CN116396392B - 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用 - Google Patents
一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新的单克隆抗体、该抗体的制备方法、及其用于免疫检测的相关应用。本发明的单克隆抗体能够高灵敏度且高特异性地针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷(地高辛),使其不仅能够用于经DIG标记的目标分子如核酸分子的检测,也能够用于药物分子地高辛的检测,并由此能够有助于判断地高辛中毒及指导临床用药,对保证地高辛的治疗有效性及安全性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,具体地涉及一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷(地高辛)的单克隆抗体、其制备方法及其用于免疫检测的相关应用。
背景技术
异羟基洋地黄毒甙元,即Digoxigenin(DIG),是一种类固醇半抗原分子,可用于标记核酸和检测***,DIG标记的核酸探针危害性较小,保质期长,具有比放射性探针更高的灵敏度,可以更快地进行检测。
DIG可以与DIG抗体组成半抗原-抗半抗原检测***,检测灵敏度高,且由于哺乳动物细胞中不含有内源性DIG及DIG结合蛋白,DIG标记的核酸探针不会发生非特异性结合,该检测***具有很高的特异性,已为人们所接受,得到广泛的应用。
因此,高特异性和高灵敏度的针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)的抗体是本领域的持续需求。
发明内容
如前所述,本领域需要一种高亲和力、高特异性和高灵敏度的针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)的抗体。
本发明人通过将异羟基洋地黄毒甙元(DIG)与大分子载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)偶联后作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选出抗体效价大于1000K的杂交瘤细胞株,获得了具有高亲和力、高灵敏度和高特异性的单克隆抗体。由此,实现了本发明。
在第一方面,本发明提供了一种单克隆抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在第二方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码本发明第一方面的单克隆抗体。
在第三方面,本发明提供了一种载体,其包含本发明第二方面的核酸分子。
在第四方面,本发明提供了一种表达细胞,其包含本发明第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
在第五方面,本发明提供了一种检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)的方法,包括使用本发明第一方面所述的单克隆抗体的步骤。
在第六方面,本发明提供了一种检测异羟基洋地黄苷(地高辛)的方法,所述方法用于非诊断目的或者诊断目的,包括使用本发明第一方面所述的单克隆抗体的步骤。
在第七方面,本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体在制备用于检测异羟基洋地黄毒甙元或地高辛的试剂中的用途。
在第八方面,本发明提供了一种用于检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷(地高辛)的试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的单克隆抗体以及用于指导如何使用所述单克隆抗体进行检测的说明书。
本发明提供了一种单克隆抗体,其表现出针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)和异羟基洋地黄苷(地高辛)的高亲和力、高灵敏度和高特异性,能够用于检测样品中存在的DIG或地高辛。因此,一方面,本发明的单克隆抗体能够与DIG特异性结合,并由此能够用于直接地检测DIG自身或者经由DIG标记的核酸探针,或者用于间接地检测能够与经由DIG标记的核酸探针特异性相互作用的目标核酸分子。另一方面,本发明的单克隆抗体能够用于测定血清中的地高辛浓度,有助于判断地高辛中毒及指导临床用药,对保证地高辛的治疗有效性及安全性具有重要意义。本发明的单克隆抗体及其相关检测方法用于核酸检测时具有高特异性、低危害性、且保质期长,具有比放射性探针更高的灵敏度,可以更快地进行检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的单克隆抗体DIG2H1的竞争抑制曲线。
图2示出了本发明的单克隆抗体DIG2H1-C的竞争抑制曲线。
具体实施方式
在下文中,将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解,以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明,而无意于对本发明的范围进行限制,本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且,本领域技术人员理解,在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前,提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中,例如浓度范围、百分比范围或比率范围,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且此类实施方案也包括在所述主题内,受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中,排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中,很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述,表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外,还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外,在本文中,表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述,表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤,而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时,该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围,除非另外指出,否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此,除非相反地指出,否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值,其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少,每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用,术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫***的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链,其可变区各自包含三个CDR,即CDR1、CDR2和CDR3。因此,各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义:Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991));Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987;196:901-917;Chothia et al.,Nature 1989;342:878-883;Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009;38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同***不同地限定,Kabat***不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号***,还提供了限定3个CDR的精确残基边界,这些CDR被称为Kabat CDR;Chothia发现Kabat***CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性,但具有几乎相同的肽主链构象,这些亚部分被称为Chothia CDR,Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述,CDR边界定义可能不严格遵守上述***,例如AbM定义。在本文中,可以根据这些***中任何一种限定的CDR,尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号***来定义CDR。
如本文中所使用,术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子是免疫球蛋白,无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还包括具有抗体结构结合域的所有多肽或蛋白质,具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子,以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975;256(5517):495),但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所使用的,术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同,也可以不完全相同。例如,可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达,由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体,也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达,由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体,例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如前所述,本发明旨在提供一种具有高亲和力、高灵敏度和高特异性的针对异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷(地高辛)的单克隆抗体。
DIG作为一种小分子半抗原,自身并不能产生良好的免疫反应性,因此需要将其与大分子载体蛋白偶联后才能诱导动物产生免疫应答。DIG可以与任何载体蛋白进行偶联,包括但不限于血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、卵圆蛋白OVA或人血清白蛋白HSA。可以通过免疫合适的宿主(例如,脊椎动物,包括人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼、两栖动物,及鸟、爬行动物和鱼的卵)产生相应的抗DIG抗体。可以用本领域已知的任何方法免疫动物,用于免疫非人动物如小鼠、大鼠、兔等的方法是本领域公知的。
因此,在第一方面,本发明提供了一种单克隆抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中,所述抗体包括至少六个CDR。
在一些优选的实施方案中,所述抗体包括:
1)重链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,优选95%以上一致性的序列;
2)轻链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,优选95%以上一致性的序列。
在一个具体的实施方案中,所述抗体可以为选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、二硫键稳定的双功能抗体、scFv、scFv二聚体、多特异性抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体中的任一种。
在一些实施方案中,所述抗体可以为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言,可以使用任何框架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列,也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸替换、缺失、添加和/或***等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分,其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
在一些实施方案中,所述抗体还包括恒定区序列,例如选自IgG、lgA、IgM、IgE、IgD中任何一种的恒定区序列,本领域技术人员能够基于需要对其进行选择,本文对此并无特别限定。此外,所述恒定区序列的种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类,但不限于此。
尽管本发明单克隆抗体是通过采用DIG与载体蛋白的偶联物免疫小鼠获得的,但是需要注意的是,DIG是地高辛的类固醇苷元,两者具有部分相同的环状结构,本发明抗体不仅对DIG具有高的特异性,对于地高辛也具有高的特异性。
本发明的单克隆抗体表现出对与DIG和地高辛的高亲和力、高特异性和高灵敏度。本文使用术语IC50表示抑制率为50%时与包被的DIG竞争结合本发明的抗体的竞争物(即,游离的DIG)的浓度,该浓度表征了本发明的抗体与DIG的结合亲和力。可以利用本领域已知的任何方法如竞争性ELISA方法测量这种抑制的IC50。在一个实施方案中,本发明的单克隆抗体DIG2H1对DIG的IC50仅为0.34ppb,对地高辛的IC50为0.351ppb。
在第二方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码本发明第一方面的单克隆抗体。
对于本领域技术人员而言,在知晓某种蛋白例如本发明的单克隆抗体的氨基酸序列的情况下,确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外,为了通过重组方式获得单克隆重组抗体,可以将所述核酸分子克隆到表达载体中,并将该表达载体进一步导入宿主细胞中,以利用该宿主细胞来表达该抗体蛋白。
在第三方面,本发明提供了一种载体,其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个具体的实施方案中,所述载体可以为质粒载体,例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个更具体的实施方案中,所述载体可以是pCDNA3.1。
在第四方面,本发明提供了一种表达细胞,其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
如前所述,本发明人将DIG与大分子载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)偶联后作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答,再利用杂交瘤技术获得能够分泌抗DIG单抗的杂交瘤细胞株,经筛选得到具有高亲和力、高灵敏度和高特异性的单克隆抗DIG抗体。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后,可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA,并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区),然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中,由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。利用单克隆及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子,这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加框架区。
在一个实施方案中,所述表达细胞可以为原生动物细胞、植物细胞、动物细胞或真菌细胞。所述动物细胞可以是哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞、COS细胞、HEK293细胞。
在一个更具体的实施方案中,所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7,ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞,Graham et al.,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO,Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216;例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1,ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人***细胞(HELA,ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138,ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2,HB8065)、小鼠***肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等,但不限于此。
在第五方面,本发明提供了一种检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)的方法,包括使用第一方面所述的单克隆抗体的步骤。
在一个具体的实施方案中,本发明的单克隆抗体由可检测物质直接或间接地标记。在本文中,“可检测物质”可以是可显示信号指示剂。本领域技术人员知晓,通过对可显示信号指示剂的信号进行检测,可以实现对目标分子的检测。这样的检测可以通过例如免疫层析法如蛋白质印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法、放射免疫分析(RIA)或原位杂交中的任一种或几种来进行。
在一个优选的实施方案中,所述可检测物质包括胶体金、酶、荧光物质、发光物质或放射性物质。
在一个更优选的实施方案中,所述酶可以是催化底物显色的酶,例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶,但不限于此;所述荧光物质可以包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白,但不限于此;所述发光物质可以是化学发光试剂,例如氨基苯二酰肼,但不限于此;所述放射性物质可以包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm,但不限于此。
本发明方法检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG),不仅指检测DIG自身,还指检测经DIG标记的目标分子如核酸扩增产物,或者指与经DIG标记的核酸探针联合检测能够与该核酸探针发生特异性相互作用的核酸分子。
DIG是灵敏度高的非放射性核酸标记物,可用于标记目标分子,例如,核酸扩增产物、核酸探针等。经DIG标记的核酸探针危害性较小,保质期长,具有比放射性探针更高的灵敏度,可以更快地进行检测。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险,相比荧光则不需要特殊检测设备,相比生物素则没有样本内源干扰之苦,很适合用于核酸的非放射性标记检测。并且,由于哺乳动物细胞中不含有内源性DIG及DIG结合蛋白,DIG标记的核酸探针不会发生非特异性结合。因此,该检测***具有很高的特异性和灵敏度,已得到广泛的应用。
一个示例性的实施方案中,DIG与脱氧尿苷三磷酸(dUTP)连接,形成DIG-11-dUTP,从而对DNA或RNA进行标记。标记可以通过本领域熟知的方法进行,例如通过随机引物法、PCR法及切口平移法将DIG-11-dUTP掺入到DNA扩增产物或探针中。又例如,使用RNA聚合酶,通过转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。又例如,通过末端转移酶催化,在3'末端标记、5'末端标记以及在3'端加上DIG-11-dUTP尾巴等方法标记寡核苷酸探针。
由可检测物质标记的DIG抗体由此可以对标记有DIG的DNA或RNA进行检测,还可以对与标记有DIG的DNA或RNA特异性结合的另外的DNA或RNA进行检测。
在一个具体的实施方案中,利用本发明方法检测经DIG标记的核酸扩增产物。更具体地,利用经DIG标记的扩增引物通过PCR法对DNA模板进行扩增,从而得到经DIG标记的扩增产物。由此得到的扩增产物由于携带有DIG,因此可以与本发明的抗体特异性相互作用,在本发明抗体经由可检测物质标记的情况下可以对扩增产物做出相应的检测。
举例来说,当使用胶体金免疫层析测试进行DNA检测时,可以用胶体金标记本发明的单克隆抗体,以链霉亲和素作为包被物,构建出双夹心层析***,对DIG和生物素双标记的扩增产物进行检测。该样品扩增引物一条带DIG标记,另一条带有生物素标记,因此扩增的产物为DIG和生物素双标记。按照免疫试纸条制备方式,组装得到胶体金检测试纸。进行检测时,通过对比比色卡读数即可获得DNA的量。
在另一个实施方案中,利用本发明方法和特异性针对目标核酸分子的经DIG标记的核酸探针来对目标核酸分子做出检测。举例来说,如上文所述,通过本领域技术将核酸探针用DIG标记,并用可检测物质对本发明抗体进行标记。在检测过程中,使该用DIG标记的核酸探针与可能包含目标核酸分子的样本相接触,使两者发生杂交反应,然后加入本发明抗体以使其与样本中核酸探针上的DIG发生特异性相互作用,再利用本发明抗体上的可检测物质来进行最终的检测。
在第六方面,本发明提供了一种用于检测异羟基洋地黄苷(地高辛)的方法,所述方法用于非诊断目的或诊断目的,包括使用第一方面所述的单克隆抗体的步骤。
地高辛(Digoxin)又称异羟基洋地黄苷,DIG是地高辛的类固醇苷元,两者具有部分相同的环状结构(方框部分所示),地高辛结构如下式所示:
地高辛是一种从洋地黄提取出的β抑制剂性的药物,被广泛用于治疗高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全的一种药物。由于地高辛的治疗指数狭窄,用药过量与用药不足时的症状相似,加之其个体差异大,故中毒的发生率高,是临床上最难掌握药物之一。目前解除地高辛毒性最有效的方法是采用抗地高辛抗体的免疫分析法监测血清/血浆地高辛浓度,提供其不同个体间生物利用度及药效学差异方面的信息,判断地高辛中毒及指导临床用药,这已成为当今治疗性药物监测的典范。
由于与DIG具有部分相同的环状结构,本发明人发现,本发明的单克隆体能够特异性结合地高辛,进而实现对地高辛的免疫检测。
本发明的单克隆抗体同样表现出对地高辛的高亲和力、高特异性和高灵敏度。例如,本发明的单克隆抗体DIG2H1对地高辛的IC50仅为0.351ppb。
在一个具体的实施方案中,所述抗体由可检测物质直接或间接地标记。本领域技术人员会知道,在本发明的抗体与地高辛特异性结合之后,通过对标记抗体的可检测物质的检测可以实现对地高辛的定量检测,进而能够监测血清/血浆中的地高辛浓度,这对于保证地高辛治疗的有效性及安全性具有重要意义。
在一个优选的实施方案中,所述可检测物质包括胶体金、酶、荧光物质、发光物质或放射性物质。
在一个更优选的实施方案中,所述酶可以是催化底物显色的酶,例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶,但不限于此;所述荧光物质可以包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白,但不限于此;所述发光物质可以是化学发光试剂,例如氨基苯二酰肼,但不限于此;所述放射性物质可以包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm,但不限于此。
在第七方面,本发明提供了第一方面所述的单克隆抗体在制备用于检测经异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的目标分子或异羟基洋地黄苷(地高辛)的试剂中的用途。
在本发明的上下文中,所述检测可以是但不限于蛋白质印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或免疫组织化学。本领域技术人员能够根据需要对检测方法进行选择,本发明对此并无特别限定。
如前所述,本发明的单克隆抗体能够高特异性和高灵敏度地结合DIG标记的核酸,进而实现核酸分子的检测。一方面,由于哺乳动物细胞中不含有内源性DIG及DIG结合蛋白,DIG标记的核酸分子不会发生非特异性结合。另一方面,DIG标记的核酸分子危害性较小,保质期长,具有比放射性探针更高的灵敏度,可以更快地进行检测。
因此,在一个优选的实施方案中,所述目标分子可以是核酸分子。
如前所述,本发明的单克隆抗体特异性结合地高辛使得能够监测血清/血浆中的地高辛浓度,对于保证地高辛作为β抑制剂药物进行心血管疾病治疗的有效性及安全性具有重要意义。
在第八方面,本发明提供了一种用于检测经异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的目标分子或异羟基洋地黄苷(地高辛)的试剂盒,所述试剂盒包括第一方面的单克隆抗体以及用于指导如何所述单克隆抗体进行检测的说明书。
在一个具体的实施方案中,所述试剂盒可以用于检测DIG标记的核酸分子。
实施例
在下述实施例中,示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明,其中采用的试验方法均为常规方法,并且如无特殊说明,下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意,本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的,无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1:单克隆抗体的制备
抗原的偶联和免疫:将DIG与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,作为免疫原(DIG-BSA),免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄,雌性BALB/c小鼠。共免疫4次,每次免疫间隔2周,免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将偶联BSA的DIG与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,背部皮下多点注射,后三次免疫将偶联BSA的DIG与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,腹腔注射。第四次免疫小鼠后7天断尾采血,分离血清,采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平,以观察免疫应答效果,选取血清抗体效价高于1∶10000的小鼠进行细胞融合实验,在细胞融合实验前3天用不加佐剂的DIG-BSA经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立:融合当天,在无菌条件下取出免疫小鼠脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合,充分混匀,在与PEG融合前,洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500,轻轻振荡,以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞,再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μl每孔铺板至96孔培养板中,并且在37℃、5%CO2条件下培养细胞。培养4-7d后,改用HT培养基进行培养,当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/10-1/5时,取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选:取OVA偶联的DIG(DIG-OVA),用包被缓冲液(0.05mol/LpH9.6 PBS)稀释,最终浓度为1μg/ml,100μl/孔加入96孔板中,4℃包被过夜,弃包被液,用PBST洗涤3次,拍干;用含3%脱脂奶的PBST封闭,150μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗涤3次,拍干;将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清,加入相应孔内,100μL/孔,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司),100μL/孔,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,拍干;加入TMB底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。在酶标仪的450nm波长下,检测酶标板所有孔OD450nm值。当阴性血清的OD450nm值≤0.1时,以测定孔(DIG-BSA)OD450nm值大于阴性孔OD450nm值2.1倍以上为阳性作为判断标准。阳性杂交瘤细胞要进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化:将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后,稀释成100个细胞/10mL培养基,将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6-7天后,显微镜下可观察到克隆细胞的形成,标记出单个克隆生长孔,取出细胞上清,进行ELISA检测(与上述融合检测相同),选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取ELISA检测OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得稳定分泌抗DIG的细胞株,命名为杂交瘤细胞株DIG2H1。
细胞上清单抗的制备与纯化:将细胞株用含15%血清的RPMI-1640培养基培养于10cm培养皿中培养,扩培至约4×107个/皿时,800rpm离心5min,弃上清并将细胞转移到2L转瓶中,加入无血清培养基,使细胞密度约为3×105个/mL,转瓶培养。继续培养1~2周后,当细胞死亡率达到80%-90%时(此时细胞密度大概为1-2×106个/mL),收取细胞悬液6000rpm高速离心20min,取上清,上清采用Protein A免疫层析法进行纯化。杂交瘤细胞DIG2H1制备的单克隆抗体记作DIG2H1;经微量分光光度计鉴定,单克隆DIG2H1抗体的浓度为2.014mg/mL。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管,浓度为1mg/mL)、保存在4-8℃。用SDS-PAGE电泳鉴定该抗体,出现51KD的抗体重链条带和26KD的抗体轻链条带。
纯度检测:用SEC-HPLC进行分析单克隆抗体,在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下,利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比,纯度达到大于98%。
实施例2:间接ELISA法检测抗体效价
在本实施例中,利用酶联免疫分析(ELISA)检测实施例1中得到的抗体的效价以进行筛选。
用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释OVA偶联的DIG,使其浓度为1μg/mL,100μL/孔加入96孔酶标板,4℃包被过夜,在自动洗板机上用PBST洗涤3次,拍干;用含3%脱脂奶粉的PBST封闭,100μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗涤3次,拍干。将抗DIG单克隆抗体,用pH7.4,0.02M的PBS缓冲液进行梯度稀释,得到不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品加入上述酶标板,100μL/孔,37℃孵育1h,洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma),100μL/孔,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,拍干;加入TMB底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值,以形成明显梯度的阳性反应的最高稀释倍数作为抗体的效价,如下表1所示。
表1:单克隆抗体的效价检测结果
由上表1可知,本发明的单克隆抗体的效价高于1000K,效价高,因此,本发明的单克隆抗体具有很好的亲和力。
实施例3:抗DIG杂交瘤细胞株抗体可变区序列的克隆和测序
从DIG2H1细胞克隆分离总RNA,通过反向转录制备cDNA克隆免疫球蛋白序列,并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取:参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书,对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录。
b.RNA反转录成为cDNA:参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录,制得cDNA,冻存于-20℃备用。
c.可变区序列的PCR扩增及回收:以上一步骤中所得cDNA为模板,以重链引物PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA;相似地,使用轻链引物PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA,将PCR产物进行回收;PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定:按照克隆载体pTOPO-Blunt Clo ning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书,将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
测序得到杂交瘤细胞株DIG2H1抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析,经分析,重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表2所示。
表2:本发明的单克隆抗体DIG2H1的重链和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号***)
另外,该抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
实施例4:重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体,通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株,并对其进行大规模培养纯化。
采用PCR方法,以反转录得到的cDNA为模板,扩增鼠单克隆抗体重轻链可变区基因(VH和VL),并经测序确定序列。对抗体的VL和VH基因,用分子克隆的方法采用质粒pCDNA3.1构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞,电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20天后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选,方法同上),筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养,进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/mL接种于滚瓶中,1L滚瓶含300mL培养基(Vega CHO),根据生产需求决定接种瓶数量,将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时,温度为37℃,二氧化碳为5%。培养7-9天后取样显微镜下观察,当细胞活率小于50%,离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体DIG2H1-C。
实施例5:单克隆抗体特异性分析
采用间接ELISA法,用1μg/mL的卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、DIG-OVA、地高辛-OVA及两种其他类固醇分别包被酶标板,100μL/孔,检测杂交瘤细胞培养上清,测定抗体与这些蛋白的交叉反应OD450nm值,判断抗体的特异性,单克隆抗体稀释倍数为1:1000K,每孔加入100μL稀释的单克隆抗体,经显色后,结果具体如下表3:
表3:本发明的单克隆抗体针对多种蛋白的交叉反应结果
表3的结果显示,本发明的单克隆抗体不仅具有特异性识别DIG的活性,也能特异性结合地高辛,并且与OVA、BSA无交叉反应,与其他类固醇(如人类***和雄激素)也没有显示出交叉反应。上述结果证明了本发明的单克隆抗体具有很高的特异性。
实施例6:竞争法ELISA法测定抗体
以竞争ELISA法进一步对筛选出的单克隆抗体进行测定,该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加单抗、加酶标抗体、显色与终止、测定OD450nm读数、数据处理。该竞争ELISA检测方法中:包被抗原为DIG-OVA,取100μL 1μg/mL的DIG-OVA加到96孔酶标板小孔中,包被过夜。然后将DIG-OVA包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05%Tween的PBS缓冲液)洗两次,加入封闭液(3%脱脂奶粉/洗液)室温封闭2小时,将封闭液倒掉,得到封闭后的酶标板;将本发明的单克隆抗体DIG2H1和DIG2H1-C做1000K稀释,得到待测样品;将待测上清样品加到封闭后的酶标板中,每孔100μL,然后加入50μL 100ppb的DIG标准品,混匀,室温孵育1小时,将上清液倒掉,用洗板机洗2次;加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,酶标抗体的稀释浓度为1:4000,每孔50μL,室温孵育1小时,用洗液洗3次,吸水纸上拍干;加入新鲜配置的100μlTMB显色反应底物,室温显色30分钟后2mol/L H2SO4终止,在波长为450nm处的吸光值A450nm。
数据处理方法:利用测定的吸光值A450nm计算出百分吸光度值(%)=(B/B0)×100%),其中B为加入竞争物DIG的检测孔的OD450nm,(B0)为未加竞争物的对照孔的OD450nm,抑制率为1-百分吸光度值。
表4:竞争ELISA法的反应结果
抗体/OD450nm | DIG2H1 | 重组抗体DIG2H1-C |
抗体+PBS(B0) | 1.092 | 1.112 |
抗体+5ppb DIG(B) | 0.135 | 0.136 |
抗体+10ppb DIG(B) | 0.098 | 0.107 |
百分吸光度值 | 10% | 9.62% |
抑制率 | 90% | 90.38% |
在间接竞争ELISA中,本发明的抗体是限量的,加入的游离标准品DIG与包被的固相抗原一起竞争,与抗体结合,固相吸附的DIG与游离DIG的加入量成反比。以梯度稀释的DIG标准品与包被抗原竞争,当加入标准品DIG浓度在10ppb附近,百分吸光度值小于10%,即抑制率>90%。
进一步通过以下步骤测定IC50:
DIG-OVA偶联物包被浓度为1μg/mL,50μl/孔,本发明的单克隆抗体按照1:1000000稀释(1ng/mL),酶标二抗按照1:4000稀释,加入梯度浓度的DIG游离小分子,0.025ng/mL至10ng/mL共十个梯度,作出竞争抑制曲线,确定出50%抑制率时所加入的竞争物DIG游离小分子的浓度,即IC50(DIG);同时在另一孔中,将DIG游离小分子替代为结构类食物的其他类固醇,也做浓度梯度,找出其半抑制浓度,即IC50(类似物)。
图1和图2示出了包被的DIG-OVA与竞争物DIG两者竞争结合本发明抗体DIG2H1和DIG2H1-C的竞争抑制曲线,竞争抑制曲线以竞争物DIG浓度(取对数)为横坐标,以加入竞争物DIG的检测孔的OD450nm(B)与未加竞争物的对照孔的OD450nm(B0)的比值(B/B0%,百分吸光度值)为纵坐标。根据所示出的竞争抑制曲线,本发明的抗DIG单克隆抗体表现出对DIG较好的特异性和检测灵敏度,DIG2H1对DIG的IC50为0.339ppb,DIG2H1-C对DIG的IC50为0.330ppb。
以DIG的IC50为基础,还测定了本发明的单克隆抗体与一些结构类似物的交叉反应率,结果如下表5所示。抗体的交叉反应率通过下式进行计算:CR(%)=IC50(DIG)/IC50(类似物),交叉反应率表示了抗体的特异性,交叉反应率值越小,则与类似物交叉反应越低,显示抗体与特异性越高。由表5的数据可知,本发明的单克隆抗体对地高辛具有较高的交叉反应率,而对于***、孕酮和雄激素则具有极低的交叉反应率,由此表明本发明的单克隆抗体对DIG和地高辛具有高度的特异性。
表5:单克隆抗体和一些结构类似物的交叉反应率
实施例7:胶体金免疫检测
在本实施例中,用胶体金标记本发明的单克隆抗体,以链霉亲和素作为包被物,构建出双夹心层析***,对DIG、生物素双标记的扩增产物进行检测。该样品扩增引物一条带DIG标记,另一条带有生物素标记,因此扩增的产物为DIG和生物素双标记。
胶体金标记抗体:取200mL超纯水,加热至沸腾,加入1mL2%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液,沸腾后立刻加1mL 2%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液,继续搅拌沸腾10分钟,得到胶体金溶液,冷却备用。取10mL上述胶体金溶液放入烧杯中,加入120μl的0.2M K2CO3调节pH至7.0;加入100μg本发明的单克隆抗体;加入0.1mL 10%BSA,搅拌并离心,弃掉上清将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB,150mM NaCl,0.2%BSA,0.1%TritonX-100,3%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1mL,作为单克隆抗体胶体金复合物。上述复合物10倍稀释后处理玻璃纤维,冻干得到金标垫。链霉亲和素(重链生物HP155-2)稀释至0.5mg/mL,用点膜仪划线到Millipore HF135002硝酸纤维素膜,干燥备用。以上述金标垫、硝酸纤维素膜组装为胶体金免疫检测试纸条,对扩增产物进行检测。
DNA扩增产物回收浓度定量到5ng/μL,通过倍比稀释设置一系列扩增产物的浓度梯度,从1ng/uL至2pg/μL,每两倍一个浓度梯度,每个测试上样量为40μL,可以计算出每个测试DNA上样量,其中,本实施例DNA扩增片段长度为200bp。
用组装的胶体金免疫检测试纸条进行检测,通过对比比色卡读数,结果如下表6所示。由表6结果可知,当DNA上样量为40ng,对应的DIG含量为0.3pmol时(对应的DIG浓度为7.5pmol/mL),通过与比色卡对比,读数为2,当DNA上样量为0.313ng,对应的DIG含量为2.4fmol(对应的DIG浓度为0.06pmol/mL),读数为8。以读数8及以上作为阳性标准,则本实施例胶体金免疫试纸条能检测到的DNA量最低为约0.3ng,对应的DIG含量为2.4fmol,即,本发明的抗体对DIG的灵敏度为0.06pmol/mL。
表6:组装的胶体金免疫检测试纸条的结果
DNA量 | 40ng | 20ng | 10ng | 5ng | 2.5ng | 1.25ng | 0.625ng | 0.313ng | 0.156ng | 0.078ng |
DIG2H1 | 2 | 3 | 4 | 4- | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | B |
DIG2H1-C | 2 | 3 | 4 | 4- | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 9- |
序列表
SEQ ID NO:1(VH CDR1):GFTFSNY
SEQ ID NO:2(VH CDR2):TSGAGY
SEQ ID NO:3(VH CDR3):EGPY
SEQ ID NO:4(VL CDR1):RSSTGAVTTSNYAT
SEQ ID NO:5(VL CDR2):GTNNRVP
SEQ ID NO:6(VL CDR3):ALWFINRSV
SEQ ID NO:7(VH):
QVKLEESGGDLVTPGGSLTISCTASGFTFSNYTMSWVRQTPDKRLEWVATITSGAGYTYYPDDLQGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGPYWGGGTLVTVSA
SEQ ID NO:8(VL):
ETVVTQESALTTSPGETVTLACRSSTGAVTTSNYATWVQENPRHLFSGVMGGTNNRVPGVPARFSGSQIGDKAALTVTGGQTEDEALYFCALWFINRSVFGGGTKLTVL。
Claims (22)
1.一种单克隆抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3;其中,所述单克隆抗体特异性针对异羟基洋地黄毒甙元或异羟基洋地黄苷。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述重链可变区包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列,所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上或95%以上一致性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体,其中所述抗体为选自Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、scFv、scFv二聚体、多特异性抗体中的任一种。
4.根据权利要求3所述的抗体,其中,所述多特异性抗体是双功能抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体,其中,所述双功能抗体是二硫键稳定的双功能抗体。
6.根据权利要求1或2所述的抗体,其中,所述抗体还包含恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗体,其中,所述恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中任一种。
8.根据权利要求6所述的抗体,其中,所述恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人。
9.一种核酸分子,其编码权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体。
10.一种载体,其包含权利要求9所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的载体,其中,所述载体为质粒载体。
12.根据权利要求11所述的载体,其中,所述质粒载体选自pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV或pBJ。
13.根据权利要求11所述的载体,其中,所述质粒载体为pCDNA3.1。
14.一种表达细胞,其包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10-13中任一项所述的载体。
15.根据权利要求14所述的表达细胞,其中,所述表达细胞为原生动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
16.根据权利要求15所述的表达细胞,其中,所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚胎肾细胞、COS细胞。
17.一种检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述单克隆抗体由可检测物质直接或间接地标记。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,所述可检测物质包括胶体金、酶、荧光物质、发光物质或放射性物质。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶;所述荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白;所述发光物质包括氨基苯二酰肼;所述放射性物质包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
21.权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体在制备用于检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷的试剂中的用途。
22.一种用于检测异羟基洋地黄毒甙元(DIG)或异羟基洋地黄苷的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体以及用于指导如何使用所述单克隆抗体进行检测的使用说明。
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AAD44898.1: immunoglobulin lambda 1 chain variable region, partial [Mus musculus];GenBank;《GenBank》;标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分 * |
AEC23218.1: immunoglobulin heavy chain V(D)J region, partial [Mus musculus];GenBank;《GenBank》;标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分 * |
An anti-digoxin monoclonal antibody seems to express more than one functional paratope;S Tyutyulkova等;《Immunobiology》;第188卷(第1-2期);第113-123页 * |
BAO57619.1: immunoglobulin light chain, V region, partial [Mus musculus];GenBank;《GenBank》;标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分 * |
Structure and specificity of the anti-digoxinantibody 40–50;Philip D. Jeffrey等;《Journal of Molecular Biology》;第248卷(第02期);第344-360页 * |
人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取;陈宇萍等;《细胞与分子免疫学杂志》;第21卷(第06期);第710-713页 * |
地高辛人工抗原的合成、鉴定与免疫效价的测定;华小黎等;《中国医院药学杂志》;第31卷(第22期);第1855-1858页 * |
地高辛单克隆抗体的研究I.分泌地高辛特异性单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及抗体特性分析;金建平等;《细胞与分子免疫学杂志》;1985年(第04期);第1-7页 * |
抗地高辛人源小分子抗体的获取;陈宇萍等;《海军总医院学报》;第19卷(第04期);第197-200页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN116396392A (zh) | 2023-07-07 |
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