的生物合成需要的基因，提示它们在这些菌株的生物控制活性中的相关性。
菌株AP193中编码次级代谢产物生物合成和天然感受态的基因簇由于我们观察的PGPR菌株AP193与植物和动物这两种宿主之间的有益相互作用(Ran等，2012)，我们选择这种菌株用于更集中的基因组分析。从头装配菌株AP193基因组序列产生152个大于1kb的重叠群，合并长度为4,121,826bp。利用antiSMASH次级代谢产物预测程序分析AP193重叠群序列，提示存在负责合成三种不同的聚酮：bacillaene、大环内酰亚胺和杀艰菌素的基因簇。为了提供用于这些生物合成途径的全序列，利用PCR填补重叠群5和6、重叠群33和38、以及重叠群27和28之间的空位，然后DNA测序。AP193中的各基因簇与解淀粉芽孢杆菌FZB42中它们的配对物共线；解淀粉芽孢杆菌FZB42是有促进植物生长和抑制植物病原体能力的天然感受态植物根部定殖的解淀粉芽孢杆菌分离物(Chen等，2007a)。由那些基因簇编码的蛋白质当与FZB42的那些蛋白质相比较时，氨基酸同一性百分比在98-100％范围内。在所述AP193基因组中还检测出参与环状脂肽类表面活性素、丰原素和杆菌抗霉素D以及FZB42中存在的抗微生物二肽的非核糖体合成的次级代谢产物生物合成基因簇。在那些基因簇上编码的AP193蛋白质与所述FZB42同系物的氨基酸同一性百分比范围从98％到100％。所述PGPR菌株AP193的天然感受态的缺乏促使我们确定在这个菌株内感受态相关基因的存在。我们调查了AP193基因组序列中是否存在在FZB42的基因组内发现的感受态相关基因，并观察到编码菌株FZB42中发现的感受态***的结构组件所需要的所有基因在AP193的基因组内以98到100％同一性存在(数据未显示)；然而，在解淀粉芽孢杆菌FZB42参与调节群体感应的基因comQ、comX和comP(Chen等，2007a)在菌株AP193的基因组内不存在(数据未显示)。不存在comQ、comX和comP可能造成了菌株AP193天然感受态的缺乏。
AP193次级代谢产物体外抑制多种细菌植物病原体的生长测试菌株AP193和它的突变体AP193ΔdfnD(杀艰菌素产生缺陷)、AP193ΔsrfAA(表面活性素产生缺陷)、和AP193Δsfp(由于编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfp基因缺失而不能产生聚酮或脂肽)针对植物病原体丁香假单胞菌烟草致病变种、放射型根瘤菌、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种的抗微生物活性。所述AP193野生型菌株表现了强抗微生物活性，而所述AP193Δsfp突变体缺乏针对那些植物病原体的抑制效应(图3)，突出了脂肽和/或聚酮在AP193的生物活性中的贡献。这也表明其合成与Sfp无关的二肽杆菌溶素未参与体外表达的拮抗活性。所述AP193ΔsrfAA突变体赋予了与野生型相似的对植物病原体丁香假单胞菌烟草致病变种(P.syringe pv.tabaci)、放射型根瘤菌(R.radiobacter)、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种(X.axonopodis pv.vesicatoria)和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种(X.axonopodis pv.campestris)的抗微生物活性(图3)，提示在本实施例中测试的条件下，表面活性素在AP193针对那些植物病原体的抗菌活性中没有推定的作用。这些发现还证明了表面活性素既不影响AP193中所述抗微生物化合物的生物合成，它也不抑制由AP193产生的抗菌化合物的抗菌活性。据所述AP193ΔdfnD突变体缺乏针对植物病原体丁香假单胞菌烟草致病变种、放射型根瘤菌、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种的抑制效应所表明的，杀艰菌素在AP193针对那些植物病原体的对抗性中充当主要抗生素(图3)。
通过进行来自野生型AP193和这些突变体中每一个的无细胞TSB培养物上清液的LC-MS分析，我们进一步证实了AP193ΔdfnD和Δsfp突变体缺乏杀艰菌素的合成。如以前报告的，只有去质子的羟基杀艰菌素形式可利用MS的负离子模式在细菌上清液中检出([M-H]-＝559.3)(Chen等，2006)，其中分子质量559.3在野生型AP193培养物的上清液中检出但在来自ΔdfnD突变体(图4)或来自Δsfp突变体(数据未显示)的培养物中未观察到。所述ΔsrfAA突变体像野生型AP193培养物一样表现出杀艰菌素合成(数据未显示)。这些发现证明了杀艰菌素在植物亚种菌株针对植物病原体的生物控制活性中的重要性。
菌株AP193次级代谢产物控制番茄植物中由地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种引起 的细菌性斑点病为了确定由菌株AP193产生的生物活性化合物在提供对植物病害的防护中的作用，在番茄植物随后接种植物病原体地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种的几天之前，将所述AP193野生型菌株和它的AP193ΔdfnD、AP193Δsfp和AP193ΔsrfAA突变体应用于那些植物。与病害对照相比，AP193野生型和AP193ΔsrfAA二者显著(P<0.05)减轻番茄植物上细菌性斑点病的病害严重度(表3)。另外，应用菌株AP193显著增加所述植物的根部干重(表3)。与AP193野生型和它的AP193ΔsrfAA突变体不同，菌株AP193Δsfp和AP193ΔdfnD既不保护番茄植物免于地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种引起的严重细菌性斑点病，也不改善植物生长(表3)，进一步支持了杀艰菌素对于植物病害防护的重要性。这些发现与AP193野生型菌株和它的AP193ΔdfnD、AP193Δsfp和AP193ΔsrfAA突变体针对植物病原体地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种表现的体外抗生作用模式一致。
讨论
PGPR芽孢杆菌某些种菌株在世界上用于改善作物产量和防护植物病害。在本实施例中，12个PGPR基因组被测序，包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌。这些数据利用ANI、基于gyrB的种系发生和基于核心基因组的种系发生分析，以解析芽孢杆菌某些种菌株的分类关系。我们的发现证明，在本实施例中测序的菌株中一半与解淀粉芽孢杆菌植物亚种有关系，包括以前称为枯草芽孢杆菌的菌株GB03。以前，暹罗芽孢杆菌型菌株KCTC 13613T作为新物种被提出(Sumpavapol等，2010)，但基于芽孢杆菌核心基因组的种系基因组分析(图1)揭示暹罗芽孢杆菌KCTC 13613T反而与解淀粉芽孢杆菌植物亚种有关系。该发现支持了Jeong等(Jeong等，2012)基于ANI确定暹罗芽孢杆菌型菌株KCTC13613T与解淀粉芽孢杆菌植物亚种密切关联的结果。这些发现还支持了继续利用基于核心基因组的种系基因组途径来提供比利用单个管家基因(例如gyrB)更好的种系发生分辨力。基于gyrB和核心基因组序列的种系发生证明解淀粉芽孢杆菌植物亚种是高度相似的，但它们蛋白质组的比较证明它们密切相关，然而截然不同，并可通过不同的机制发挥促植物生长活性。
解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株AB01是从沟鲶的肠中分离的(Ran等，2012)，但它与植物伴生菌株的关系可以提示在鱼胃肠道内是暂时性存在的；然而，假如鱼饲料是基于大豆的，有可能所述植物基食料也是该菌株在鱼肠内生长的因素。类似地，发现暹罗芽孢杆菌型菌株KCTC 13613T与解淀粉芽孢杆菌植物亚种密切相关并且从腌蟹而不是植物相关来源分离的。像鱼中的益生菌一样，菌株AB01、AP193和其他植物伴生菌株的功效显示了动植物病原体的生物控制以及在宿主定殖中的重叠(Ran等，2012)。
随着测序技术的迅速进步，现在有可能将基因组分析扩展到超出个体基因组来分析核心基因组(Medini等，2008)。在本实施例中，在来自与枯草芽孢杆菌群有关系的PGPR菌株上进行核心基因组分析。该分析鉴定了仅在所有植物亚种之中存在而在解淀粉亚种菌株中不存在的73个基因。植物亚种特异性基因的这种小数量与以前利用来自植物亚种菌株的有限数量的基因组序列鉴定130个植物亚种特异性基因的报告(He等，2012)一致。在本实施例中鉴定的这73个植物亚种特异性基因之中，预计许多对于植物相关和土壤相关的功能是重要的。例如，在解淀粉芽孢杆菌植物亚种特异性核心基因库中发现了利用D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸所需要的基因。该观察结果与没有任何报告的PGPR活性的菌株——解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种DSM7(Ruckert等，2011)的基因组中不存在这些基因一致。果胶，在植物组织中发现的复杂聚合物，被分解为D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸，它们然后充当细菌生长的碳源(Nemoz等，1976)。该果胶可以潜在充当PGPR通过竞争性营养吸收进行有效根部定殖的营养源。因此，存在能够利用D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸的基因对于解淀粉芽孢杆菌植物亚种通过有效根部定殖的促植物生长活性可以是有利的。
因为许多PGPR菌株来自枯草芽孢杆菌群，所以将核心基因组评定扩大到包括更大数量的枯草芽孢杆菌菌株。将被分析的枯草芽孢杆菌基因组数量增加到53，产生579,166bp的核心基因组，预测编码674个ORF。这种较少的预测基因数量反映了在枯草芽孢杆菌群之中的基因组多样性。该发现证明了在枯草芽孢杆菌群核心基因组中发现的ORF数量接近被认为对于在复杂培养基中生长不可缺少的枯草芽孢杆菌ORF的数量(610个ORF)(http：//www.minibacillus.org/project#genes)。
为了验证在植物相关过程中基因的参与，构建缺乏那些基因的等基因突变体是必要的。因此，我们从PGPR菌株AP193删除基因以评价次级代谢产物生物合成基因簇在植物病原体生物控制中的作用。为此，带有基因缺失构建物的甲基化穿梭载体pNZT1(Zakataeva等，2010)向AP193传递靶遗传修饰，证明了通过无细胞提取物的质粒体外甲基化在绕过据推测防止通过电穿孔进行转化的限制***中的功效。
杀艰菌素是高度不饱和的22元大环多烯内酯磷酸酯，有广谱抗菌活性(Zimmerman等，1987)。由菌株FZB42表达的杀艰菌素与所述二肽杆菌溶素一起对抗解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)–果树中白叶枯病的致病媒介(Chen等，2009)。本实施例利用等基因突变体AP193ΔdfnD，首次证明了杀艰菌素单独，不连同任何其他聚酮或二肽，发挥针对植物病原体例如丁香假单胞菌烟草致病变种、放射型根瘤菌、地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种和地毯草黄单胞菌野油菜致病变种的体外抗菌活性。通过利用等基因突变体AP193ΔdfnD，我们还证明了杀艰菌素表达担负着番茄植物中由地毯草黄单胞菌叶斑病致病变种引起的细菌性斑点病的控制。合起来，这些发现证明了杀艰菌素是对于由于细菌性病原体引起的植物病害的生物控制最重要的菌株AP193次级代谢产物。另外，所述sfp基因缺失的构建允许调查由AP193产生的多种次级代谢产物以及它们各自对生物控制活性的贡献。所述sfp缺失突变体失去了针对易受AP193野生型菌株感染的各病原体的对抗活性。Sfp缺失的突变体预计丧失了合成杀艰菌素以及其他代谢物的能力。因为AP193Δsfp的抗微生物活性缺乏与AP193ΔdfnD突变体一致，因此这提示杀艰菌素是担负体外抑制细菌性病原体的主要代谢产物。相反，所述表面活性素突变体保留了针对所测试的所有植物病原体的抗微生物活性，证明了在这个芽孢杆菌某些种菌株中表面活性素既不是体外抗菌活性关键的也不影响其他次级代谢产物生物合成的合成或分泌；然而，表面活性素可以影响促植物生长活性，因为已经观察到枯草芽孢杆菌的表面活性素在植物中引起ISR(Ongena等，2007)并且在被FZB42定殖的植物细胞中表达(Fan等，2011)。
通过研究在表现最佳的PGPR菌株之中保守的遗传基因座的贡献，我们继续揭示基因在植物定殖、促生长和/或病原体生物控制中的相对贡献。特别是，将来调查与果胶衍生糖的摄取和利用相关的基因将帮助确定这些基因对于植物的定殖和在该微生物群系(microbiome)内的持久性的相对重要性。芽孢杆菌某些种PGPR菌株的比较基因组分析带来对基因产物的更好了解和提供开发产生更高的促植物生长和生物控制活性的应用策略的基础。
表
表1.本实施例中使用的菌株和质粒
表2.本实施例中使用的测序的芽孢杆菌的基因组草图概要
表3.植物促生根际细菌(PGPR)菌株对细菌性斑点病的严重度和植物生长的效应
参考文献
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实施例2–提交给亚拉巴马州农业试验站(Alabama AgriculturalExperiment Station)的“果胶刺激由植物促生根际细菌的植物生长&疾病控制”的拨款提案
摘要
已经鉴定了控制植物病害和促进全面植物生长的植物促生根际细菌(PGPR)。“根际细菌”是指根部定殖细菌，因此，根部定殖对通过PGPR菌株促进植物生长是必要的。植物根部渗出各种有机化合物，包括糖，而成功的细菌定殖取决于通过细胞外酶活性从宿主植物吸收营养。解淀粉芽孢杆菌植物亚种的菌株(Bap)定殖植物根部，并已在过去的十年中用作生物肥料或生物防治剂。在奥本(Auburn)一些表现最好的PGPR Bap菌株已经受到比较基因组分析，表明在这些测序的菌株之中利用果胶是保守特性。作为植物细胞壁的结构组分，关于果胶生物化学和植物合成的了解很多；然而，关于果胶在根部定殖中可能的作用则鲜少了解。事实上，当前的科学范式将果胶利用视为由植物病原体表达的功能，而不视为由植物伴生PGPR菌株表达的潜在有用的特性。我们现在有试验证据，即我们表现最好的PGPRBap菌株可经由下述过程得到碳和能量：1)产生将植物果胶降解成己糖醛酸糖的细胞外果胶分解酶，2)转运果胶衍生糖，和3)利用这些果胶衍生糖供细菌呼吸。虽然这些PGPR Bap菌株在实验室或温室条件下一直表现好，但田间试验在PGPR功效上更易变。我们假设在种子上或在植物根围内补充果胶水平将改善PGPR菌株在刺激植物生长和疾病控制中的功效。我们检验这种假设的具体目标是：i)筛选大量进行果胶降解和并用作唯一C源的Bap菌株保藏品，ii)进行比较基因组分析，包括缺乏果胶利用能力的Bap菌株在内(参见上文的实施例1)，和iii)评价果胶补充随同Bap菌株(有和没有果胶利用能力)的促大豆生长和疾病控制。由本研究获得的信息将首次提供对PGPR菌株受果胶可得性影响时的促生长能力的了解。这些试验的结果将提供所需要的初步数据以便向联邦机构、特别是USDA和NSF提交有竞争力的校外资金提案，在所述提案中我们可以将这些结果推广到有多种作物物种的田间环境。这种信息的实际应用可实现用于农业病原体生物控制和促进植物生长的可持续解决办法。
引言
对农业中抗生素使用的环境可持续和有效替代品的需求在日益增长。美国食品和药品管理局已在寻求减少家畜、家禽和农作物中抗生素使用的政策(1)，并且这些政策预计在美国和其他国家变得更加严格。这已经促使探索可持续的方法，如本提案中描述的益生策略，不依靠抗生素进行控制农业病原体和提高动植物生长。植物促生根际细菌(PGPR)已经证明有希望作为用于病害生物控制和生物肥料目的的益生菌剂(2-5)。虽然许多细菌物种归类为PGPR菌株，但芽孢杆菌物种由于它们的孢子形成活性在商业生物防治制剂中赋予了更长的储存期限和更高的存活力，所以被仔细研究。在这个属内，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bap)近来已经显现为缺乏任何致病潜力的特别有效的PGPR物种(6，7)。在奥本大学，Kloepper教授已经收集了大量(>300)显示生物控制和/或促植物生长活性的PGPR分离物，其中59种已经鉴定为Bap菌株。与Liles教授合作工作，已经鉴定了特定的PGPR Bap菌株(感谢在前AAES和NSF的支持)，其在沟鲶中有控制病害的能力(8)并正在今年夏天的鲶鱼生产鱼塘对照试验中使用。因此，感兴趣的是在农业相关的农作物和动物中使用PGPR菌株作为抗生素的替代品，从而增加它们在这些农业和水产养殖应用中的效用。
PGPR菌株被认为是生物刺激剂，因为它们是与它们的植物宿主具有有益的益生相互作用的微生物接种剂(9)。例如，微生物接种剂可溶解磷和/或固定氮，然后可被植物根部吸收，直接刺激植物生长。关于利用细菌接种剂固氮有大量文献(10)，许多芽孢杆菌某些种菌株已被鉴定为有作为生物肥料的商业潜力的溶磷细菌(11)。另外，已经发现PGPR菌株产生许多针对细菌和/或真菌病原体具有抗菌活性的次级代谢产物(12-14)，并且也可以通过产生诱导植物***性获得抗病性(SAR；由水杨酸介导)和诱导型***性抗病性(ISR；茉莉酮酸依赖性的)机制的化合物，诱导控制植物病害(15-17)。事实上，Kloepper实验室的所述测序的PGPR Bap菌株保藏品包括已经发现诱导促进植物生长和疾病控制二者的菌株。
最早报告的为了农业目的进行种子细菌化的研究时间在1895年对豆科植物使用根瘤菌(Rhizobium)接种剂(18)。在整个六十年代和70年代早期期间，在苏维埃和印度的多种研究中观察到施加细菌接种剂后粮食作物的增产(18)。然而，田间研究的产量一直低于温室研究，提示引入的微生物群体在土壤接种后迅速减少(18)。这种减少可能是由于所述PGPR菌株不能与正常的根围微生物群竞争。尽管利用细菌接种剂的固有困难，但估计北美的生物刺激剂市场以每年12.4％的速率，由2013年的$270百万增长到2018年的$490百万(19)。因此对于能提高PGPR菌株改善农业生产性的功效和减少由细菌、真菌、线虫和病毒引起的病害的策略有强烈的兴趣。
我们的实验室已经对表现最好的PGPR Bap菌株进行了比较基因组研究，并且我们能够鉴定在所有28个被调查的基因组(包括由其他团队发表的一些菌株)内一直存在、但在已知不具有PGPR活性的其他解淀粉芽孢杆菌菌株中不存在的73个基因(图2C)。重要的是，我们发现与果胶衍生糖的摄取(exuT)和利用(uxuB)相关的基因(18)在这些PGPRBap菌株内始终观察得到。这引出了我们的关键假设，即果胶补充可增加解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株的根部定殖能力和代谢活性，从而引起这些PGPR菌株在植物生长和病害生物控制方面的功效改善。
对于可得益于这个项目的果胶生物化学和植物生物合成有大量的知识基础。Henri Braconnot在1825年发现果胶，并且果胶已经被充分表征为植物初生细胞壁中除了纤维素和半纤维素之外主要的杂多糖(20)。例如，悬铃木的初生细胞壁由34％果胶、24％半纤维素、23％纤维素和19％富羟脯氨酸的糖蛋白构成(21)。果胶在植物的果实、叶和根内水平最高，因此这与果胶给PGPR菌株提供所需要的根源性营养源的潜力相符。果胶也见于细胞之间的中层，在此它帮助将细胞结合在一起，并且果胶的可得性和结构在植物物种之中变化(22)。果胶物质见于根毛中并且在壤质土中具有比砂质土中更厚的层，果胶在根部的持续时间可取决于土壤根围中的细菌酶活性(23)。
果胶降解通过在细菌、真菌和高等植物中发现的被称为果胶裂解酶的果胶分解酶发生(24)。已知细菌分泌果胶裂解酶来降解植物果胶。这种途径首先在大肠杆菌中报告(25)，后来在枯草杆菌中描述(26)，但除了我们的比较基因组研究(原稿在审查中)以及Bap基因组注释的两个报告以外(27，28)，没有Bap菌株果胶利用或在它们作为PGPR的功效中果胶的重要性的试验证据。在下列细菌属中显示了果胶分解活性：无色杆菌属(Achromobacter)，节杆菌属(Arthrobacter)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，芽孢杆菌属，梭菌属(Clostridium)，欧文氏菌属(Erwinia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，和黄单胞菌属(Xanthomonas)(29，30)。这些细菌中有许多被认作植物病原体，并且果胶的降解是由欧文氏菌某些种引起的软腐病的特征；因此，竞争植物根围内作为营养源的果胶可以是PGPRBap菌株对抗植物病原体而自身不引起植物损害的机制之一。我们具有我们的测序Bap菌株编码并表达果胶裂解酶活性的试验证据(图5)。需要另外的试验来确定在所有我们可得到的PGPRBap菌株之中果胶裂解酶表达是否是共同的性状(参见方式一节)。
通过产生和分泌果胶裂解酶，细菌可降解果胶和摄取果胶衍生糖D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸和D-甘露糖(31)。所述糖葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸可由细菌经由编码己糖醛酸通透酶的己糖醛酸转运蛋白(exuT)***吸收。根据我们的比较基因组研究，我们发现所述exuT基因在所有测序的PGPR Bap菌株(n＝28有基因组序列草图)之中是保守的。我们随后设计了寻靶Bap菌株中的exuT基因的PCR引物组并利用该引物组筛选奥本保藏品中的59个已知的PGPR Bap菌株(基于利用16S rRNA和gyrB基因序列二者的种系发生分析)；在这59个Bap菌株中，发现57个菌株对exuT是PCR阳性的。在高百分比的这些菌株之中存在这种转运蛋白支持了果胶摄取是Bap菌株的关键功能的假设。有可能所述两个菌株的负PCR结果是假阴性(虽然这重复了3次)或代表了不被所述引物组识别的exuT基因。为此，重要的是评价果胶作为唯一C源的实际利用(参见方式章节的目的1)。
在果胶衍生糖摄取之外，利用果胶的细菌具有利用己糖醛酸糖作为C和能量源的降解途径也是至关重要的。所述uxuB基因编码D-果糖酮酸氧化还原酶，其是大肠杆菌和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)细菌中负责降解细胞内葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸成为2-酮3-脱氧葡糖酸(KDG)的酶之一(32)，KDG后来代谢成丙酮酸和3-磷酸甘油醛。如同exuT一样，我们将uxuB鉴定为在所述28个测序的PGPR Bap菌株之中普遍保守的基因。同样，我们近来筛选了59个奥本PGPR Bap菌株的更大保藏品中uxuB基因的存在，并发现54个菌株被发现是uxuB阳性的。我们不知道发现对于uxuB是PCR阴性的5个菌株是否缺乏利用果胶作为唯一C源的能力(参见方式章节中的目的1)。鉴别缺乏摄取或利用果胶作为唯一C源的能力的特异性PGPR菌株将是有帮助的，因为我们能因此利用这些菌株作为推测不会对另外的外源果胶的可得性作出反应的阴性对照。
葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和甘露糖可被细菌例如菊欧文氏菌用作主要的碳和能量源(31，33)。因为碳的获取对细菌能量产生和生物合成是必不可少的(34)，我们假设增加果胶的可得性可以促进植物根围内PGPR Bap菌株的存活性、持久性和代谢活性，导致植物生长和病害控制的改善。也许更好的PGPR功效与具体植物物种的根部或种子内可得到的果胶量有关？在这个提议中，我们集中在外源供给的果胶是否可诱导更好的PGPR功效的问题上，而在随后的校外提案中我们可以探究植物物种之中果胶含量的差异(例如，缺乏果胶合成的拟南芥(Arabidopsis thaliana)遗传突变体中与野生型植物果胶水平相比较)及其在促进植物生长和病害控制中与PGPR功效是否相关。在有关利用外源供给的原始果胶刺激植物伴生细菌生长上，文献中只有一个报告，在固氮性固氮螺菌属(Azospirillum)的情况下，其在补充果胶的土壤中丰度增加(35)。然而，在该研究中，没有试图评价在促生长或病害控制方面对植物的任何利益。因此，果胶随同PGPR菌株对种子或植物根部的调理可能是促进植物生长和减少病害的创新方式，并降低PGPR菌株田间试验中固有的变异性。
合理性和意义
对于农业中寻找不求助于使用抗生素来改善动植物健康的可持续手段，有日益增长的动力。最近联邦减少抗生素使用和寻找改善动植物健康的替代方法的倡议与本研究提案高度协同。在提交联邦资助提案之前，我们需要检验果胶补充可增加PGPR菌株诱导植物生长和病害控制的功效的假设。该AAES提案因此对于本研究能够进展到它对于校外支持有竞争力的阶段是关键的。果胶在细菌-植物相互作用中的作用知识可有益于PGPR菌株实际应用的方式有多种：1)在种子上补充果胶可提高PGPR根围定殖，这可在植物生长和减少病害中引出更显著的效益，2)通过用定期根围浇灌果胶，可提高PGPR菌株在植物根围内的持久性，3)通过多种机制(直接对抗、SAR和ISR)发生PGPR菌株介导的病害控制，所述病害控制可通过调整PGPR和果胶接种时机以最佳减少植物病原体的病害压力来提高。
方式
我们的试验方式将首先集中在将我们的果胶使用知识扩大到Kloepper教授的奥本保藏品中的全部59个PGPR Bap菌株。我们基于PCR的初步筛选支持了果胶是大多数PGPRBap菌株重要的C和能量源的假设，并且目的1中的试验将提供这些菌株的果胶利用的直接证据。重要的是，目的1也预期指示一些不具有果胶利用能力的Bap菌株。我们预测这些果胶非感受态的菌株将在根部定殖中处于竞争不利，并且这些菌株于是对于在目的3中作为用来与果胶利用菌株比较的阴性对照被包括而言是重要的。为了了解果胶非感受态的遗传学基础，目的2中我们将挑选果胶裂解酶活性和/或果胶作为唯一C源的利用为阴性的代表性Bap菌株(目的1的输出结果)进行基因组测序和与其他Bap菌株基因组比较。这将根据缺乏果胶使用能力的少数Bap菌株中发生的特异性遗传变化提供有用的信息，并表明这些菌株中利用哪种其他植物衍生的碳水化合物。最重要的是，目的3将检验首要的假设，即在种子上或植物根围中补充果胶水平将改善PGPR Bap菌株在刺激植物生长和病害控制中的功效。我们将使用多个Bap菌株，包括至少一个缺乏果胶利用能力的菌株，并且在种子调理或根围浇灌种将应用一定范围的果胶浓度。
目的1：筛选大量Bap菌株保藏品的果胶裂解酶活性和果胶作为唯一C源的利用。
假设：大多数Bap菌株将表达果胶裂解酶活性并能够利用果胶作为唯一碳源。
方法：
目的1.1：检验Bap菌株的果胶裂解酶活性：果胶酸盐-琼脂培养基将用于确定Bap菌株的果胶裂解酶活性。所述细菌将从-80℃的低温储液在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上28℃生长过夜，分离的菌落将用于接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)2ml培养物，其将伴随250rpm振荡在28℃温育过夜。1ml等份的所述过夜培养物然后将移液到1.5ml微量离心管中，并通过将所述培养物进行10,000x g离心5min然后将细菌沉淀团重悬浮在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并重复所述过程，将所述细菌细胞洗涤三次。为了提供一致的接种体，所述细菌重悬液将用于接种2ml培养管中的1xPBS并用分光光度计测量所述细菌悬液的浊度，直到600nm处的光密度大约0.5为止。这种标准化的细菌悬液将用于在用来确定果胶裂解酶活性的果胶酸盐-琼脂培养基(36)上一式三份地接种20微升悬液。所述果胶酸盐-琼脂培养基板将在28℃温育过夜，然后在所述板的表面倾倒1％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，30min后形成在细菌菌落周围存在的透明带(图5)指示果胶裂解酶活性。所述透明带的幅度将以mm测量并记录在Excel电子数据表中，确定各Bap培养物的平均透明带。
目的1.2：检验Bap菌株使用果胶作为唯一的C源：59个Bap菌株各自利用果胶作为唯一C源的能力将利用基本Tris-Spizizen盐(TSS)培养基(37)作为补充有1％植物果胶(柑橘源)的基础培养基来评定。各细菌培养物将如同果胶裂解酶试验那样制备，细菌悬液在1xPBS中洗涤，归一化到OD600＝0.5，然后100微升1:100稀释液将用于接种1.9ml TSS+1％果胶培养物，一式三份。肉汤培养物将伴随振荡在28℃温育并且将取36小时时段内的OD600读数。在初步试验中，我们观察到两个我们以前测序的PGPR Bap菌株，AP143和AP193，可利用果胶作为生长用C源(图6)。作为阴性对照，非PGPR苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki)菌株HD73从USDAARS培养物保藏中心(Ames，Iowa)得到，其基于它的基因组序列被鉴定为非果胶利用菌株。该菌株没有观察到利用果胶作为唯一C源生长(图6)。
可能的结果：已经证实含有exuT和uxuB基因的Bap菌株将表达果胶裂解酶活性并利用果胶作为唯一的C源生长。一些菌株将在果胶裂解酶试验中显示更大的透明带，并且任何高表达菌株将用于后续的试验。
可能有不利用果胶作为唯一C源生长的菌株，并且这些菌株之一可被用于目的2供比较基因组和目的3作为阴性对照。
可能的问题：有可能尽管具有必需的基因，但菌株可能不在体外条件下表型上表达果胶裂解酶活性或果胶利用。基于初步结果，我们不预期这是个问题，并且知道我们有至少两个菌株，AP143和AP193，以前被鉴定为表现最佳的PGPR菌株，进行过基因组测序并已经显示出降解和利用果胶作为C源。
目的2：进行比较基因组分析，包括缺乏果胶利用能力的Bap菌株在内
目的2：不能利用果胶的Bap菌株将在负责果胶降解和/或利用的途径中具有基因组重排。
方法：
目的2.1：确定缺乏果胶利用的菌株的基因组序列：基于目的1的结果，我们将选择不具有任何果胶降解和/或果胶利用证据的Bap菌株用于基因组测序。基于exuT和uxuB基因的基于PCR的筛查结果(参见上文)，我们预期一些菌株对于利用果胶作为唯一C源是阴性的。各菌株将在28℃以适中规模(～100ml TSB)生长直到培养物达到OD600为0.5-0.8。基因组DNA分离将利用硬珠击打法(MoBio，Carlsbad，California)进行以达到从***收获足够的gDNA。所述gDNA将利用Qubit荧光计定量。如果我们获得每个菌株>50ng的高质量gDNA，那么我们将利用Nextera tagmentation试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备带条形码的子文库(否则，将采用Nextera XT试剂盒，其可使用少到1ng gDNA)。我们将在每次Illumina MiSeq测序运行(在Rouse Life Sciences大厦中可提供)中包括不多于5个菌株，并使用12pM终浓度的所述联合的条形码文库以及PhiX内部对照的1％加标。序列数据将以.fastq格式从MiSeq输出并输入CLC基因组工作台(CLCbio，Cambridge，MA)。我们将为了质量修整序列(修整设置0.01)，然后从头装配。如果大重叠群没有由所述装配产生，我们然后将利用CLC基因组、Ray和VelvetOptimiser装配器评价不同的装配标准，以便鉴定每个菌株可能的最大重叠群。基于我们以前在细菌基因组的新一代测序和装配中的经验，我们预期当达到>80x覆盖度时结果优异。
目的2.2：分析基因组的果胶和碳水化合物利用途径：所述细菌基因组序列将通过将各菌株的整个重叠群组输出到RAST服务器(http：//rast.nmpdr.org/)中来注释。RAST输出将指示所预测的碳水化合物利用途径的存在。另外，我们将利用NCBI的成对tBLASTx比较，将各菌株完整的基因组重叠群组与从Bap菌株AP193得到的果胶裂解酶(pelB)、己糖醛酸转运(exuT)和己糖醛酸利用(uxuB)所需要的基因进行手工比较。如果基因组中存在特异基因的话，这些分析将指示所述特异基因的存在，即便以前基于PCR的筛查因为引物退火位点处基因序列的差异而无效。此外，我们将比较各非果胶利用菌株与AP193和其他测序的Bap基因组的基因组构造以查询各果胶利用途径周围的局部区域。这可以指示果胶利用中缺陷的性质是否与转录调节(启动子区域中的改变)、特异性遗传基因座中的点突变、或果胶利用途径的完全遗传缺失或重排有关。
可能的结果：缺乏降解和/或利用果胶的能力的Bap菌株的基因组草图，和参与各途径的基因和基因组区域的注释。
可能的问题：我们在进行MiSeq测序运行中有相当的经验(>20，在奥本)，但关于每个菌株得到的测序收率可以有变异性。为了减轻它，我们将旨在在菌株上获得至少100x基因组覆盖度，并且还预算两次测序运行，以防第一个测序运行有任何问题。
目的3：评价果胶补充连同Bap菌株一起的大豆促生长和病害控制
假设：对大豆秧苗补充果胶水平将改善PGPR Bap菌株刺激植物生长和病害控制的功效。
方法：
目的3.1：确定果胶剂量依赖性地提高PGPR菌株生长：
首先确定在后续的植物生长试验中使用的果胶浓度是重要的。为了追踪菌株定殖，我们将在TSA上选择利福平抗性突变体(50μg/ml Rif)并且每菌株选择三个独立的RifR突变体用作复制。大豆种子(Park Seed，Hodges，SC)将播种在泡沫聚苯乙烯盘中并在秧苗栽种后三周将移植到4.5英寸商业盆栽基材的方形盆(Sunshine mix，Sun GroHorticulture，Agawam，Maine)中。移栽后三天，将用施加在1)无菌水、2)0.01％(w/v)果胶、3)0.1％果胶或4)1％果胶中的10ml AP193或HD73孢子(106CFU/秧苗)浇灌秧苗，8个处理组(2菌株x4果胶量)各一式四份，总共32盆。植物将转移到温室并每天浇水达21天。指示浓度的果胶补充将一周一次进行。接种后21天时，从各盆取样10g根围土壤，并将测定枝条和根部的干重。所述土壤将在90ml无菌水中匀化(10-1稀释液)，然后连续稀释到10-6稀释液，并且从10-1至10-6的各稀释液将在TSA板上铺板以便测定RifR菌落形成单位(CFU)数量/g土壤。本试验的结果预期显示在菌株AP193CFU/g土壤中显著的果胶剂量依赖性增加，果胶非感受态菌株HD73没有观察到显著增加。显示最强诱导的最低果胶剂量将用于目的3.2。
可能的结果：确定当在盆栽基材中调理时引起增加PGPR Bap菌株生长的果胶浓度。
可能的问题：本试验理想地将利用农业土壤进行；然而，在土壤中土著根围微生物群和接种的PGPR菌株之间进行辨别是异常困难的。我们选择盆栽混合物，因为这是普遍用于温室生长农作物的，因此它与用于商业生长物的条件相关，同时还允许更容易识别具有独特的菌落形态的PGPR菌株。为了证实所述CFU计数应归于接种的PGPR Bap菌株AP193，将选择代表性的菌落，利用已经在Liles实验室开发的AP193菌株特异性PCR引物组进行PCR(数据未显示)。
目的3.2：评价PGPR介导促植物生长的果胶诱导：
大豆秧苗将播种在含有砂壤土盆栽土壤的较大的8英寸盆中，向每kg土壤添加497mg肌醇六磷酸。以前已经显示，Bap菌株FZB42可部分经由肌醇六磷酸酶活性介导它的促植物生长效应，并且向土壤添加肌醇六磷酸可有助于观察这种PGPR介导的促植物生长效应(38)。处理组将包括1)无孢子处理，2)106CFU/秧苗的PGPR Bap菌株AP193和3)106CFU/秧苗的一个显示强果胶裂解酶活性的其他PGPR Bap菌株(来自目的1)。各处理组中的秧苗将在转移到温室后两天用无菌水或果胶(上文的待测％)浇灌，利用完全随机设计十份重复。因此将有6个处理组x 10份重复＝总共60盆。果胶添加将以1周间隔发生并且植物将生长4周。在温室试验完成时测量根部和枝条的湿重和干重。根部形态将由根部扫描仪分析。各处理的枝条和根部湿重和干重变异将利用ANOVA以在5％显著性水平下比较和分析(SAS 9.1软件)。
可能的结果：向Bap处理的大豆种子添加果胶将引起大豆根部和枝条生长相对于未果胶处理植物增加。在没有PGPR菌株接种体的植物中将观察不到果胶介导的增加。
可能的问题：在试验植物中可能有未预见到的问题，例如病害爆发。我们将采取充分的预防限制发病，并计划重复该试验至少一次，如有必要的话重复更多次。所述试验的时间可能需要延长，以获得在处理组之间显著的差异。包括其他农作物物种(在校外提案中)可能是有用的，因为果胶含量在不同的植物物种中可变化并且果胶补充可能在果胶含量有限的植物中更有用。
目的3.3：评价PGPR介导的植物病害控制的果胶诱导：
我们将利用两种不同的病原体评价果胶诱导的植物病害控制：造成秧苗萌出前后猝倒病的终极腐霉(Pythium ultimum)，和分别造成黄瓜和大豆根腐病和下胚轴病变的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。因此，将完成两个独立的试验组，每个病原体一组。所述PGPR Bap菌株将以106CFU孢子，这是用PGPR作为商业种子处理的常用比率，施加到泡沫聚苯乙烯托盘中的每个黄瓜或大豆种子，并以将在零时间时施加在试验#2中所用剂量的10ml果胶浇灌。我们将包括从以前的Kloepper的实验室工作中已知抑制腐霉(Pythium)猝倒病和丝核菌(Rhizoctonia)根腐病并且在目的#1中对果胶利用阳性的至少两个PGPR Bap菌株，连同两个阴性对照：非PGPR菌株HD73和从目的#1鉴定并在目的#2中测序的果胶非感受态PGPR菌株。因此，每个试验将含有8个处理：2个以前显示控制相应的病原体的PGPR菌株和两个阴性对照菌株，有和没有果胶补充。我们将使用十份重复并且所述试验将以完全随机设计进行。在植物萌芽3天后和之前，在马铃薯右旋糖琼脂上分别生长的终极腐霉或立枯丝核菌培养物将在所述琼脂内匀浆，用无菌水稀释并进一步匀浆，然后用于以大约106细胞/ml的10ml接种秧苗。接种的植物将放入100％湿度的露舱中，24℃下在暗处2天，然后移栽到盆中并转移到温室。植物将每天浇水并监测猝倒病。在病原体接种后7和14天，将确定每个处理组的植物死亡计数，这些数据将利用ANOVA以5％显著性水平比较和分析(SAS 9.1)。
可能的结果：向Bap处理的黄瓜和大豆种子添加果胶将分别引起PGPR菌株针对终极腐霉和立枯丝核菌介导的猝倒病的防护提高。
可能的问题：有几个变量可影响这个试验，特别是在黄瓜和大豆秧苗上接种PGPR、果胶和病原体的时机。取决于试验结果，我们可能需要在重复这个试验时改变这些因素的时机和/或浓度。还有，因为这些病原体在植物生命周期中的早期时点诱导猝倒病，在早期时点可能有数量足够的代谢活性Bap细胞存在，致使果胶调理不太必要。如果观察到是这样，我们可以考虑使用对更成熟的黄瓜或大豆植物的别种病原体攻击。
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在不背离本发明的范围和精神下可以对在本文中公开的发明做出各种取代和修改，对本领域技术人员而言将是很容易显而易见的。在本文中适当地说明性描述的本发明可以在不存在未在本文中具体公开的任何要素、限制的情况下实践。已经使用的术语和表达用作描述而不是限制的术语，并且在使用这样的术语和表达中不打算除外所显示和描述的特征或其部分的任何等效物，但要承认在本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应该了解，虽然本发明已经通过特定实施方式和任选特征说明，但本领域技术人员可以寻求在本文中公开的概念的修改和/或变更，而且这样的修改和变更被认为在本发明的范围之内。
在本文中引用了许多专利和非专利参考文献。所引用的参考文献以其全文通过引用并入本文中。在说明书中术语的定义与引用的参考文献中术语的定义相比之间有不一致的情况下，所述术语应该基于说明书中的定义来解释。
序列表
<110> 奥本大学（AUBURN UNIVERSITY）
马克·R·莱尔斯（Liles, Mark R）
约瑟夫·W·克洛佩尔（Kloepper, Joseph W）
<120> 果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(PGPR)菌株促进植物和动物生长和健康的效力的用途
（USE OF PECTIN OR PECTIN-RELATED SACCHARIDES TO ENHANCE EFFICACY
OF PLANT GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA (PGPR) STRAINS FOR
PROMOTING GROWTH AND HEALTH IN PLANTS AND ANIMALS）
<130> SCT171596-10
<150> US 62/057,667
<151> 2014-09-30
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 1
atgaaagagg tcataaaaat ccataaaaac gataacgtgc ttctcgccat gcgccatttt 60
aacaaagggg agcggctgca tacagacgga ctgacgattg aagtgaagga ccctgtaaag 120
cgggggcata aaatcgcgct gcaaaccatt gaagaaaacg gcagcatcat taaatacggt 180
ttttcaatcg ggcgtgcgac aaggcggatt tcggccggcg agcatattca tacccataat 240
ctgcaaacga atttatccga tgtgcaagaa tacacgtatt caccgcgctt cgaggacaat 300
ccttttacaa atgagaaccg gacatttaaa ggctacagaa gagaaaacgg tacatccggc 360
gttcggaatg aactgtggat cgtgcctaca gtcggctgcg taaacggcgt cgctgagaaa 420
atcctgcagc gtttcgtaaa agaggcgaaa gacattgcgc cctttgacaa tgtgctggtt 480
ttaaagcacc aatacggctg ctcccagctt ggcgatgatc atgaaaatac gaaacaaatg 540
ctgatgaacg ccatccgtca tccaaatgcg ggcggtgtgc tggttttagg gctcggctgt 600
gaaaataatg agctggcggc gattagggaa acgctttctg aagtgaacgg agatcgggtg 660
aaatttctcg aatcacaagc tgtcacagct gagactgaca gcagatcaac tcgaaatgcg 720
tctaagactt cttggcattt caaatataaa cacaattaa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 2
Met Lys Glu Val Ile Lys Ile His Lys Asn Asp Asn Val Leu Leu Ala
1 5 10 15
Met Arg His Phe Asn Lys Gly Glu Arg Leu His Thr Asp Gly Leu Thr
20 25 30
Ile Glu Val Lys Asp Pro Val Lys Arg Gly His Lys Ile Ala Leu Gln
35 40 45
Thr Ile Glu Glu Asn Gly Ser Ile Ile Lys Tyr Gly Phe Ser Ile Gly
50 55 60
Arg Ala Thr Arg Arg Ile Ser Ala Gly Glu His Ile His Thr His Asn
65 70 75 80
Leu Gln Thr Asn Leu Ser Asp Val Gln Glu Tyr Thr Tyr Ser Pro Arg
85 90 95
Phe Glu Asp Asn Pro Phe Thr Asn Glu Asn Arg Thr Phe Lys Gly Tyr
100 105 110
Arg Arg Glu Asn Gly Thr Ser Gly Val Arg Asn Glu Leu Trp Ile Val
115 120 125
Pro Thr Val Gly Cys Val Asn Gly Val Ala Glu Lys Ile Leu Gln Arg
130 135 140
Phe Val Lys Glu Ala Lys Asp Ile Ala Pro Phe Asp Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Leu Lys His Gln Tyr Gly Cys Ser Gln Leu Gly Asp Asp His Glu Asn
165 170 175
Thr Lys Gln Met Leu Met Asn Ala Ile Arg His Pro Asn Ala Gly Gly
180 185 190
Val Leu Val Leu Gly Leu Gly Cys Glu Asn Asn Glu Leu Ala Ala Ile
195 200 205
Arg Glu Thr Leu Ser Glu Val Asn Gly Asp Arg Val Lys Phe Leu Glu
210 215 220
Ser Gln Ala Val Thr Ala Glu Thr Asp Ser Arg Ser Thr Arg Asn Ala
225 230 235 240
Ser Lys Thr Ser Trp His Phe Lys Tyr Lys His Asn
245 250
<210> 3
<211> 1446
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 3
ttgcggaagc tgaataaaaa gatgtgcggt gaatacaatc aatatcctga aaaagtcctt 60
cagttcggcg aaggcaactt tttgcgggcc ttcgcagact ggcagatcga tcaattgaat 120
caactgacgg attttaacgg aagcgttgtc gccgtacagc cgagaggctc tgagaaaatc 180
aaacgtttaa acgagcagga cggtttattt acgctttttt tgcaggggat aaaggacgga 240
aaaccggctg aagaacacat gatcgtcaaa tccatcagcc gcggcattga tcttttttct 300
gactatgatt cctttaaacg gctggcagca caagaggagc ttcgttttat catttccaat 360
acgacagaag cgggaatcac gtttgagaaa ggcgaccggc ttgaggatag acctcaaaaa 420
acattccccg ggaaattagc ggcgttcctt tatttccgct ataatgcatt tgcgggtgac 480
gccgagaaag ggtgcattgt gcttccatgt gaactggtcg aagaaaacgg acggaaactg 540
aaggcggccg tgcttcaata tgccgggctg tgggagctgg aacctggttt tactcaatgg 600
attcatgacg cgaacatctt ctgcaatacc ctcgtggatc ggattgttcc cggatttcct 660
gttgataccg cggaagaact taccgatttt ctcggatacg aagaccgtct gctggtggtt 720
ggtgagcatt attatttgtg ggtgatagaa gggccggaac agcttcagaa tgagcttcct 780
tttgctgagg ccgggctgaa cgcactgatc acgtctgacc ttacgtctta caggacaaaa 840
aaggtgagaa tcttaaacgg cgctcacacg gcattggcgc cagtggcttt actatacgga 900
ctgcaaaccg tccgggaagc ggctgagcac gaggtgacgg gcagattcat tgaagagctg 960
atcaatgaag aaatcctccc tgtgctgcaa atggagggtg tcacccaata cgcggcagat 1020
gtgttacagc ggtttaaaaa cccttatatc caccattatc tgcaaagcat tacccttaac 1080
gccgccgcga aattcaaaac aagaaacctg ccgacgctga aggcttatat cgaacaggag 1140
ggccggctac ctgagaagct ggtattttcg ttcagcgcca tgatctattc atactggaac 1200
ggaccgaaca aaccggctga cggcgagggg gttcttaacc gttttcaaat ggcgcggtcc 1260
cgttgcaaag atgatatgtt tcaagcggca tctgccatat taggagaaga ccggttgtgg 1320
ggaaagaatc tgaaccatct tccggggctg actgaacgaa cggctttttt tctgtctgtc 1380
attcataagc ggggtatgaa gcatgcgtta catgaatgct gcggaaaaaa gggggaagtg 1440
aaatga 1446
<210> 4
<211> 481
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 4
Met Arg Lys Leu Asn Lys Lys Met Cys Gly Glu Tyr Asn Gln Tyr Pro
1 5 10 15
Glu Lys Val Leu Gln Phe Gly Glu Gly Asn Phe Leu Arg Ala Phe Ala
20 25 30
Asp Trp Gln Ile Asp Gln Leu Asn Gln Leu Thr Asp Phe Asn Gly Ser
35 40 45
Val Val Ala Val Gln Pro Arg Gly Ser Glu Lys Ile Lys Arg Leu Asn
50 55 60
Glu Gln Asp Gly Leu Phe Thr Leu Phe Leu Gln Gly Ile Lys Asp Gly
65 70 75 80
Lys Pro Ala Glu Glu His Met Ile Val Lys Ser Ile Ser Arg Gly Ile
85 90 95
Asp Leu Phe Ser Asp Tyr Asp Ser Phe Lys Arg Leu Ala Ala Gln Glu
100 105 110
Glu Leu Arg Phe Ile Ile Ser Asn Thr Thr Glu Ala Gly Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Glu Asp Arg Pro Gln Lys Thr Phe Pro Gly
130 135 140
Lys Leu Ala Ala Phe Leu Tyr Phe Arg Tyr Asn Ala Phe Ala Gly Asp
145 150 155 160
Ala Glu Lys Gly Cys Ile Val Leu Pro Cys Glu Leu Val Glu Glu Asn
165 170 175
Gly Arg Lys Leu Lys Ala Ala Val Leu Gln Tyr Ala Gly Leu Trp Glu
180 185 190
Leu Glu Pro Gly Phe Thr Gln Trp Ile His Asp Ala Asn Ile Phe Cys
195 200 205
Asn Thr Leu Val Asp Arg Ile Val Pro Gly Phe Pro Val Asp Thr Ala
210 215 220
Glu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Gly Tyr Glu Asp Arg Leu Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Glu His Tyr Tyr Leu Trp Val Ile Glu Gly Pro Glu Gln Leu Gln
245 250 255
Asn Glu Leu Pro Phe Ala Glu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ile Thr Ser
260 265 270
Asp Leu Thr Ser Tyr Arg Thr Lys Lys Val Arg Ile Leu Asn Gly Ala
275 280 285
His Thr Ala Leu Ala Pro Val Ala Leu Leu Tyr Gly Leu Gln Thr Val
290 295 300
Arg Glu Ala Ala Glu His Glu Val Thr Gly Arg Phe Ile Glu Glu Leu
305 310 315 320
Ile Asn Glu Glu Ile Leu Pro Val Leu Gln Met Glu Gly Val Thr Gln
325 330 335
Tyr Ala Ala Asp Val Leu Gln Arg Phe Lys Asn Pro Tyr Ile His His
340 345 350
Tyr Leu Gln Ser Ile Thr Leu Asn Ala Ala Ala Lys Phe Lys Thr Arg
355 360 365
Asn Leu Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Ile Glu Gln Glu Gly Arg Leu Pro
370 375 380
Glu Lys Leu Val Phe Ser Phe Ser Ala Met Ile Tyr Ser Tyr Trp Asn
385 390 395 400
Gly Pro Asn Lys Pro Ala Asp Gly Glu Gly Val Leu Asn Arg Phe Gln
405 410 415
Met Ala Arg Ser Arg Cys Lys Asp Asp Met Phe Gln Ala Ala Ser Ala
420 425 430
Ile Leu Gly Glu Asp Arg Leu Trp Gly Lys Asn Leu Asn His Leu Pro
435 440 445
Gly Leu Thr Glu Arg Thr Ala Phe Phe Leu Ser Val Ile His Lys Arg
450 455 460
Gly Met Lys His Ala Leu His Glu Cys Cys Gly Lys Lys Gly Glu Val
465 470 475 480
Lys
<210> 5
<211> 1206
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 5
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aataagttca gcagcctcgg tcctgatacg ggatatgact caattaatga tgaacgtatc 780
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<210> 6
<211> 401
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 6
Met Arg Ala Asn Gly Ile Glu Glu Arg Cys Ile Thr Gly Asn Ala Ser
1 5 10 15
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Ala Trp Ala Lys Thr Val Pro Met Ala Ile
20 25 30
Gly Asn Pro Leu Tyr Ser Trp Thr His Leu Glu Leu Gln Arg Trp Phe
35 40 45
Gly Ile Tyr Asp Val Leu Asn Glu Lys Thr Ala Ala Ala Ile Trp Lys
50 55 60
Lys Thr Asn Glu Leu Leu Gln Gly Asp Gly Phe Gly Ala Arg Asp Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys Ser Lys Val Lys Val Ile Cys Thr Thr Asp Asp Pro Ala
85 90 95
Asp Ala Leu Thr Tyr His Glu Leu Leu Lys Glu Ser Asp Phe Pro Val
100 105 110
Gln Val Leu Pro Gly Phe Arg Pro Asp Lys Gly Leu Asp Ile Ser Ser
115 120 125
Pro Gly Phe Ala Asp Trp Val Arg Ser Leu Glu Ser Ala Ser Gly Ile
130 135 140
Ala Val Thr Thr Tyr Gln Ser Tyr Leu Asp Ala Leu Glu Ser Arg Val
145 150 155 160
Arg Phe Phe His Asn Ala Gly Gly Arg Val Ser Asp His Ala Leu Asp
165 170 175
Gln Met Val Tyr Ala Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ala Ala Arg Ile Phe
180 185 190
Ala Ala Gly Leu Ser Gly Glu His Val Ser Phe Glu Asp Glu Lys Lys
195 200 205
Phe Lys Thr Arg Thr Leu Gln Tyr Leu Cys Gly Leu Tyr Ala Glu Leu
210 215 220
Asp Trp Ala Met Gln Phe His Ile Asn Ala Leu Arg Asn Thr Asn Thr
225 230 235 240
Asn Lys Phe Ser Ser Leu Gly Pro Asp Thr Gly Tyr Asp Ser Ile Asn
245 250 255
Asp Glu Arg Ile Ala Lys Pro Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ser Ala Glu
260 265 270
Lys Lys Arg Gln Leu Pro Lys Thr Ile Leu Tyr Ser Leu Asn Pro Asn
275 280 285
Asp Asn Tyr Ile Ile Ala Ser Met Ile Asn Ser Phe Gln Asp Gly Lys
290 295 300
Thr Pro Gly Lys Ile Gln Phe Gly Thr Ala Trp Trp Phe Asn Asp Thr
305 310 315 320
Lys Asp Gly Met Leu Gln Gln Met Lys Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu
325 330 335
Phe Ser Arg Phe Ile Gly Met Leu Thr Asp Ser Arg Ser Phe Leu Ser
340 345 350
Tyr Pro Arg His Glu Tyr Phe Arg Arg Leu Val Cys Thr Leu Ile Gly
355 360 365
Gly Trp Ala Glu Gln Gly Glu Ala Pro Tyr Asp Met Glu Leu Leu Gly
370 375 380
Arg Ile Val Glu Gly Ile Cys Tyr Arg Asn Ala Glu Glu Tyr Phe Arg
385 390 395 400
Phe
<210> 7
<211> 1077
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 7
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gcagaggtcg tggaaagcgt gaatgttcat gaagccatta aactcggtca tgaagaacgc 240
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ctggaggatg ggtcaaccgc actgtttttt gaaaaagcga aagtggaaag tctccctccg 420
gaggaactga tccgcacggt tgaagaatct tctgatttga cgcttcccgg gtgggagccg 480
gagaaaatgg ccaggatcaa ggaactgttt gaggcctatc aaacggttga tgaaaaacag 540
ctttgggcca atcttgagtt ctttttacat gaaatccttc ctgtagcgga ggaacacggc 600
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attacgttgt gcacgggttc gatgggagcg gatcccgcca atgatatggt gaagatcacc 780
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ggtgatttta cggaaacttc gcatcttacc agtgatgggt ccattgatat taccggtgtt 900
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tatttgaacg gactgtggga tgcgttttcg tctcatgaga aaggggtgaa gagatga 1077
<210> 8
<211> 358
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Glu His Val Arg Gln Ile Pro Gly Val Lys Gly Ile Val Trp Ala
20 25 30
Leu His Gln Lys His Ala Gly Glu Val Trp Glu Lys Glu Asp Ile Glu
35 40 45
Ala Glu Val Arg Tyr Ile Gln Ser Tyr Gly Phe His Ala Glu Val Val
50 55 60
Glu Ser Val Asn Val His Glu Ala Ile Lys Leu Gly His Glu Glu Arg
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Ile Glu His Tyr Lys Gln Thr Ile Arg Asn Leu Ser Glu
85 90 95
Phe Gly Val Lys Val Ile Cys Tyr Asn Phe Met Pro Ile Phe Asp Trp
100 105 110
Thr Arg Thr Asp Met Phe Arg Ala Leu Glu Asp Gly Ser Thr Ala Leu
115 120 125
Phe Phe Glu Lys Ala Lys Val Glu Ser Leu Pro Pro Glu Glu Leu Ile
130 135 140
Arg Thr Val Glu Glu Ser Ser Asp Leu Thr Leu Pro Gly Trp Glu Pro
145 150 155 160
Glu Lys Met Ala Arg Ile Lys Glu Leu Phe Glu Ala Tyr Gln Thr Val
165 170 175
Asp Glu Lys Gln Leu Trp Ala Asn Leu Glu Phe Phe Leu His Glu Ile
180 185 190
Leu Pro Val Ala Glu Glu His Gly Ile Gln Met Ala Ile His Pro Asp
195 200 205
Asp Pro Pro Trp Ser Ile Phe Gly Leu Pro Arg Ile Ile Thr Gly Glu
210 215 220
Lys Ser Tyr Glu Lys Leu Gln Glu Ile Ser Asp Ser Pro Ala Asn Cys
225 230 235 240
Ile Thr Leu Cys Thr Gly Ser Met Gly Ala Asp Pro Ala Asn Asp Met
245 250 255
Val Lys Ile Thr Lys His Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Phe Ala His Ile
260 265 270
Arg Asn Val Lys Ile Cys Asp Asn Gly Asp Phe Thr Glu Thr Ser His
275 280 285
Leu Thr Ser Asp Gly Ser Ile Asp Ile Thr Gly Val Val Lys Glu Leu
290 295 300
His Gly Gln Asp Tyr Lys Gly Tyr Val Arg Pro Asp His Gly Arg His
305 310 315 320
Ile Trp Gly Glu Gln Cys Arg Pro Gly Tyr Gly Leu Tyr Asp Arg Ala
325 330 335
Leu Gly Ile Met Tyr Leu Asn Gly Leu Trp Asp Ala Phe Ser Ser His
340 345 350
Glu Lys Gly Val Lys Arg
355
<210> 9
<211> 477
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 9
atggacgaaa cggggttttc cagcgtattt tcaaccaact ttaccggtgc atttctggca 60
tcgcaagtgt ttggaaaaga ccttttgaag gcggaatgtc ccgcgattat taatatttct 120
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<210> 10
<211> 158
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 10
Met Asp Glu Thr Gly Phe Ser Ser Val Phe Ser Thr Asn Phe Thr Gly
1 5 10 15
Ala Phe Leu Ala Ser Gln Val Phe Gly Lys Asp Leu Leu Lys Ala Glu
20 25 30
Cys Pro Ala Ile Ile Asn Ile Ser Ser Met Ser Ala Tyr Thr Pro Met
35 40 45
Thr Lys Val Pro Ala Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Ala Val Gln Asn Phe
50 55 60
Thr Met Trp Met Ala Val His Phe Ala Lys Lys Gly Leu Arg Val Asn
65 70 75 80
Ala Ile Ala Pro Gly Phe Phe Leu Thr Ala Gln Asn Arg Glu Leu Leu
85 90 95
Leu Gln Glu Asp Gly Ser Leu Thr Asp Arg Ser Asn Lys Ile Met Ala
100 105 110
His Thr Pro Met Lys Arg Phe Gly Lys Pro Glu Asp Leu Leu Gly Thr
115 120 125
Leu Leu Trp Leu Ser Asp Asp Ser Cys Ser Gly Phe Val Thr Gly Val
130 135 140
Thr Val Pro Val Asp Gly Gly Phe Met Ala Tyr Ser Gly Val
145 150 155
<210> 11
<211> 636
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 11
atgctgccta agtacgccat ttacgaaaaa cttctgcatg cacaagtggt ggctgtcata 60
aggggacaaa acagccaaga ggcgcttgaa gtttcaaaag cggccatttc aggaggtatc 120
agcgccattg agcttacata cacaactcct gaagtggaag atgtctttaa ggaactccgg 180
catcaagata ttcttcttgg agccggctct gtaatggata cagaaacggc gagacacgcc 240
attttatcag gcgcctcatt tatcgtcagc tctcattttg taaaagagat agcatctcta 300
tgcaaccagt acagcgtacc gtatcttccg ggatgcatga gtgtgtctga tatggctttg 360
gcgctcgaag ccggatgtga tgtggtaaag ctgttccccg ctaattcgtt tgacccttca 420
tttatcaagt cggtcaacgg ccctctgccg aatgtccgca ttatgccgac cgggggtatc 480
tcattaaaca gcatgaatga ctggctctct gccggagcgg tcgcggtcgg tgtgggaagc 540
gacttgacaa aagcatatca aaagggcggc tatgaggctg ccgtatccct cagcaaagaa 600
tacgtctgcc gaaaaaacga atatacgggg gtgtaa 636
<210> 12
<211> 211
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 12
Met Leu Pro Lys Tyr Ala Ile Tyr Glu Lys Leu Leu His Ala Gln Val
1 5 10 15
Val Ala Val Ile Arg Gly Gln Asn Ser Gln Glu Ala Leu Glu Val Ser
20 25 30
Lys Ala Ala Ile Ser Gly Gly Ile Ser Ala Ile Glu Leu Thr Tyr Thr
35 40 45
Thr Pro Glu Val Glu Asp Val Phe Lys Glu Leu Arg His Gln Asp Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val Met Asp Thr Glu Thr Ala Arg His Ala
65 70 75 80
Ile Leu Ser Gly Ala Ser Phe Ile Val Ser Ser His Phe Val Lys Glu
85 90 95
Ile Ala Ser Leu Cys Asn Gln Tyr Ser Val Pro Tyr Leu Pro Gly Cys
100 105 110
Met Ser Val Ser Asp Met Ala Leu Ala Leu Glu Ala Gly Cys Asp Val
115 120 125
Val Lys Leu Phe Pro Ala Asn Ser Phe Asp Pro Ser Phe Ile Lys Ser
130 135 140
Val Asn Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Ile Met Pro Thr Gly Gly Ile
145 150 155 160
Ser Leu Asn Ser Met Asn Asp Trp Leu Ser Ala Gly Ala Val Ala Val
165 170 175
Gly Val Gly Ser Asp Leu Thr Lys Ala Tyr Gln Lys Gly Gly Tyr Glu
180 185 190
Ala Ala Val Ser Leu Ser Lys Glu Tyr Val Cys Arg Lys Asn Glu Tyr
195 200 205
Thr Gly Val
210
<210> 13
<211> 957
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 13
gtggcttctg attatggcat ttttacgatc ggtgatgcga tgatcacctt aaatcccgca 60
agcacaggac ctttgcgttt tgttacccat tttgaacgaa aagcaggagg agctgaactg 120
aattttgcga ttgcatgcgc cagattgaat ctgcactcaa agtgggtcag cagactgggg 180
aaggatgagt tcggcagagt gatttatcag tttgccagag gagaaggaat tgatgtgact 240
gacgtctcct atgttgaagg ctttcctaca tctttaaatg tcaaagagat cagaaatgac 300
ggttcaggca agacgtttta ttatcgtttc aattcaccaa ttctgactct tgcaccggaa 360
gatataacag agaatatgtt tgacggcatt cacatcgttc atcttaccgg tgtgttcctc 420
gcgcttgata agaaaaatct tgaaattgct gaaagggtgc tttccatcgc caaagcaagg 480
gggattcccg tatcttttga tccgaatatc aggctgaagc tgtggacgat tgaggaggcg 540
cgtgcggcat ttcatcaaat ctttccgcat actgatattc ttctggcggg ccgggacgaa 600
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tcaatcagtc agcttgtcat aaaagacggt gaagcaggtt ctgcgctgta tcatgatcat 720
aagtggattc acaaagaggc tttcccggtt gcgcctgttg acacggtagg agcgggtgac 780
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ccctatctag aagaggttct gtcatttgta aacaaagaga ctgtgattga acggtag 957
<210> 14
<211> 318
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 14
Met Ala Ser Asp Tyr Gly Ile Phe Thr Ile Gly Asp Ala Met Ile Thr
1 5 10 15
Leu Asn Pro Ala Ser Thr Gly Pro Leu Arg Phe Val Thr His Phe Glu
20 25 30
Arg Lys Ala Gly Gly Ala Glu Leu Asn Phe Ala Ile Ala Cys Ala Arg
35 40 45
Leu Asn Leu His Ser Lys Trp Val Ser Arg Leu Gly Lys Asp Glu Phe
50 55 60
Gly Arg Val Ile Tyr Gln Phe Ala Arg Gly Glu Gly Ile Asp Val Thr
65 70 75 80
Asp Val Ser Tyr Val Glu Gly Phe Pro Thr Ser Leu Asn Val Lys Glu
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Ile Arg Asn Asp Gly Ser Gly Lys Thr Phe Tyr Tyr Arg Phe Asn Ser
100 105 110
Pro Ile Leu Thr Leu Ala Pro Glu Asp Ile Thr Glu Asn Met Phe Asp
115 120 125
Gly Ile His Ile Val His Leu Thr Gly Val Phe Leu Ala Leu Asp Lys
130 135 140
Lys Asn Leu Glu Ile Ala Glu Arg Val Leu Ser Ile Ala Lys Ala Arg
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Gly Ile Pro Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg Leu Lys Leu Trp Thr
165 170 175
Ile Glu Glu Ala Arg Ala Ala Phe His Gln Ile Phe Pro His Thr Asp
180 185 190
Ile Leu Leu Ala Gly Arg Asp Glu Met Lys Gln Leu Thr Gly Ile Gly
195 200 205
Glu Asn Glu Ala Leu Ala Arg Phe Ala Glu Thr Tyr Ser Ile Ser Gln
210 215 220
Leu Val Ile Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ser Ala Leu Tyr His Asp His
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Lys Trp Ile His Lys Glu Ala Phe Pro Val Ala Pro Val Asp Thr Val
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Gly Ala Gly Asp Gly Phe Asn Ala Gly Tyr Leu Tyr Ser Tyr Leu His
260 265 270
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Glu Val Leu Ser Phe Val Asn Lys Glu Thr Val Ile Glu Arg
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<210> 15
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<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 15
atgaaaacca ttacaatttc tgatgtggcg aaatatgcaa acgtatctaa aagcaccgta 60
tctcaatttt taaatcagcg ctatgactat atgagcgaga aaacgaaaca aaaaatagaa 120
gcggccattc aagagctgaa ctatcagccg aatttcgtcg cccgcagctt aaaacagaaa 180
tcaacattta cggtaggtgt ggtggtggct aatattcttc acactttttc cactcaggtc 240
atcagggcgg tggaagacta ttttcatgaa caaggatttc atattattgt ctgcaatgcg 300
gatgatgaaa cggagaaaga aaagaaatat attgaaatgc tgcgggctaa gcaggtggac 360
ggaattatta tttttccgac gggcgaaaat ctctctttat atgaaaagat gaaacgcgat 420
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cttgataatc atcatgcagc cggtcttgcc gttgaccggt ttatcgaaag cggcattaag 540
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<210> 16
<211> 333
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 16
Met Lys Thr Ile Thr Ile Ser Asp Val Ala Lys Tyr Ala Asn Val Ser
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Lys Ser Thr Val Ser Gln Phe Leu Asn Gln Arg Tyr Asp Tyr Met Ser
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Glu Lys Thr Lys Gln Lys Ile Glu Ala Ala Ile Gln Glu Leu Asn Tyr
35 40 45
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Val Gly Val Val Val Ala Asn Ile Leu His Thr Phe Ser Thr Gln Val
65 70 75 80
Ile Arg Ala Val Glu Asp Tyr Phe His Glu Gln Gly Phe His Ile Ile
85 90 95
Val Cys Asn Ala Asp Asp Glu Thr Glu Lys Glu Lys Lys Tyr Ile Glu
100 105 110
Met Leu Arg Ala Lys Gln Val Asp Gly Ile Ile Ile Phe Pro Thr Gly
115 120 125
Glu Asn Leu Ser Leu Tyr Glu Lys Met Lys Arg Asp Thr Phe Pro Val
130 135 140
Val Phe Met Asp Arg Thr Ile Glu Glu Leu Gly Ile Pro Thr Val Met
145 150 155 160
Leu Asp Asn His His Ala Ala Gly Leu Ala Val Asp Arg Phe Ile Glu
165 170 175
Ser Gly Ile Lys Arg Ile Ala Ile Ile Thr Thr Ser Ile Ile Arg Glu
180 185 190
Ile Ser Pro Arg Val Glu Arg Ile Glu Gly Tyr Lys Lys Ala Leu Asp
195 200 205
Arg His Gly Met Met Val Arg Asp Glu Tyr Ile Lys Thr Ala Asp Ala
210 215 220
Ala Asp Ile Ser Asn Val Leu Ser Glu Leu Phe Ser Leu Glu Glu Pro
225 230 235 240
Pro Lys Ala Ile Leu Ala Ala Asn Asp Ile Val Leu Val Glu Val Leu
245 250 255
Lys Tyr Met Lys Glu His Asp Met Thr Ile Pro Asp Lys Ala Ala Val
260 265 270
Ile Gly Ile Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe Phe Thr Pro Pro Ile
275 280 285
Thr Thr Ile Val Gln Pro Ala Ala Glu Met Ala Arg Lys Ala Gly Ser
290 295 300
Leu Leu Leu Arg Gln Ile Gln Glu Lys Asp Gly Gly Glu Lys Arg Ile
305 310 315 320
His Arg Tyr Lys Pro Ala Leu Leu Ala Arg Gln Ser Gly
325 330
<210> 17
<211> 489
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 17
atgttctcaa aagatagatt ccctattatt cttcttttat tttcagccgg ggtgattaac 60
tatttagacc gctcagcgct gtctattgca gcgccgttca tacagcagga tctcacattg 120
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ccgcgatga 489
<210> 18
<211> 162
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 18
Met Phe Ser Lys Asp Arg Phe Pro Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ser Ala
1 5 10 15
Gly Val Ile Asn Tyr Leu Asp Arg Ser Ala Leu Ser Ile Ala Ala Pro
20 25 30
Phe Ile Gln Gln Asp Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gln Met Gly Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ser Phe Ser Val Gly Tyr Ala Val Phe Asn Phe Leu Gly Gly
50 55 60
Val Ala Ser Asp Arg Tyr Gly Ala Lys Leu Thr Leu Cys Thr Ala Met
65 70 75 80
Ile Val Trp Ser Leu Phe Ser Gly Ala Val Ala Leu Ala Phe Gly Phe
85 90 95
Val Ser Leu Leu Ile Ile Arg Val Leu Phe Gly Met Gly Glu Gly Pro
100 105 110
Leu Ser Ala Ala Ile Ser Lys Met Val Asn Asn Trp Phe Pro Pro Ser
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Gln Arg Ala Thr Val Ile Gly Leu Thr Asn Ser Gly Thr Pro Leu Gly
130 135 140
Arg Phe Trp Ile Asp Ala Trp Leu Ile Gly Trp Arg Ser Leu Ala Val
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Pro Arg
<210> 19
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<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 19
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gaatttcaag acgcttacga ctattttccg caatgggacc cgacggacgg cagcagcggc 600
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tcctataata aatatcatga ccatgacaaa ggctccgtca tcggaaacag cgacagcaag 840
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<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 20
Met Lys Lys Met Leu Phe Met Leu Ala Val Cys Leu Cys Met Ile Pro
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Ala Asp Val Tyr Ala Ala Asp Leu Gly Arg Gln Thr Leu Gly Thr Asn
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Tyr Ile Thr Leu Ser Tyr Asn Lys Tyr His Asp His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Val Ile Gly Asn Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Glu Gly Lys Leu Lys
275 280 285
Val Thr Ile His His Asn Tyr Tyr Gln Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro
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Arg Val Arg Tyr Gly Gln Val His Ile Tyr Asn Asn Phe Tyr Ala Gly
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Ser Lys Ser Ala Ala Tyr Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ala Gly His
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Ala Ser Lys Ile Tyr Ala Gln Asn Asn Val Phe Glu Val Pro Gly Leu
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Ala Ala Asp Lys Val Ile Ser Val Phe Ser Gly Gly Lys Ala Leu His
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<211> 1407
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 21
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ggcaccatca attcggtgat cgctcataac attatgtatc gaaatgacac gaaggacctt 1080
gacggcggcc agctgctgct gcagtacggc acaaaaggga acacgatcga aaaaaacatc 1140
atgacggcaa gcggttcacg gatttttatc gcaaatgatt atacgaaaaa cgaaggcaat 1200
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<400> 22
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100 105 110
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130 135 140
Ala Thr Ala Met Gly Ile Cys Val Thr Gly Ser Ser Ser His Ile Asn
145 150 155 160
Ile Glu Gly Asn His Ile Arg Asn Ile Lys Thr Thr Ala Asp Glu Gly
165 170 175
Asn Ala His Gly Ile Ala Phe Tyr Gly Thr Gly Ala Met Lys Asp Val
180 185 190
Ser Ile Thr Asn Asn Thr Val Glu Lys Leu Thr Leu Gly Ala Ser Glu
195 200 205
Ala Val Val Leu Asn Gly Asn Val Asp Gly Phe Lys Ile Ala Gly Asn
210 215 220
Thr Ile Arg Asp Asn Asn Asn Ile Gly Ile Asp Val Ile Gly Tyr Glu
225 230 235 240
Gly Thr Ser Lys Gln Asn Asp Tyr Ala Arg Asn Gly Val Ile Glu Asn
245 250 255
Asn Thr Val Ser His Asn Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala Tyr Gly Asp
260 265 270
Glu Tyr Ser Ala Gly Gly Ile Tyr Val Asp Gly Ala Glu His Val Asp
275 280 285
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290 295 300
Ser Glu His Arg Gly Lys Tyr Ala Arg Asp Ile Arg Ile Thr Asp Asn
305 310 315 320
Lys Val Tyr Gly Asn Ala Tyr Thr Gly Ile Ser Ile Gly Gly Tyr Asp
325 330 335
Thr Lys Arg Gly Gly Thr Ile Asn Ser Val Ile Ala His Asn Ile Met
340 345 350
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355 360 365
Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Thr Ile Glu Lys Asn Ile Met Thr Ala Ser
370 375 380
Gly Ser Arg Ile Phe Ile Ala Asn Asp Tyr Thr Lys Asn Glu Gly Asn
385 390 395 400
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<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 23
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gccatcgtat gttccgcatc aaagcaggca gaagcggcag cggcttatcc ggatgtgatg 120
cagggactta ccggattcgc gggaaatgcg aaggatcata acggaaaagc aaaatccgcc 180
gtaacgggag gccagggcgg ccccgtcgtc tacgtcagca atctcaatga tttgaaaaac 240
aatgcgggcg gaacggaccg caaaaccatc gtcatcacaa gtgatatttc ttccccgggt 300
aaagccgtcg tgacagtcgg cgccaataaa accatcgtcg gctcttatac cagccacagg 360
ctgaccaaca tctatctgac caccggctcc ggctcaaaca atgtgatttt caaaaatctc 420
attatcagcc atagtgccgc cattacgggc aacaacgaca ttccgatgta catagcgaac 480
ggacagaatt actggattga ccacgtgtgg tttgaaggac acagctacaa tccgaacagc 540
cacagtgatt tgggaaagct tctgtatgtc ggcgccaaag cggattttgt gacgctgtct 600
aactctaaat tcacagacca tctgtacggg ctgattctcg gttatccgaa tgatgataac 660
gaaggacgca attatatcgg ctatccgcat atgacgatca ccaacaacta ttttaataac 720
gtctatgtgc gttcaccggg cctgatgaga tacggctatt ttcacgcgaa aaacaactat 780
gtgaccaatt tcaatttagg attcaccatt catacaaacg cgactgtctt ctcagaagcc 840
aactatttcg gtaacggaaa tgaaaaaggc ggaatgatag acgactacgg gacggcccaa 900
ttcaccgaca ccggttcatt cccgtcgctc aaggccccga aatcaccgcg caccggctgg 960
aatccgagat caaattacag ctacggcacc ctttcagccc aggacgccaa aaacttcgcc 1020
caatcttacg cgggagcgca aaatacaaat ctccgctatc cataa 1065
<210> 24
<211> 354
<212> PRT
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 24
Met Ile Lys Lys Thr Arg His Leu Ala Phe Leu Ala Ala Leu Gly Phe
1 5 10 15
Ala Leu Cys Leu Ala Ile Val Cys Ser Ala Ser Lys Gln Ala Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Tyr Pro Asp Val Met Gln Gly Leu Thr Gly Phe Ala Gly
35 40 45
Asn Ala Lys Asp His Asn Gly Lys Ala Lys Ser Ala Val Thr Gly Gly
50 55 60
Gln Gly Gly Pro Val Val Tyr Val Ser Asn Leu Asn Asp Leu Lys Asn
65 70 75 80
Asn Ala Gly Gly Thr Asp Arg Lys Thr Ile Val Ile Thr Ser Asp Ile
85 90 95
Ser Ser Pro Gly Lys Ala Val Val Thr Val Gly Ala Asn Lys Thr Ile
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Thr Ser His Arg Leu Thr Asn Ile Tyr Leu Thr Thr
115 120 125
Gly Ser Gly Ser Asn Asn Val Ile Phe Lys Asn Leu Ile Ile Ser His
130 135 140
Ser Ala Ala Ile Thr Gly Asn Asn Asp Ile Pro Met Tyr Ile Ala Asn
145 150 155 160
Gly Gln Asn Tyr Trp Ile Asp His Val Trp Phe Glu Gly His Ser Tyr
165 170 175
Asn Pro Asn Ser His Ser Asp Leu Gly Lys Leu Leu Tyr Val Gly Ala
180 185 190
Lys Ala Asp Phe Val Thr Leu Ser Asn Ser Lys Phe Thr Asp His Leu
195 200 205
Tyr Gly Leu Ile Leu Gly Tyr Pro Asn Asp Asp Asn Glu Gly Arg Asn
210 215 220
Tyr Ile Gly Tyr Pro His Met Thr Ile Thr Asn Asn Tyr Phe Asn Asn
225 230 235 240
Val Tyr Val Arg Ser Pro Gly Leu Met Arg Tyr Gly Tyr Phe His Ala
245 250 255
Lys Asn Asn Tyr Val Thr Asn Phe Asn Leu Gly Phe Thr Ile His Thr
260 265 270
Asn Ala Thr Val Phe Ser Glu Ala Asn Tyr Phe Gly Asn Gly Asn Glu
275 280 285
Lys Gly Gly Met Ile Asp Asp Tyr Gly Thr Ala Gln Phe Thr Asp Thr
290 295 300
Gly Ser Phe Pro Ser Leu Lys Ala Pro Lys Ser Pro Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Asn Pro Arg Ser Asn Tyr Ser Tyr Gly Thr Leu Ser Ala Gln Asp Ala
325 330 335
Lys Asn Phe Ala Gln Ser Tyr Ala Gly Ala Gln Asn Thr Asn Leu Arg
340 345 350
Tyr Pro
<210> 25
<211> 1577
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 25
gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga 60
tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct 120
gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat 180
ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc 240
tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc 300
ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg 420
taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta 480
cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagagccgc gggtaatacg taggtggcaa 540
gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaagcg ttttcttaag tctgatgtga 600
aacccccggg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaaccgag gaacttgagt gcagaagagg 660
agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg 720
aaggcgactc tctgttctgt aactgacgct gagagagcga agcgtgggga gcgaacagaa 780
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc 840
cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg 900
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc 1020
ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac 1140
tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc 1260
gaggttaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg 1320
cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380
ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1440
cctttatgga gccagccgcc gaaggtggga cagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatcacc tcctttctaa ggattttaac ggaatataag 1560
accttgggtc ttataac 1577
<210> 26
<211> 1836
<212> DNA
<213> Bacillus Amyloliquefaciens
<400> 26
atgtacatcg gatcaactaa cagcaaaggc cttcaccact tggtgtggga aatcgtcgac 60
aacagtattg acgaagccct ggccggttat tgtacagata ttaacatcga gattgaaaaa 120
gataacagca ttaccgttaa ggacaacggg cgcggaattc cggtcggtat ccaggagaag 180
atgggccgcc ctgcggttga agtcatcatg accgttctcc acgccggcgg taaatttgac 240
ggaagcggat ataaagtatc cggcggtctt cacggtgtag gggcatctgt cgtaaacgcc 300
ttgtcgacca ctcttgacgt tacggttcat cgtgacggaa aaatccacta tcaggcgtac 360
gagcgcggtg tacctgtggc cgatcttgaa gtgatcggtg atactgataa gaccggaacg 420
attacgcact tcgttccgga tccggaaatc ttcaaagaaa caatcgtata cgactatgat 480
ctgctttcaa accgtgtccg ggaattggcc ttcctgacaa aaggcgtaaa catcacgatt 540
gaagacaaac gtgatggaca agaacggaaa aacgagtacc actacgaagg cggaatcaaa 600
agctatgttg agtacttaaa ccgttccaaa gaagtcgttc atgaagagcc gatttatatc 660
gaaggcgaga aagacggcat aacggttgaa gttgcattgc aatacaacga cagctataca 720
agcaacattt attctttcac aaataatatc aacacttacg aaggcgggac gcacgaagcc 780
ggatttaaaa ccggtctgac ccgtgtcata aacgactatg caagaagaaa agggattttc 840
aaagaaaatg atccgaactt aagcggggat gatgtgagag aagggctgac tgccattatt 900
tcaattaagc accctgatcc gcaattcgaa gggcagacga aaaccaagct cggcaactcc 960
gaagcgagaa cgatcactga tacgctgttt tcttctgcgc tggaaacatt ccttcttgaa 1020
aatccggact cagcccgcaa aattgttgaa aaaggtttaa tggccgcaag agcgcggatg 1080
gcagcgaaaa aagcacggga attgacccgg cgcaaaagtg cgcttgagat ttccaatctg 1140
ccgggcaaac tggcggactg ttcttctaaa gatccgagca tttccgagct gtatatcgta 1200
gagggtgact ctgcgggcgg atcagcgaaa cagggacggg accgtcattt ccaagctatt 1260
ctgccgctgc gcggtaagat tctgaacgtt gagaaagcca gacttgataa gattctctca 1320
aacaatgagg tcagatcaat gatcacggcc ctcggaacag gaatcggaga agattttaat 1380
cttgaaaaag cccgttatca taaagtggtc atcatgacgg atgccgatgt tgacggcgcc 1440
cacatcagaa cgcttttatt aacgttcttc tacagataca tgcgggaaat catcgaaaac 1500
ggctatgtct acattgccca gccgccgctt tataaagtgc agcagggaaa acgggtggaa 1560
tacgcttata acgataagca gcttgatgag ctgttaaaag aacttccgca atcacctaag 1620
cccggcctcc agcgttataa aggtcttgga gaaatgaacg cgactcagct ttgggaaacg 1680
acaatggacc ctgcgaccag aacgcttctg caagtcaatc ttgaagatgc aatggacgct 1740
gacgagactt ttgaaatgct gatgggtgac aaagtagaac cgcggagaaa cttcatagaa 1800
gcaaacgcca gatacgtgaa aaaccttgat atttaa 1836

Claims (34)

1.接种剂，其包含：(a)表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)和(b)包含果胶或果胶相关糖类的糖类。
2.权利要求1的接种剂，其中所述PGPR是芽孢杆菌(Bacillus)物种。
3.权利要求2的接种剂，其中所述芽孢杆菌物种是解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subspecies plantarum)。
4.权利要求1的接种剂，其中所述果胶相关糖类包含水解果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、或其混合物。
5.权利要求1的接种剂，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的多糖。
6.权利要求1的接种剂，其中糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的杂多糖，所述D-半乳糖醛酸单体占所述杂多糖所有单体的至少50％。
7.权利要求6的接种剂，其中所述杂多糖还包含一种或多种选自D-木糖、D-芹菜糖和L-鼠李糖的单体。
8.权利要求1的接种剂，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体或D-葡萄糖醛酸单体的多糖或单糖的异质混合物，并且所述混合物中D-半乳糖醛酸单体和D-葡萄糖醛酸单体的总和占所述混合物总单体的至少50％。
9.植物种子，其用权利要求1的接种剂包衣。
10.动物饲料，其包含权利要求1的接种剂。
11.改善植物生长或植物健康的方法，所述方法包含：(a)用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)处理植物、种子或土壤和(b)用包含果胶或果胶相关糖类的糖类处理植物、种子或土壤。
12.权利要求11的方法，其中用所述PGPR和所述糖类同时处理所述植物、种子或土壤。
13.权利要求11的方法，其中首先用所述PGPR处理所述植物、种子或土壤并随后用所述糖类处理所述植物、种子或土壤。
14.权利要求11的方法，其中首先用所述糖类处理所述植物、种子或土壤并随后用所述PGPR处理所述植物、种子或土壤。
15.权利要求11的方法，其中所述方法通过控制选自线虫和昆虫的土传虫害来改善植物生长或植物健康。
16.权利要求11的方法，其中所述方法通过控制选自细菌病害、真菌病害和病毒病害的病害来改善植物生长或植物健康。
17.权利要求11的方法，其中所述PGPR是芽孢杆菌物种。
18.权利要求17的方法，其中所述芽孢杆菌物种是解淀粉芽孢杆菌植物亚种。
19.权利要求11的方法，其中所述果胶相关糖类包含水解果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、或其混合物。
20.权利要求11的方法，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的多糖。
21.权利要求11的方法，其中糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的杂多糖，所述D-半乳糖醛酸单体占所述杂多糖所有单体的至少50％。
22.权利要求21的方法，其中所述杂多糖还包含一种或多种选自D-木糖、D-芹菜糖和L-鼠李糖的单体。
23.权利要求11的方法，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体或D-葡萄糖醛酸单体的多糖或单糖的异质混合物，并且所述混合物中D-半乳糖醛酸单体和D-葡萄糖醛酸单体的总和占所述混合物总单体的至少50％。
24.改善动物生长或动物健康的方法，所述方法包括：(a)向动物施用表达果胶代谢相关蛋白的植物促生根际细菌(PGPR)和(b)向动物施用包含果胶或果胶相关糖类的糖类。
25.权利要求24的方法，其中向所述动物同时施用所述PGPR和所述糖类。
26.权利要求24的方法，其中首先向所述动物施用所述PGPR并随后向所述动物施用所述糖类。
27.权利要求24的方法，其中首先向所述动物施用所述糖类并随后向所述动物施用所述PGPR。
28.权利要求24的方法，其中所述PGPR是芽孢杆菌物种。
29.权利要求28的方法，其中所述芽孢杆菌物种是解淀粉芽孢杆菌植物亚种。
30.权利要求24的方法，其中所述果胶相关糖类包含水解果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、或其混合物。
31.权利要求24的方法，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的多糖。
32.权利要求24的方法，其中糖类是包含D-半乳糖醛酸单体的杂多糖，所述D-半乳糖醛酸单体占所述杂多糖所有单体的至少50％。
33.权利要求32的方法，其中所述杂多糖还包含一种或多种选自D-木糖、D-芹菜糖和L-鼠李糖的单体。
34.权利要求24的方法，其中所述糖类是包含D-半乳糖醛酸单体或D-葡萄糖醛酸单体的多糖或单糖的异质混合物，并且所述混合物中D-半乳糖醛酸单体和D-葡萄糖醛酸单体的总和占所述混合物总单体的至少50％。
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