CN113637653A - 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用 - Google Patents

一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113637653A
CN113637653A CN202110898705.XA CN202110898705A CN113637653A CN 113637653 A CN113637653 A CN 113637653A CN 202110898705 A CN202110898705 A CN 202110898705A CN 113637653 A CN113637653 A CN 113637653A
Authority
CN
China
Prior art keywords
est8
esterase
mutant
activity
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110898705.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113637653B (zh
Inventor
丁俊美
王晓亮
主虎杰
黄遵锡
刘艳
周峻沛
韩楠玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Normal University
Original Assignee
Yunnan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Normal University filed Critical Yunnan Normal University
Priority to CN202110898705.XA priority Critical patent/CN113637653B/zh
Publication of CN113637653A publication Critical patent/CN113637653A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113637653B publication Critical patent/CN113637653B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种活性提高的酯酶突变体Est8‑XL及其应用，所述酯酶突变体Est8‑XL氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用易错PCR和基于溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue,BTB)指示剂颜色变化的高通量筛选方法，通过三轮筛选从而获得活力提高的突变酯酶Est8‑XL。突变酯酶Est8‑XL较野生酯酶Est8对7‑氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性得到了提高，在pH9.5到10.0缓冲液中的活性和在10mM的NaCl、KCl、LiCl、CuSO4、NiSO4和ZnSO4溶液中的活性得到了提高。本发明的突变酯酶Est8‑XL可用于生物医药技术领域。

Description

一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用。
背景技术
我国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国。头孢菌素类抗生素是国内外抗生素类药物中最大的家族，因具有高效、低毒、广谱和耐β-内酰胺酶的优点，在医疗领域具有重要的作用。但由于抗生素的过度使用，面临着耐药细菌蔓延的严重问题，因此新型抗生素的发展已是大势所趋。
合成新型抗生素的中间体去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(Deacetyl-7-amino-cephalosporic acid,D-7-ACA)可在脱乙酰化酶的作用下脱去3-位上的乙酰基生成。以D-7-ACA(Deacetyl-7-amino-cephalosporic a cid,D-7-ACA)作为合成抗生素的中间体，不仅能够合成新型的抗生素，而且相比7-ACA还可以提高生产企业的经济效益。传统合成D-7-ACA的方法为化学裂解法，但存在成本高、工艺流程繁琐和环境污染等问题。新型酶法具有底物专一性，操作简便和对环境友好等优点，对生产D-7-ACA具有良好的发展前景。
酯酶广泛存在于动植物和微生物中，是一类能够催化酯水解、酯形成和酯交换的酶。微生物来源的GDSL家族酯酶没有靠近蛋白序列中部的G-x-S-x-G基序而是拥有GDSL基序，具有更灵活的催化位点，能够随着不同底物的存在和结合而改变自身的构象。现在关于GDSL家族酯酶的研究多集中于植物和动物，关于微生物来源的较少，对其催化作用机制研究还不那么完整。
申请人前期获得了来源于微生物(Bacillus sp.K91)的酯酶Est8(属于GDSL家族)，其生成的D-7-ACA能够为头孢菌素类抗生素的合成提供新型的中间体，但是该酶催化7-ACA生成D-7-ACA的活性较低。
发明内容
本发明针对上述存在对头孢菌素类抗生素新型中间体的迫切需求的问题，旨在提供一种GDSL家族脱乙酰化活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用。
为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术手段：
一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL，所述酯酶突变体Est8-XL通过嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)酯酶Est8定向突变得到，所述酯酶突变体Est8-XL氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
本申请酯酶突变体Est8-XL和野生酯酶Est8相比，对功能底物7-氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.71U/mg提高至4.47U/mg。
其中野生酯酶Est8的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在本发明的另一方面，提供了所述酯酶突变体Est8-XL的编码基因，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明另一方面，所述酯酶突变体Est8-XL通过以下方案制备得到：
1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组菌；
2)发酵培养重组菌株，诱导重组酯酶突变体Est8-XL表达；
3)回收纯化所表达的酯酶突变体Est8-XL；
4)脱乙酰化活性的测定。
在本发明的另一方面，提供了一种重组质粒和重组菌，所述重组质粒和重组菌包含所述突变体Est8-XL的编码基因。
在本发明的另一方面，提供了上述酯酶突变体Est8-XL、编码基因、重组质粒和重组菌在制备头孢菌素类抗生素中的应用。
具体为在合成新型头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7-氨基头孢烷酸中的应用。
本发明的有益技术效果为：
与野生型酯酶Est8相比，获得的突变酯酶Est8-XL的酶活和对某些金属离子的抗性发生了改变。野生型酯酶Est8的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。在pH为9.5时，野生型酯酶Est8和突变酯酶Est8-XL分别具有74.8％和86.4％的酶活，在pH为10.0时，野生型酯酶Est8和突变酯酶Est8-XL分别具有13.9％和23.6％的酶活。在10mM的NaCl、KCl、LiCl、CuSO4、NiSO4和ZnSO4中突变酯酶Est8-XL的酶活分别比野生型酯酶Est8高17.5％、19.6％、18.2％、7.2％、13.4％和10.7％。突变酯酶Est8-XL对7-ACA的脱乙酰化活性是野生型酯酶Est8的1.6倍。
附图说明
图1是本发明依赖于BTB指示剂颜色变化的高脱乙酰化活性突变体的筛选；
图2是本发明在E.coli BL21(DE3)中表达的重组酯酶Est8及突变体Est8-XL的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；1：pEASY-E2/Est8在E.coliBL21(DE3)细胞中的表达后上清；2和3：纯化的重组酯酶Est8和突变体酯酶Est8-XL；
图3是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL的pH活性；
图4是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL的pH稳定性；
图5是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL的热活性；
图6是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL的热稳定性。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实验例中的实验材料和试剂如下：
LB液体培养基：4g NaCl、4g Tryptone和2g Yeast extract用ddH2O定容至400mL。
Amp-LB固体培养基：2g Tryptone、1.5gYeast extract、2g NaCl和2％(w/v)的琼脂用ddH2O定容到200mL，灭菌后在55℃左右加入终浓度为1mM的氨苄青霉素(0.22μm滤膜过滤除菌)，混匀使用。
载体和菌株：Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株(购于北京全式金生物技术有限公司)、嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)(云南师范大学提供)、pEASY-E2表达载体(购于北京全式金生物技术有限公司)。
实施例1突变文库的构建
利用易错PCR扩增嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)菌株中的酯酶基因est8，获得突变序列。按照GeneMorphⅡEZClone Domain Mutagenesis Kit随机突变试剂盒(购于安捷伦科技有限公司)使用说明规范操作进行易错PCR。
1)Est8的突变大引物PCR
以从E.coliBL21(DE3)表达重组菌株中提取的含有基因est8的重组质粒为PCR的模板，设计引物：
上游引物est8F：5’-GCAAATCATATTTATCTTGC-3’；
下游引物est8R：5’-CCTTTCTTTGATGATCGATTC-3’。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198890020000051
Figure BDA0003198890020000061
PCR反应参数：95℃预变性5min；然后95℃变性30sec，42℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。
2)Est8的EZClone(以突变大引物PCR的产物作为引物扩增突变体)
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198890020000062
PCR反应参数：95℃预变性1min；然后95℃变性50sec，60℃退火50sec，68℃延伸12min，30个循环后37℃保温10min。
用DpnⅠ限制性内切酶对PCR产物进行处理，消化Est8质粒模板。
3)突变质粒的转化：在100μL刚好融化的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中加入5μLpEASY-E2/est8随机突变的质粒，轻轻震荡混匀；冰浴30min，于42℃水浴锅中热激45sec；冰浴7min，于超净工作台加入890μL无抗的LB液体培养基培养(37℃、180rpm、1h)；离心(7000rpm、4min)留取100μL LB悬浮菌体，并吸取涂布于含有1‰Amp的LB固体培养基上；倒置培养(37℃、16h)。
4)筛选与鉴定：从倒置培养的LB固体培养基上随机挑选5个单菌落于500μL含有Amp抗生素的LB液体培养基中培养(37℃、180rmp、3-4h)；以菌液为模版，利用通用引物T7进行PCR鉴定，PCR阳性筛选子验证，取200μL鉴定出的阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，进一步验证。
引物T7如下：
上游引物T7F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；
下游引物T7R：5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198890020000071
PCR反应参数：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃保温10min。
5)突变文库的构建：随机挑选酯酶Est8突变体的单菌落接于含有150μL液体Amp-LB的96孔细胞培养板中于37℃、200rpm培养16h；每孔加入50μL40％的甘油，混匀后-70℃保存。每个细胞培养板的A1孔以只含有pEASY-E2空载体的E.coli BL21(DE3)菌为空白对照，A2孔以野生型作为对照。
6)突变文库的诱导表达：将上述菌液转接到含有200μL液体Amp-LB的96深孔板中于37℃、190rpm，振荡培养10h；加入200μL液体Amp-LB(含1.4mM异丙基硫代半乳糖苷)，诱导表达(20℃、160rpm)；诱导10h后，离心(3000rpm、12min)，菌体用去离子水洗两次，离心后再次悬浮；在96深孔板中加20μL/孔的PopCulture Reagent细胞裂解液(默克公司)和5μL的溶菌酶，混匀后下震荡裂解细胞(25℃、10min)；离心(4℃、3000rpm、10min)，放于4℃冰箱备用。
实施例2脱乙酰化活性改良的突变体的筛选
1)初筛：对480个突变子进行筛选。
以100μL底物/孔(底物为50mM 7-ACA，0.02％BTB和pH 7.3的50mM磷酸缓冲液)的量加于96孔酶标板中；以50μL细胞裂解产物/孔的量加于96酶标板中混匀后于25℃反应10min后于616nm吸光度的酶标仪下进行OD值的检测。在此利用比色法进行突变子的筛选：由于酯酶能够催化7-ACA生成D-7-ACA和乙酸，这时溶液的pH下降，当存在0.02％BTB的指示剂时，溶液会由蓝变绿再变黄，溶液颜色越黄则表示酶的活性越高。
2)两次复筛：对初筛选出的40个突变子进行筛选
将筛选到的40个7-ACA高脱乙酰化活性的突变子挑于一块96孔板上，每个突变子设计两个重复，同时设置野生型作为对照。最终获得1个对7-ACA脱乙酰化活性高于野生型的突变子，并通过测序获得突变后位点的序列。设计显色板进行显色反应进一步验证：对照组和各实验组都设置3个重复，空白对照加入50μL ddH2O，实验组每个孔加入相应的蛋白1.1U(其中实验组Est8-G45A和Est8-K196N为针对突变体Est8-XL进行理性设计的突变体)，25℃下静置反应7min。
结果表明：突变酯酶Est8-XL对7-ACA的脱乙酰化活性比野生酯酶Est8高(图1)。
实施例3野生酶Est8和突变体Est8-XL制备
将含有野生酶Est8和突变体Est8-XL的重组菌株以1‰的接种量分别加入到含有5mL的Amp-LB液体培养基的试管中培养(37℃、180rpm)；15h后取4mL加入到400mL的Amp-LB液体培养基中培养2.5h；加入终浓度为1.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)在20℃、150rpm条件下诱导21h；利用冷冻离心机收集菌体(4℃、5000rpm、10min)；用Tris-HCl 8.0缓冲液重悬菌体后用超声波细胞破碎机破碎细胞；12000rpm、4℃条件下离心20min收集上清蛋白液；将2mL收集的上清蛋白液加到Nickel-NTAAgarose纯化柱中用含有0-500mM咪唑的梯度洗脱液进行洗脱纯化目的蛋白。
SDS-PAGE结果表明，突变酶Est8-XL和野生酶Est8都获得了纯化，产物为单一条带(2、3泳道分别为野生酶Est8和突变酶Est8-XL纯化产物的条带)(图2)。
实施例4野生酶Est8及其突变体Est8-XL的脱乙酰化活性测定
操作步骤按照BCA蛋白定量试剂盒说明书和乙酸测定试剂盒说明书规范进行。
1)将纯化后的野生型酯酶Est8和突变体酯酶Est8-XL用pH 7.0的50mM磷酸缓冲液进行超滤浓缩；利用BCA蛋白定量试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)对浓缩后的蛋白进行定量；利用乙酸测定试剂盒(Megazyme公司)进行野生型酯酶Est8和突变体酯酶Est8-XL对7-ACA脱乙酰化活性的测定。
2)吸取浓度为10mM的7-ACA底物溶液300μL与100μL稀释后的酶液混匀于25℃的水浴锅中进行酶促反应；10min后，吸取200μL反应液与乙酸测定试剂盒中的相应试剂混合，用紫外分光光度计在340nm处读数，以不加酶液的反应液作为对照。定义每分钟生成1μM的底物所需的酶量为一个酶活单位(1U/mg)。利用试剂盒测定体系中的乙酸含量即为产物的生成量，已知反应时间和酶量则通过酶活力计算公式得野生型酯酶Est8和突变体Est8-XL对7-ACA脱乙酰化活性分别为2.71U/mg和4.47U/mg。
表1重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL对功能底物7-ACA的脱乙酰化活性
Figure BDA0003198890020000101
实施例5突变酯酶Est8-XL和野生型酯酶Est8的纯化酶的性质测定
1)野生酯酶Est8及其突变体Est8-XL的pH活性和稳定性测定
最适pH的测定：在37℃水浴条件下将稀释后的酶液与提前预热5min的pH 6.5-10.0的缓冲液和乙酸-4-硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate,p-NPC2)的混合液中反应2min。pH稳定性测定：用pH 2.4-12.0的缓冲液稀释酶液，并在37℃下处理1h，然后将野生型重组酯酶Est8及其突变体Est8-XL分别在pH 8.5及40℃和35℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：50mM的Citrate-phosphate buffer(pH 2.4-6.0)、50mM的Tris-HCl(pH 7.0-9.5)和50mM的Boric acid-NaOH(pH 10.0-12.0)。
结果表明：Est8和Est8-XL的最适反应pH均为8.5(图3)，在pH 7.5时，Est8的相对酶活性比Est8-XL高16.2％(图3)；在pH为9.5时，Est8-XL的相对酶活性比Est8高11.6％，在pH为10.0时，Est8-XL的相对酶活性比Est8高9.7％(图3)。在pH 5.0-10.0之间的缓冲液中耐受1h后，野生型重组酯酶Est8和突变体酯酶Est8-XL酶活力均保持在50％以上；在pH7.0-9.0的缓冲液中耐受1h后，Est8和Est8-XL的酶活力较为稳定，均维持在80％以上在pH2.4-4.0和pH 11.0-12.0的缓冲液中处理1h后，Est8和Est8-XL的酶活力在40％以下(图4)。以上结果说明：二者均具有较好的pH稳定性。
2)野生酯酶Est8及其突变体Est8-XL的纯化酶的热活性及热稳定性测定
热活性测定：在pH 8.5的缓冲液中，于0-70℃下进行酶促反应。热稳定性测定：将稀释后的野生型酯酶Est8和突变体Est8-XL酶液均分别置于25℃、50℃和55℃下处理1h后(每隔10min测一次酶活)，在pH 8.5及40℃和35℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。
结果表明：在40℃-70℃之间突变酯酶Est8-XL的热活性比野生酯酶Est8的低(图5)，在25℃下野生酯酶Est8和突变体Est8-XL均稳定，但是在55℃时，突变体Est8-XL和野生酯酶Est8的半衰期都小于10min(图6)。
3)不同金属离子及化学试剂对野生酶Est8及其突变体Est8-XL的纯化酶活力的影响
在35℃和40℃及pH 8.5条件下，以p-NPC2为底物测定酶活性。结果表明(表2)，在含有10mM的NaCl、KCl、LiCl、CuSO4、NiSO4和ZnSO4的缓冲液中突变酯酶Est8-XL的酶活分别比野生型酯酶Est8高17.5％、19.6％、18.2％、7.2％、13.4％和10.7％。但是，10mM的FeCl3能够完全抑制突变酯酶Est8-XL的酶活；FeCl2也极大地抑制了Est8-XL的活性。其中，化学试剂SDS、DTT和CTAB对野生型酯酶Est8和突变型酯酶Est8-XL的酶活力都有很大抑制作用。
表2金属离子及化学试剂对突变体Est8-XL及野生酶Est8活力的影响
Figure BDA0003198890020000121
Figure BDA0003198890020000131
实施例6脱乙酰化活性改良的突变体的序列分析
Figure BDA0003198890020000132
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 酯酶突变体(Est8-XL)
<400> 1
Met Ala Asn His Ile Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His
20 25 30
Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val
50 55 60
Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala
65 70 75 80
Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys
85 90 95
Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His
100 105 110
Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val
115 120 125
Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala
145 150 155 160
Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile
165 170 175
Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn
180 185 190
Glu Met Ala Asn Leu Val Ala Lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro
195 200 205
Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg
210 215
<210> 2
<211> 654
<212> DNA
<213> 酯酶突变体基因(Est8-XL)
<400> 2
atggcaaatc atatttatct tgccggcgat tcgactgttc aaacgtatgg agacagcaca 60
aatcaagggg gctgggggca gtttctcggc tcgcatctgc cggagcatat tcaagtgatc 120
aacagagcga tcgcgggaag aagctcgaaa acatttgtgg aagagggcag gcttcaggca 180
atcctcgatg tgattgagcc ggatgattgg ctgttcgtgc agatgggcca taatgacgcg 240
tcaaaaaata agccggagcg ctacaccgag ccctatacta cttataaaca atatttaaag 300
cagtatatcg caggcgcgcg ggaaaaaggc gcccatccgc ttctcattac ccccgtagcc 360
cgctttcatt acgaaaacgg cgtgtttttg aacgattttc ctgattactg cattgccatg 420
aagcagacgg ctgaagagga gaatgtccag ctcattgatc tgatggagaa aagtctcgct 480
ttctttactg agaagggcga ggaaaaagtg tacacctatt ttatgatttc agaagggatt 540
aatgattaca cgcattttac aaaaaaaggc gcaaatgaaa tggcgaatct tgtggcaaaa 600
ggcataaagg agctcggcct gccattgaca gaatcgatca tcaaagaaag gtga 654
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 野生酯酶(Est8)
<400> 3
Met Ala Asn His Ile Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His
20 25 30
Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Gly Gly Arg Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val
50 55 60
Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala
65 70 75 80
Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys
85 90 95
Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His
100 105 110
Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val
115 120 125
Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala
145 150 155 160
Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile
165 170 175
Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn
180 185 190
Glu Met Ala Lys Leu Val Ala Lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro
195 200 205
Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg
210 215
<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 野生酯酶基因(Est8)
<400> 4
atggcaaatc atatttatct tgccggcgat tcgactgttc aaacgtatgg agacagcaca 60
aatcaagggg gctgggggca gtttctcggc tcgcatctgc cggagcatat tcaagtgatc 120
aacagagcga tcgggggaag aagctcgaaa acatttgtgg aagagggcag gcttcaggca 180
atcctcgatg tgattgagcc ggatgattgg ctgttcgtgc agatgggcca taatgacgcg 240
tcaaaaaata agccggagcg ctacaccgag ccctatacta cttataaaca atatttaaag 300
cagtatatcg caggcgcgcg ggaaaaaggc gcccatccgc ttctcattac ccccgtagcc 360
cgctttcatt acgaaaacgg cgtgtttttg aacgattttc ctgattactg cattgccatg 420
aagcagacgg ctgaagagga gaatgtccag ctcattgatc tgatggagaa aagtctcgct 480
ttctttactg agaagggcga ggaaaaagtg tacacctatt ttatgatttc agaagggatt 540
aatgattaca cgcattttac aaaaaaaggc gcaaatgaaa tggcgaaact tgtggcaaaa 600
ggcataaagg agctcggcct gccattgaca gaatcgatca tcaaagaaag gtga 654
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaaatcata tttatcttgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctttctttg atgatcgatt c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims (7)

1.一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL，其特征在于，所述酯酶突变体Est8-XL氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述酯酶突变体Est8-XL的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述酯酶突变体Est8-XL的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组菌；
2)发酵培养重组菌株，诱导重组酯酶突变体Est8-XL表达；
3)回收纯化所表达的酯酶突变体Est8-XL。
4.一种重组质粒，其特征在于，包含如SEQ ID NO.2所示基因。
5.一种重组菌，其特征在于，包含如SEQ ID NO.2所示基因。
6.权利要求1所述酯酶突变体Est8-XL、权利要求2所述编码基因、权利要求4所述重组质粒或权利要求5所述重组菌在制备头孢菌素类抗生素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用于合成头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7-氨基头孢烷酸。
CN202110898705.XA 2021-08-05 2021-08-05 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用 Active CN113637653B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110898705.XA CN113637653B (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110898705.XA CN113637653B (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113637653A true CN113637653A (zh) 2021-11-12
CN113637653B CN113637653B (zh) 2023-05-23

Family

ID=78419894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110898705.XA Active CN113637653B (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113637653B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637656A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993001830A1 (en) * 1991-07-22 1993-02-04 Bio-Technology General Corp. Expression of enzymatically active recombinant human acetylcholinesterase and uses thereof
WO2001030845A1 (en) * 1999-10-22 2001-05-03 American Home Products Corporation Pablo, a polypeptide that interacts with bcl-xl, and uses related thereto
US6562609B1 (en) * 1998-10-22 2003-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Cholesterol 25-hydroxylase
WO2009013611A2 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Limited Modified esterase and its applications
CN103436506A (zh) * 2013-09-18 2013-12-11 云南师范大学 一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因
CN104109659A (zh) * 2014-07-23 2014-10-22 云南师范大学 羧酸酯酶、其编码基因及其应用
CN105754886A (zh) * 2014-12-16 2016-07-13 朱奎 一株无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1及其应用
CN109750013A (zh) * 2019-03-27 2019-05-14 云南师范大学 一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用
CN109750012A (zh) * 2019-03-27 2019-05-14 云南师范大学 一种脂肪酶突变体及其应用
CN111363734A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶突变体、其组合物及应用
CN112226422A (zh) * 2020-11-04 2021-01-15 上海绅道生物科技有限公司 一种活性提高的EstWY酶突变体
CN112662655A (zh) * 2020-12-29 2021-04-16 山东金城柯瑞化学有限公司 头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法和应用
CN113637656A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993001830A1 (en) * 1991-07-22 1993-02-04 Bio-Technology General Corp. Expression of enzymatically active recombinant human acetylcholinesterase and uses thereof
US6562609B1 (en) * 1998-10-22 2003-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Cholesterol 25-hydroxylase
WO2001030845A1 (en) * 1999-10-22 2001-05-03 American Home Products Corporation Pablo, a polypeptide that interacts with bcl-xl, and uses related thereto
WO2009013611A2 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Limited Modified esterase and its applications
CN103436506A (zh) * 2013-09-18 2013-12-11 云南师范大学 一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因
CN104109659A (zh) * 2014-07-23 2014-10-22 云南师范大学 羧酸酯酶、其编码基因及其应用
CN105754886A (zh) * 2014-12-16 2016-07-13 朱奎 一株无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1及其应用
CN111363734A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶突变体、其组合物及应用
CN109750013A (zh) * 2019-03-27 2019-05-14 云南师范大学 一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用
CN109750012A (zh) * 2019-03-27 2019-05-14 云南师范大学 一种脂肪酶突变体及其应用
CN112226422A (zh) * 2020-11-04 2021-01-15 上海绅道生物科技有限公司 一种活性提高的EstWY酶突变体
CN112662655A (zh) * 2020-12-29 2021-04-16 山东金城柯瑞化学有限公司 头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法和应用
CN113637656A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEONG,D.-Y.: "Bacillus subtilis strain SRCM102745 chromosome, complete genome" *
JUNMEI DING等: "Biochemical Characterization of a GDSL-Motif Esterase from Bacillus sp. K91 with a New Putative Catalytic Mechanism" *
NCBI: "MULTISPECIES: rhamnogalacturonan acetylesterase [Bacillus]" *
TINGTING YU等: "Identification and Characterization of a New Alkaline SGNH Hydrolase from a Thermophilic Bacterium Bacillus sp. K91" *
孙锦霞;刘钟滨;: "嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶的异源表达及酶学性质研究" *
彭政;丁俊美;杨云娟;李俊俊;慕跃林;黄遵锡;: "来源于芽孢杆菌HJ14耐热酯酶的克隆表达、酶学性质及降解邻苯二甲酸二乙酯研究" *
王飞;李周坤;周杰;崔中利;: "定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响" *
邵洪伟: "碱性嗜热ＳＧＮＨ家族酯酶的异源功能研究" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637656A (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 云南师范大学 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113637653B (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ten et al. Development of a plate technique for screening of polysaccharide-degrading microorganisms by using a mixture of insoluble chromogenic substrates
Abdel-Fattah et al. Identification and over-expression of a thermostable lipase from Geobacillus thermoleovorans Toshki in Escherichia coli
Cregut et al. Compartmentalization and regulation of arylsulfatase activities in Streptomyces sp., Microbacterium sp. and Rhodococcus sp. soil isolates in response to inorganic sulfate limitation
CN112941089B (zh) 褐藻胶裂解酶突变基因、褐藻胶裂解酶突变体、含该突变体的工程菌及构建方法和应用
You et al. Characterization of a prodigiosin synthetase PigC from Serratia marcescens jx-1 and its application in prodigiosin analogue synthesis
CN102965355B (zh) 一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用
CN113637653B (zh) 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用
Gong et al. Characterization of a thermostable alkaline phosphatase from a novel species Thermus yunnanensis sp. nov. and investigation of its cobalt activation at high temperature
CN113122519A (zh) 一种耐热6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶突变体及其应用
CN113637656A (zh) 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用
CN111187764B (zh) 一种深海来源的壳聚糖酶csn5及其编码基因和应用
CN111139229B (zh) 一种新型gdsl家族脂类水解酶eii-2及其编码基因与应用
CN111057695B (zh) 一种腈水解酶及其制备方法和应用
CN114457057B (zh) 一种壳聚糖酶突变体及其应用
CN112852913A (zh) 脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用
Vu et al. Improvement of cellulase activity using error-prone rolling circle amplification and site-directed mutagenesis
CN112226422B (zh) 一种活性提高的EstWY酶突变体
CN111019921B (zh) 一种高耐受性的脂类水解酶e93及其编码基因与应用
JP4405324B2 (ja) 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法
KR20000060418A (ko) 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법
Lu et al. Cloning, expression and improvement of catalytic activity of alginate lyase by site-directed mutation
El-Sharouny et al. Isolation and characterization of two novel local psychrotolerant Kocuria spp. with high affinity towards metal cations biosorption
Sarup Singh et al. Biochemical and molecular characterization of a new aspartase producer Aeromonas media NFB-5 from effluent of a fertilizer factory
CN113073107B (zh) 一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用
KR101245304B1 (ko) 알지네이트 라이아제 활성을 가지는 메타지놈 라이브러리

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant