CN113736744A - 洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及一株洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN及其应用，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2021年05月13日，保藏编号为CGMCC No.22325。本发明提供的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对洋地黄毒苷具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.51ng/mL)，为检测临床上血样中洋地黄毒苷含量提供了免疫学方法。本发明提供的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测洋地黄毒苷的试剂盒，具有实际应用价值。

Description

洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及一株洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN及其应用。
背景技术
洋地黄毒苷(Digitoxin)，又称为地吉妥辛、洋地黄毒甙或狄吉妥辛，是一种口服强心苷制剂，为白色结晶性粉末，无臭，略溶于氯仿，微溶于乙醇、***，不溶于水。强心苷类药物在临床上主要用来治疗心力衰竭及心律失常，属于Na+/K+ATP酶抑制剂。洋地黄毒毒苷与Na+/K+ATP酶在细胞膜上可逆性结合，抑制钠离子和钾离子的主动转运，使得细胞内钠离子浓度增加，这又促进钠离子和钙离子交换，提高了细胞中的钙离子浓度。钙离子对心脏兴奋收缩有重要作用，这就是洋地黄毒苷发挥强心作用的基础。由于洋地黄毒苷作用慢而持久，一般适用于慢性心功能不全患者，尤其是肾功能不全者应选用洋地黄毒苷，而不是地高辛。洋地黄毒苷也存在许多缺点，如在人体内容易累积，治疗量和中毒量之间相差很小，病人的敏感性及耐受性存在很大的个体差异。医生应结合患者的洋地黄毒苷血药浓度测定和临床症状及时调整洋地黄毒苷的用量。因此，有必要建立快速、高效的洋地黄毒苷的监测方法。
洋地黄毒苷的检测方法通常为高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的洋地黄毒苷检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为洋地黄毒苷检测提供了一种新的检测途径。
发明内容
本发明的目的是提供洋地黄毒苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对洋地黄毒苷具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立洋地黄毒苷的免疫学检测方法。
按照本发明的技术方案，所述洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2021年05月13日，保藏编号为CGMCC No.22325。
本发明的第二方面提供了上述洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN的制备方法，包括以下步骤，
S1：将洋地黄毒苷与载体蛋白偶联得到免疫原；
S2：将所述免疫原与弗氏佐剂混合乳化，对小鼠进行皮下免疫，筛选出血清中洋地黄毒苷抗体含量高的获得免疫的小鼠；
S3：将步骤S2筛选出的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，得到所述洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN。
进一步的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)得到的免疫原分别为洋地黄毒苷-BSA和洋地黄毒苷-KLH。
进一步的，所述步骤S1的具体操作如下，
SS1：将洋地黄毒苷溶于溶剂中，依次加入高碘酸钠和乙二醇并搅拌，得到混合液；
SS2：将所述混合液加入载体蛋白中，调节pH为9-10；
SS3：加入硼氢化钠，反应制得所述免疫原。
进一步的，所述步骤SS1中，洋地黄毒苷与高碘酸钠的摩尔比为1：3-4，洋地黄毒苷与乙二醇的摩尔比为1：2-3。
进一步的，所述溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
进一步的，载体蛋白为BSA时，洋地黄毒苷与载体蛋的摩尔比为30-90：1；载体蛋白为KLH时，洋地黄毒苷与载体蛋的摩尔比为3000-9000：1。
进一步的，所述步骤SS2中，通过加入K2CO3溶液或Na2CO3溶液调节pH为8-10。
进一步的，所述步骤SS3中，加入硼氢化钠溶液进行还原反应，加入甲酸或盐酸调节调节pH为6-7，静置，再加入氨水或NaOH溶液调节pH为8-9，制得所述免疫原。
进一步的，所述步骤S2中，首次免疫采用免疫原与完全弗氏佐剂混合乳化，多次加强免疫采用免疫原与不完全弗氏佐剂混合乳化，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射进行冲刺免疫。
具体的，首次免疫剂量为100μg/只；多次加强免疫剂量为50μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天；冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。
所述步骤S3中，通过聚乙二醇(PEG 4000)法将步骤S2筛选出的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过选择性培养基(HAT培养基)培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的第三方面提供了一种洋地黄毒苷单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCCNo.22325的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN分泌产生。
本发明的第四方面提供了上述洋地黄毒苷单克隆抗体在洋地黄毒苷检测中的应用。
具体的，可以用于临床血样中洋地黄毒苷浓度的监测。
本发明还提供了一种检测洋地黄毒苷的试剂盒，包括上述的洋地黄毒苷单克隆抗体；以及，一种检测洋地黄毒苷的试剂盒，包括上述的洋地黄毒苷单克隆抗体。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明提供的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对洋地黄毒苷具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.51ng/mL)，为检测临床上血样中洋地黄毒苷含量提供了免疫学方法。本发明提供的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测洋地黄毒苷的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料保藏：一株洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号为CGMCC No.22325。
附图说明
图1为洋地黄毒苷单克隆抗体对洋地黄毒苷的抑制标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中溶液配制如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20；
PBST：含0.05％Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
实施例1杂交瘤细胞株FJN的制备
(1)免疫原洋地黄毒苷-BSA的制备：
称取21.4mg洋地黄毒苷，溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入0.1M高碘酸钠(NaIO4)溶液1mL，室温搅拌1h；加入1M乙二醇60μL，继续搅拌5min；将上述混合反应液逐滴加入28mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液中，通过5％碳酸钾(K2CO3)调节pH至9，继续搅拌1h至pH稳定；称取15mg硼氢化钠(NaBH4)，溶于水后加入上述反应液中反应16h；加入1M甲酸，调节pH至6.5，室温放置1h；加入氨水(NH4OH)，调节pH至8.5；将上述反应液透析24h；透析后，0.1M盐酸(HCl)调节pH至5，沉淀于室温静置1h，4℃静置3h；12000rpm离心8min，沉淀用碳酸氢钠(NaHCO3)溶解，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原洋地黄毒苷-BSA。
(2)包被原洋地黄毒苷-OVA的制备：
称取21.4mg洋地黄毒苷，溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入0.1M高碘酸钠(NaIO4)溶液1mL，室温搅拌1h；加入1M乙二醇60μL，继续搅拌5min；将上述混合反应液逐滴加入28mg/mL鸡卵白蛋白(OVA)溶液中，通过5％碳酸钾(K2CO3)调节pH至9，继续搅拌1h至pH稳定；称取15mg硼氢化钠(NaBH4)，溶于水后加入上述反应液中反应16h；加入1M甲酸，调节pH至6.5，室温放置1h；加入氨水(NH4OH)，调节pH至8.5；将上述反应液透析24h；透析后，0.1M盐酸(HCl)调节pH至5，沉淀于室温静置1h，4℃静置3h；12000rpm离心8min，沉淀用碳酸氢钠(NaHCO3)溶解，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原洋地黄毒苷-OVA。
(3)动物免疫：选择健康的6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。洋地黄毒苷完全抗原(免疫原洋地黄毒苷-BSA)与等体积弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射(不含佐剂)进行冲刺免疫，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠。
(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，细胞轻轻敲散，重悬于含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640培养基中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用洋地黄毒苷为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对洋地黄毒苷标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株FJN。
(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例2洋地黄毒苷单克隆抗体的IC50的测定
(1)包被：将包被原洋地黄毒苷-OVA用0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD(450nm)值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体洋地黄毒苷的IC50为0.51ng/mL，说明对洋地黄毒苷有很好的灵敏度，可用于洋地黄毒苷免疫分析检测。
分别测定洋地黄毒苷单克隆抗体对洋地黄毒苷、地高辛、乙酰洋地黄毒苷和哇巴因的交叉反应，结果如表1所示：
表1单克隆抗体4B12的特异性
Figure BDA0003304376750000071
Figure BDA0003304376750000081
注：交叉反应率(Cross-reactivity，CR)＝洋地黄毒苷的IC50/结构类似物的IC50*100％。
结果表明，洋地黄毒苷单克隆抗体对地高辛、乙酰洋地黄毒苷和哇巴因的交叉反应率极低，因此，本发明制备的抗体对洋地黄毒苷具有较好的特异性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2021年05月13日，保藏编号为CGMCCNo.22325。
2.一种如权利要求1所述的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：将洋地黄毒苷与载体蛋白偶联得到免疫原；
S2：将所述免疫原与弗氏佐剂混合乳化，对小鼠进行皮下免疫，筛选出血清中洋地黄毒苷抗体含量高的获得免疫的小鼠；
S3：将步骤S2筛选出的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，得到所述洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体操作如下，
SS1：将洋地黄毒苷溶于溶剂中，依次加入高碘酸钠和乙二醇并搅拌，得到混合液；
SS2：将所述混合液加入载体蛋白中，调节pH为9-10；
SS3：加入硼氢化钠，反应制得所述免疫原。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤SS1中，洋地黄毒苷与高碘酸钠的摩尔比为1：3-4，洋地黄毒苷与乙二醇的摩尔比为1：2-3。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，首次免疫采用免疫原与完全弗氏佐剂混合乳化，多次加强免疫采用免疫原与不完全弗氏佐剂混合乳化，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射进行冲刺免疫。
7.一种洋地黄毒苷单克隆抗体，其特征在于，由所述保藏编号为CGMCCNo.22325的洋地黄毒苷单克隆抗体杂交瘤细胞株FJN分泌产生。
8.如权利要求7所述的洋地黄毒苷单克隆抗体在洋地黄毒苷检测中的应用。
9.一种检测洋地黄毒苷的组合物，其特征在于，包括如权利要求7所述的洋地黄毒苷单克隆抗体。
10.一种检测洋地黄毒苷的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述的洋地黄毒苷单克隆抗体。
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