CN101781629B - 一种根瘤固氮菌株系ry5菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根瘤固氮菌株系RY5菌株及其应用。所述菌株((Bradyrhizobium sp.RY5))于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 209269。本发明的根瘤固氮菌株系RY5具有很强的耐酸性，回接到柱花草TPRC2、TPRC5，能提高柱花草的有效根瘤结瘤数，使两个品种的柱花草都能达到高产。当菌体被释放到自然环境中时，增加了土壤间根瘤菌的群体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用，且对人、动物和植物无害，不会污染环境。

Description

一种根瘤固氮菌株系RY5菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物营养和牧草栽培技术领域，具体涉及一种生物固氮技术，尤其是涉及一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。 

背景技术

柱花草(Stylosanthes guianensis SW.)又名热带苜蓿、巴西苜蓿，原产于南美洲。1982年中国热带农业科学院引自国际热带农业中心(CIAT)，并在海南试种成功，现在已大面积推广于华南各省(区)。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，粗脂肪1.8～2.5％，租纤维17.0～19.0％，无氮浸出物38.0～44.0％，粗灰分8.0～10.0％，是一种优良的热带豆科牧草。中国南方如广东、广西等省(区)，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和改土培肥的作用。如果与禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。 

柱花草通常选择排水良好、土层深厚、土质较好的沙壤或壤土种植。但在贫瘠土壤中，柱花草幼苗不能形成根瘤，或仅有一些由土著根瘤侵染形成的无效根瘤，在贫瘠的土地上豆科植物结种根瘤菌可增加产量15～50％。为提高柱花草结瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌种，可有效提高柱花草的结瘤率。因此筛选能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌具有重要的意义。 

柱花草以其高产、优质及耐粗放管理的特性在引进后很快成为我了我国南方豆科牧草的主推品种。在柱花草引进之初由于种植地土壤中柱花草 土著菌的含量极低，柱花草不能很好的结瘤固氮，主要依靠施肥获得高产。这样就不能体现出真正的高产和耐粗放管理。目前我国还没筛选出适合于我国气候土壤条件的菌株，故从我国种植柱花草的不同类型土壤条件的土著菌中筛选适合于特定区域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的现实意义。 

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种根瘤固氮菌株系RY5，一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。 

本发明人于2009年2月于广西柳州百棚畜牧场(N＝24°06.120′，E＝109°18.00′，H＝125m)采集到一株经严冬后仍然存活的柱花草根瘤。剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存。经分离及纯化得到一种慢生根瘤菌株RY5(Bradyrhizobium sp.)，于2009年11月13日保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 209269。其16sDNA序列如SEQ ID NO 1所示。 

本发明的另一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY5的培养方法。 

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：将采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存，以备后续的分离和纯化操作。具体的分离及纯化过程包括以下步骤： 

(1)将柱花草的根系冲洗干净，将根瘤带2mm的根剪下于培养皿中用2级水将表面冲洗干净； 

(2)将冲洗干净的根瘤灭菌后捣碎，蘸取乳白色汁液在YMA固体培养基上划线，将划好的板倒置于保鲜袋中置于28±1℃培养箱黑暗中培养； 

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度； 

(4)排除非根瘤菌菌落后根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色不一致的菌落挑出，在新的YMA培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。 

所述菌株菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白色不透明点状物后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。 

菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含 

-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对。 

本发明同时提供了所述根瘤固氮菌株系RY5菌株回接柱花草的方法，包括以下步骤： 

(1)将分离纯化出来的根瘤RY5用无菌水洗入液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于0.6时得菌液； 

(2)将柱花草种子在95％(体积比浓度)的乙醇中浸泡后在用0.1％(质量体积浓度，0.1g HgCl₂/100ml水)的HgCl₂溶液处理，用无菌水冲洗，排放于培养皿中灭菌的发芽纸上，用灭菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽3天，待苗长到4厘米时移入灭菌沙培箱中； 

(3)从步骤(2)所述沙培箱中选取壮实的苗用步骤(1)制备得到的菌液浸泡15分钟后栽种在装满灭菌砂的花盆中，每棵种苗加入菌液l～2ml，保证每棵种苗的接菌量达到1.0×10⁹个以上。大约四周后检查结瘤情况，结瘤则为根瘤菌。 

本发明还有一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY5制备得到的菌剂。将保存的菌活化于平板上，待平板上最后一笔菌长出来后将菌洗入液体YMA液体培养基中进行摇菌(28±1℃、180转/分钟)得到的菌悬液(含菌量大于1.0×10⁹个)拌种、直接回接到植物根部或拌土。也可以按比例混合菌体吸附材料制成菌剂使用，所述菌体吸附材料优选草炭、蛭石或珍珠岩等；所述比例优选10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。 

本发明还有一个目的是提供柱花草接种所述根瘤固氮菌株系RY5菌的方法。所述根瘤固氮菌株系RY5菌通过摇菌制备得到液体菌剂可在播种前用菌液浸种、育苗前浸泡植株根部、移植后浇于柱花草根部土壤中，也可以将菌液混合菌体吸附材料例如草炭、蛭石、珍珠岩等制成菌剂移植前混施于土壤中。 

本发明的有益效果是： 

本发明提供的RY5根瘤菌在酸性条件下生长很好，并且在无菌沙培条件下施用液体菌剂能使TPRC2、TPRC5的产量是不接菌的2.4倍和3.7倍。在大田土壤条件下产量也分别是不接菌的3.1倍和2.3倍。RY5具有耐酸性和高产的品质比较适合于我国南方的酸性红壤地区。在上述地区施用RY5根瘤菌不但可以大幅度的提高柱花草产量和质量，还能改变土壤的酸性环境。 

图1根瘤菌RY5回接检验图 

图2根瘤菌RY5菌落图 

图3根瘤菌RY5革兰氏染色图片 

图4回接根菌RY5后TPRC2、TPRC5两个品种柱花草生长情况 

图5RY5琼脂糖凝胶电泳图 

图6NCBI比对图 

图7RY5根瘤菌聚类分析图 

图8回接RY5TPRC2、TPRC5鲜重图 

图9回接RY5TPRC2、TPRC5干重图 

图10RY5根瘤菌在不同酸性条件下的生长曲线 

图11施用RY5草炭菌剂后TPRC2、TPRC5干重图 

图12RY5在不同盐浓度中的生长情况 

下面结合具体实施例和附图进一步详细说明本发明。 

实例1根瘤菌RY5的获得和培养 

本发明人于2009年2月于广西柳州百棚畜牧场(N＝24°06.120′，E＝109°18.00′，H＝125m)采集到一株经严冬后仍然存活的柱花草根瘤。剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存。经分离及纯化得到一种慢生根瘤菌株RY5(Bradyrhizobium sp.)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209269。 

(1)从冰袋中取出柱花草的根系在自来水下冲洗2～3遍将根系冲洗干净，用剪刀将新鲜完整、颜色暗红的根瘤带2mm的根剪下于培养皿中用2级水将表面冲洗干净；此过程要确保根瘤表面的完整。 

(2)将冲洗干净的根瘤转移到灭菌后的培养皿中，加入95％的酒精浸泡5分钟后，将酒精倒出，用无菌水冲洗4～5次，加入0.1％(质量体积浓度，0.1g HgCl₂/100ml水)的HgCl₂溶液灭菌2～3分钟，迅速将HgCl₂倒出并加入无菌水，转移进超净工作台操作，用无菌水冲洗6遍以上，将无菌水倒出，选取根瘤转移至灭菌后的培养皿中(可在火焰上灭菌)，用灭菌后的镊子和接种环将根瘤捣碎，蘸取乳白色汁液在准备好的YMA固体培养基上划线。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(28±1℃、黑暗)中培养。YMA培养基配方如表1： 

表1YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基配方(L^-1) 

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度。 

在培养过程中从以下三点来确定是否为根瘤菌： 

a.菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白色不透明点状物后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。 

b.菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含 

-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对。 

C.通过将分离出的根瘤菌在无菌条件下回接到柱花草上，能结瘤的则为根瘤菌。 

根瘤菌RY5的形态特征： 

根瘤菌RY5为慢生根瘤菌属的一种，培养50个小时后沿第一笔涂布的痕迹开始有水样带状半透明的突起，到第4天以后突起开始明显并逐渐独立成为单独的菌落，第5天后最后一笔出现1.0～2.0mm的菌落圆形，边缘完整，表面光滑，凸起水珠状，无色透明度极高，粘性分泌物较少。见附图2所示RY5根瘤菌菌落。 

RY5号的最适生长条件为：温度28℃，pH＝4.8～6.0，转速180r/min.能够广泛的应用碳原和氮原，在各种植物来源的综合抽提液上能很好的生长，在YMA培养基上比在蛋白胨培养基上生长好。 

根瘤菌RY5的生理特性： 

根瘤菌RY5经革兰氏染色在显微镜下呈紫色，形状为小短杆状体，大 小为0.5～0.9μm×1.2～3.0μm，细胞单个或成对，常可见成群排列。为革兰氏阴性菌。见附图3所示根瘤菌RY5革兰氏染色图片。 

(4)排除非根瘤菌菌落后根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色不一致的菌落挑出在新的培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。 

(5)回接验证柱花草根瘤菌 

a.菌液的准备 

将分离纯化出来的根瘤RY5用无菌水洗入准备好的液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于0.6时(即每ML菌液含菌量多于1.0×10⁹个)即得菌液，可用于回接。所述液体YMA培养基是在表1的培养基中将琼脂除去，并调节PH值为7。 

b.无菌种苗的准备 

精选柱花草种子数粒在95％的乙醇中浸泡5分钟，取出后在0.1％的HgCl₂中处理5分钟，用无菌水冲洗5～10遍，然后排在灭过菌、放好发芽纸的培养皿中，用灭过菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽3天。待苗长到4厘米时候把苗移入准备好的灭过菌的沙培箱中，待用。 

c.回接 

从沙培箱中选取壮实的苗放到培养皿中用步骤(5)a制备得到的菌液浸泡15分钟，用镊子将种苗栽种在装满灭菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形状栽植4株，每棵种苗加入菌液1～2ml，保证每裸种苗的接菌量达到1.0×10⁹个以上。大约四周后拔起苗查看是否结瘤，结瘤则为根瘤菌。根瘤RY5经回接检验后结瘤明显，可证明分离物为纯的根瘤菌。见附图1所示根瘤菌RY5回接检验结果。 

实施例2根瘤菌RY5的16S rDNA序列测序及类别的确定 

为了确定根瘤菌RY5的***发育地位，对所分离得到的菌株的16SDNA系列进行测序。首先利用omega公司的试剂盒进行总DNA的提取(此方法不是常规的方法，用试剂盒提取是一种高效、便捷的方法，但和常规方法相比成本有点稍高)，然后利用引物进行PCR特异性扩增。 

上游引物35fc：CTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAAC； 

下游引物1492r：TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。 

反应条件如下： 

PCR反应 

Primer：35fc，1492r 

PCR recipe： 

PCR procedure 

扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验结果见附图5所示RY5琼脂糖凝胶电泳图，送北京奥科生物技术公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO 1所示。 

将所得的序列结果在美国美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现根瘤菌菌株RY5与已知菌株AY628222Bradyrhizobium SP.PAV40相似性达99％，见附图6所示NCBI比对图。应用软件DNAStar和TREECONW对所测的菌株进行聚类，见附图7所示RY5根瘤菌聚类分析图。由比对结果和聚类图可知RY5为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新株系，命名为热研5号(RY5)。 

实施例3根瘤菌RY5的应用实验 

为了确认RY5对柱花草的作用，用两个柱花草品种(TPRC2、TPRC5)用沙培的方法将根瘤RY5回接到柱花草根部，每个处理4个重复(菌、砂和种苗的处理参见回接实验)以不接种根瘤为对照(CK)，进行回接对比。整个过程中采用低氮营养液进行浇灌。柱花草TPRC2、TPRC5回接根瘤 菌RY2后对柱花草的生理指标影响见表2和附图8、附图9。附图8和附图9中左边方柱(a)为TPRC2，左边方柱(b)为TPRC5。(附图8、9和附图11中其他方柱图为现有根瘤菌对照结果，与本发明技术没有直接关系，未做标注) 

由表2、附图8和附图9可以看出回接根瘤菌RY5后柱花草TPRC2、TPRC5的根瘤数、根瘤干重、株高、植株鲜重、和固氮酶活性都比对应的对照(CK)大幅度增加，差异达到极显著。根瘤菌RY5回接到柱花草TPRC2和TPRC5后能提高柱花草的结瘤数，使两个品种的柱花草都能达到高产。见附图4回接根菌RY5后的结瘤情况。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的群体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用。 

表2根瘤菌RY5回接到TPRC2、TPRC5后对柱花草生理指标的影响 

实施例4根瘤菌RY5菌剂及应用 

所述菌剂是将保存的菌活化后在液体YMA培养基中摇菌，待菌液浓度达到1×10⁹个/ml时即可用以制作菌剂施用。将刚摇出的菌用无菌水稀释或直接用来浸泡柱花草种子60分钟，对于移苗种植的柱花草将无菌条件下育出的苗在种植前将根部在上述菌液中浸泡30分钟以上，亦可将苗种植于大田中后往苗根部土壤中浇上述菌液(每株苗根部浇5～10ml)。也 可以按比例混合菌体吸附材料制成菌剂于播种或移植前混施于土壤中。所述菌体吸附材料优选草炭、蛭石或珍珠岩等；所述比例优选10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。 

RY5草炭菌剂施用于土壤中对柱花草产量的影响： 

如前述沙培准备无菌种子和育苗.将根瘤菌从固体培养基上吸入三角瓶中28℃培养96小时，用无菌水洗脱菌体，并用无菌水稀释，用漩涡打旋器均匀菌体，测定OD值(入＝600nm)，保证田间接种时每粒种子的含菌量大于10⁹个。将草炭粉碎(过2mm筛孔)后在121℃灭菌40分钟后冷却备用。在播种前将不同菌液按10ml菌液：50g草炭的比例倒入草炭中，并充分混合让草炭吸收菌液。育苗前将混合好的菌剂混施于土壤中。小区面积为20m²，设四个重复。三个月后收样，其单株产量结果如附图11。附图11中左边方柱(a)为TPRC2，左边方柱(b)为TPRC5。在大田栽培柱花草中，施用RY5根瘤菌菌剂后使TPRC2和TPRC5的产量是不接根瘤菌(CK)的产量的3.1倍和2.1倍。 

实施例5根瘤菌RY5的对土壤的适应实验 

根瘤菌、土壤环境和植株是一个相互作用的一个体系，只有将三者统一起来综合考虑才能达到真正的高产及高效。为了确定RY5对土壤主要影响因素(酸碱性、及盐碱性)的适应情况，通过如下方法确定柱花草的耐酸、耐盐性。为今后更加科学合理地使用RY5柱花草根瘤菌提供优选的技术支持。 

将菌株RY5活化后，洗入YMA液体培养基中，于恒温摇床(28±1℃、180r/min)下培养，待OD₆₀₀约为1，分别吸取50μl菌悬液接 种到pH值为4、4.5、4.8、5、5.5、6、7(体积为50ml)YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28士1℃180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD₆₀₀。每个处理3个重复。RY5在PH值为4.5～6的环境中能较快的生长形成有效菌液，特别是在PH值为4.5生长最好。见附图10RY5在不同PH值条件下的生长曲线图。在菌的生长过程中能很快的提高菌液的PH值；故RY5施用于我国的南方酸性红壤中有使柱花草增产和改善土壤酸性的双重功效。根瘤菌RY5回接到柱花草TPRC2和TPRC5后能提高柱花草的结瘤数，使两个品种的柱花草都能达到高产。见附图4回接根菌RY5后的结瘤情况。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的群体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用。 

耐盐抗性实验采用添加NaCl的YMA液体培养基培养根瘤菌，3天后用分光光度计测定菌液的OD值，OD值的大小可以反映菌生长快慢的情况。各菌株经活化后，接种于YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD₆₀₀约为1，分别吸取50μl菌悬液接种到NaCl浓度为0、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L YMA液体培养基中(pH值为5.5、体积为50ml)，置恒温振荡器中28士1℃180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD₆₀₀。每个处理3个重复。RY5在不同盐浓度中的生长情况见附图12。RY5根瘤菌在土壤环境中盐浓度高于0.09mol/L时生长受到了很大的抑制，不能形成浓度大于1×10⁹ 个/ml的菌液，当溶液中的含菌量伴随溶液盐浓度的减小而增加，当盐浓度为0.05mol/L时开始可以形成浓度大于1×10⁹个/ml的有效菌液。 

SEQUENCE LISTING 

<110>刘国道，董荣书，黄艳霞 

<120>一种根瘤固氮菌株系RY5菌株及其应用 

<130> 

<160>1 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>1374 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

cttaacacat gcaagtcgag cgggcgtagc aatacgtcag cggcagacgg gtgagtaacg     60 

cgtgggaacg taccttttgg ttcggaacaa cacagggaaa cttgtgctaa taccggataa    120 

gcccttacgg ggaaagattt atcgccgaaa gatcggcccg cgtctgatta gctagttggt    180 

agggtaatgg cctaccaagg cgacgatcag tagctggtct gagaggatga tcagccacat    240 

tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg    300 

ggggcaaccc tgatccagcc atgccgcgtg agtgatgaag gccctagggt tgtaaagctc    360 

ttttgtgcgg gaagataatg acggtaccgc aagaataagc cccggctaac ttcgtgccag    420 

cagccgcggt aatacgaagg gggctagcgt tgctcggaat cactgggcgt aaagggtgcg    480 

taggcgggtc tttaagtcag gggtgaaatc ctggagctca actccagaac tgcctttgat    540 

actgaagatc ttgagtccgg gagaggtgag tggaactgcg agtgtagagg tgaaattcgt    600 

agatattcgc aagaacacca gtggcgaagg cggctcactg gcccggtact gacgctgagg    660 

cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg    720 

aatgccagcc gttagtgggt ttactcacta gtggcgcagc taacgcttta agcattccgc    780 

ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg    840 

tggagcatgt ggtttaattc gacgcaacgc gcagaacctt accagccctt gacatgtcca    900 

ggaccggtcg cagagacgtg accttctctt cggagcctgg aacacaggtg ctgcatggct    960 

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccccgtcc   1020 

ttagttgcta ccatttagtt gagcactcta aggagactgc cggtgataag ccgcgaggaa   1080 

ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggctg ggctacacac gtgctacaat   1140 

ggcggtgaca atgggatgcg aaggggtaac ccctagcaaa tctcaaaaag ccgtctcagt   1200 

tcggattggg ctctgcaact cgagcccatg aagttggaat cgctagtaat cgtggatcag   1260 

cacgccacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt   1320 

ggttttacct gaagacggtg cgctaacccg caagggaggc agccggccac ggta         1374 

Claims (5)

1.一种慢生根瘤菌株RY5(Brabyrhizobium sp.)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M209269。

2.一种权利要求1所述慢生根瘤菌株RY5回接柱花草的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将分离纯化出来的慢生根瘤菌株RY5用无菌水洗入液体YMA培养基中，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于0.6时得菌液；

(2)将柱花草种子灭菌后排放于培养皿中灭菌的发芽纸上，用灭菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，置于28±1℃的培养箱中黑暗催芽，待苗长到4厘米时移入灭菌沙培箱中；

(3)从步骤(2)所述沙培箱中选取壮实的苗用步骤(1)制备得到的菌液浸泡后栽种，每棵种苗加入菌液1～2ml。

3.一种菌剂，其特征在于是由权利要求1所述慢生根瘤菌株RY5菌液混合菌体吸附剂制备得到。

4.根据权利要求3所述菌剂，其特征在于所述菌体吸附剂为草炭、蛭石或珍珠岩；混合比例为10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。

5.一种柱花草接种权利要求1所述慢生根瘤菌株RY5的方法，其特征在于将菌株活化、在摇床摇菌后OD大于0.6时的菌液进行拌种处理或以OD大于0.6时的菌液浇于柱花草根部土壤中或将OD大于0.6时的菌液混合菌体吸附材料制成菌剂在柱花草移植前混施于土壤中。

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