CN103436506A - 一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种来源于耐热芽孢杆菌（Bacillussp.）的酯酶K91Est8，本发明还提供了上述酯酶的编码基因K91Est8及其重组载体和重组菌株。本发明的酯酶具有以下性质：最适温度50℃；最适pH9.0；在37℃和50℃下保温60min，酶活分别保持在85%和40%以上；经pH9.5的硼砂-NaOH缓冲液在37℃下处理60min后，仍能保持40%以上的活性；具有良好的热稳定性和耐碱性。除乙酸-4-硝基苯酯为其最适水解底物外，还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯、己酸4-硝基苯酯和4-硝基苯基辛酸酯，可应用于农药残留或农药污染治理等方面。

Description

一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐热芽孢杆菌来源的酯酶K91 Est8及其基因。

背景技术

    酯酶（esterase, EC 3.1.1.1）是一类能够催化酯键水解和形成的酶类，广泛分布于动物、植物和微生物中（Melloney J, et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32: 261-270）。酯酶能够水解或者合成酰基链长度小于10的水溶性的甘油酯类，而脂肪酶一般以酰基链长度大于等于10个碳原子的甘油酯为底物，不过大多数脂肪酶也能水解酯酶的底物。大部分酯酶属于典型的α/β水解酶超家族，含有典型的GxSxG的保守序列，其中在S（serine）位点构成了一个serine-aspartate-histidine的催化三联体结构（Kakugawa S, et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 74: 585–591）。此外，还有一类酯酶序列中含有不同于传统GxSxG的保守序列、其含有独特的GDSL的保守序列，是一类新家族的酯酶。GDSL家族的酯酶含有5段保守序列区（five consensus sequence blocks I-V），在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser，Gly，Asn和His，因此又可以分为SGNH亚家族酯酶（John M, et al., The Journal of Biological Chemistry. 2013, 288: 2605-2613）。本发明的酯酶K91 Est8属于GDSL酯酶家族中SGNH亚家族酯酶。

酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等过程中有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos Tombo, et al.,Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51: 1833-1838）。目前已从链霉菌属（Streptomyces sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、乳杆菌属（Lactobacillus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）等微生物中克隆到酯酶基因，已经应用于食品、化工、洗涤、皮革、纸张等工业中，主要用于水解反应。此外，酯酶还被应用于制药、染料、杀虫剂和杀菌剂等工农业废水中硝基苯酚类毒性污染物的降解，在生物技术领域扮演着极其重要的角色（Jaeger K.E, et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9): 396-403）。

然而，天然菌株产酶低、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用，且从微生物中克隆到的酯酶也仍然较少，难以满足食品、化工等工业快速发展，以及环境可持续、健康发展的需求。此外，一般酯酶由于稳定性差，易失活，也限制了其广泛利用。嗜热及耐热菌来源的酯酶由于在高温和有机溶剂中很好的稳定性，不仅可以延长酯酶的使用时间，还能扩大其应用范围，已成为生物技术应用领域关注的焦点。因此，开发在高温环境下具有较高催化活力的酯酶应用于工业领域，有很好的前景和价值，也有利于研究酯酶的催化机制。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性热稳定酯酶K91 Est8。

本发明的再一目的是提供编码上述酯酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明从耐热芽孢杆菌K91基因组中克隆到酯酶基因K91 Est8，属于GDSL酯酶家族中的SGNH-serine水解酶亚家族。K91 Est8与表达载体pEASY^TM-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对其酶学性质进行了初步研究，为进一步研究酯酶 K91 Est8对农药的降解奠定了理论基础。

本发明所述酯酶K91 Est8可得自芽孢杆菌（Bacillus sp.），如Bacillus sp. ATCC 31072，K91 Est8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的酯酶K91 Est8总共含有217个氨基酸，理论分子量为24.52kDa，包含其C端的6个HIS组氨酸标签，总分子量大小约为25.35kDa。以乙酸-4-硝基苯酯（pNPC₂）为底物：最适温度50℃；最适pH 9.0；在37℃和50℃下保温1h，酶活分别保持在85%和40%以上；在pH7.5 - pH9.5的范围内处理1h后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的碱耐受性和热稳定性。

本发明提供了编码上述酯酶的基因K91 Est8，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过PCR方法克隆了热稳定性酯酶基因K91 Est8，其全长654bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比对，该酯酶基因K91 Est8编码的氨基酸序列与GeneBank中Clostridium thermocellum ATCC27405来源的酯酶（YP_001039529.1）具有最高的一致性，为61%；与Acetivibrio cellulolyticus来源的酯酶（WP_010243524.1）有55%一致性；与 Streptomyces sp. PAMC26508来源的酯酶（YP_007863706.1）有44%的一致性。说明碱性热稳定酯酶K91 Est8是一种新的酯酶。

本发明还提供了包含上述热稳定性酯酶基因K91 Est8的重组载体，优选为pEASY^TM-E2-K91 Est8。将本发明的酯酶基因与pEASY^TM-E2进行T-A连接，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY^TM-E2- K91 Est8。

本发明还提供了包含上述酯酶基因K91 Est8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/ K91 Est8。

本发明制备酯酶K91 Est8的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；

3）回收并纯化所表达的酯酶K91 Est8。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/ K91 Est8。

本发明提供了一个新的酯酶基因，其编码的酯酶以pNPC₂为底物：最适温度50℃；最适pH 9.0；在37℃和50℃下保温1h，酶活分别保持在85%和40%以上；在pH7.5 - pH9.5的范围内处理1h后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的碱耐受性和热稳定性。此外，酯酶K91 Est8也能够水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯（pNPC₄）、己酸4-硝基苯酯（pNPC₆）和4-硝基苯基辛酸酯（pNPC₈）等；可应用于农药残留或农药污染治理方面。在高温环境下具有较高催化活力的酯酶应用于工业领域，有很好的前景和价值。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组酯酶K91 Est8的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：BL21(DE3)/ K91 Est8诱导后表达的总蛋白；2：纯化前的重组酯酶K91 Est8；3：纯化后含6个HIS标签的重组酯酶K91 Est8。

图2：重组酯酶K91 Est8的最适温度。

图3：重组酯酶K91 Est8的热稳定性。

图4：重组酯酶K91 Est8的最适pH。

图5：重组酯酶K91 Est8的pH稳定性。

图6：1mM金属离子及部分化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响。

图7：10mM金属离子及部分化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响。

图8：1%和5%终浓度有机溶剂对酶活的影响。

图9：重组酯酶K91 Est8以pNPC₂ 为底物时的动力学。

具体实施方式

实验材料和试剂

1、菌株及载体：芽孢杆菌（Bacillus sp.）同文献报道菌种性质，如Bacillus sp. ATCC 31072；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3）购于Novagen公司；表达载体pEASY^TM-E2购于全式金生物有限（TransGen） 公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；坚固蓝B、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯（pNPC₄）、己酸4-硝基苯酯（pNPC₆）和4-硝基苯基辛酸酯（pNPC₈）购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。

3、培养基：

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉 0.5%，氯化钠1%，pH自然（约为7.0）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：酯酶基因K91 Est8的克隆

采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302）提取芽孢杆菌K91基因组DNA。

根据芽孢杆菌K91全基因组测序及基因注释分析酯酶基因K91 Est8并设计表达引物CarF和CarR：

上游引物CarF: 5’ -GCAAATCATATTTATCTTGC - 3’

下游引物CarR: 5’ -CCTTTCTTTG ATGATCGATT C-3’ 

上游引物T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG -3’

下游引物T7 ter: 5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

T7和T7 ter为PCR检测阳性克隆子引物。

以耐热芽孢杆菌K91基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃预变性5 min；然后95℃变性30 sec；57 ℃退火（每个循环降0.5℃）30 sec；72 ℃延伸1 min；30个循环后95℃变性30 sec；43 ℃退火30sec；72℃延伸1 min；7个循环后72 ℃保温10min。取4μL PCR产物与1μL表达载体pEASY^TM-E2进行T-A连接，25℃连接10min，连接产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37 ℃温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使用引物（本基因上游引物，T7ter）进行菌落PCR扩增筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7 ter引物测序，由北京华大基因测序完成。测序正确的阳性克隆子接种提取质粒pEASY^TM-E2-K91 Est8，取0.01uL pEASY^TM-E2-K91 Est8质粒转化到100 uL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Amp^r的LB固体平板上，37 ℃温箱过夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ K91 Est8。

实施例2：重组酯酶K91 Est8的制备

取含有重组质粒pEASY^TM-E2-K91 Est8的BL21(DE3)菌株和只含有pEASY^TM-E2的空质粒BL21(DE3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含100 ug/mL Amp^r）培养液中，37 ℃快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含100ug/mL Amp^r）培养液中，快速振荡培养约2–3 h（OD₆₀₀达到0.4-0.7）后，加入终浓度0.7 mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20 h。12000 rpm离心10 min，收集菌体。用适量的pH 7.0柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000 rpm离心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组酯酶K91 Est8的性质测定

1、重组酯酶K91 Est8的活性分析

纯化的重组酯酶K91 Est8采用对硝基苯酚法（p-nitrophenol）进行活性测定：取4只1.5mL离心管，分别编号1、2、3、4，其中1、2、3号试管为实验组（3个重复），4号为对照组。向四只离心管中分别加入420μL pH8.0的50mM Tris-HCL缓冲液和30μL 10mM底物pNPC₂，37℃预热5min后，每隔10s分别向1、2和3号管中加入50μL稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37℃反应5min后每隔10s向1、2、3实验管中加入50μL 0.1M Na₂CO₃终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取OD值。1个酶活单位（U/mL）定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPC₂生成1 μmoL对硝基苯酚所需要的酶量。以pNPC₄、pNPC₆、pNPC₈、α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同pNPC₂。

2、重组酯酶K91 Est8的最适温度和热稳定性的测定

酶的最适温度测定：将重组酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL缓冲液条件下，分别在20 ℃、30 ℃、37℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃、60 ℃、70℃、80℃、90℃、95℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定：将重组酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL缓冲液条件下，在37℃、50℃和60℃三个温度下分别保温5min、10 min、20 min、30 min和60 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC₂为底物，反应5 min，测定重组酯酶K91 Est8的酶学性质。结果表明：K91 Est8的最适温度50℃，但此酶在37℃时也具有80%以上的活性（图2）；37 ℃下保温1h后，酶活性保持在85%以上，50℃和60℃保温1h，酶活仍保持在35%以上（图3）。

3、重组酯酶K91 Est8的最适pH和 pH稳定性的测定

酶的最适pH的测定：将酯酶K91 Est8在37℃，分别在1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同pH6.5、7.0、7.5；50mM Tris-HCL缓冲液不同pH7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5；50mM硼砂-NaOH缓冲液不同pH9.5、10.0、11.0、12.0条件下进行酶促反应。pH稳定性的测定：将重组酯酶K91 Est8用pH2.0、4.0、5.0的0.1M柠檬酸-Na₂HPO₄ 缓冲液；pH6.5、7.0、7.5的1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；pH7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5的50mM Tris-HCL缓冲液；pH9.5、10.0、11.0、12.0的50mM硼砂-NaOH缓冲液稀释适当倍数后分别在37℃下耐受60 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC₂为底物，反应5 min，测定纯化的重组酯酶K91 Est8的酶学性质。结果表明：K91 Est8的最适pH为9.0（图4）；经pH7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5的50mM Tris-HCL缓冲液；pH9.5硼砂-NaOH缓冲液37℃条件下处理60min后仍然保持40%以上的活性（图5），说明重组酯酶K91 Est8具有很好的碱耐受性。

4、不同金属离子及化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响

在酶促反应体系中加入终浓度1 mM和10 mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以pNPC₂为底物，在50℃，pH9.0条件下，反应5 min，测定纯化的重组酯酶K91 Est8的酶活力。结果（图6）表明，终浓度1 mM的金属离子Co²⁺、K¹⁺、Na¹⁺、Al³⁺、Li²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺ 、终浓度1 mM化学试剂EDTA、CTAB、urea、终浓度1%的有机溶剂Tween-80、TritonX-100、ethanol、cyclohexane、n-hexane、isopropanol和终浓度5%的Tween-80对酶有较强的激活作用；Fe³⁺对酶有轻微的促进作用；1 mM的Ni²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Ag⁺、DTT、SDS，终浓度10 mM的K¹⁺、Na¹⁺、Li²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、SDS、urea，终浓度1%的DMSO、methanol和终浓度5%的DMSO、methanol、ethanol、cyclohexane、isopropanol对酶有一定的抑制作用；10 mM的Hg²⁺、CTAB、DTT和终浓度5%的TritonX-100、n-propanol对酶有较强的抑制作用（图7）；1mM的Mg²⁺、Hg²⁺、urea，10 mM的EDTA，1%的n-propanol、5%的n-hexane、n-propanol对酶几乎无影响（图8）。

5、重组酯酶K91 Est8的动力学参数的测定

在50℃，pH9.0条件下，以pNPC₂为底物，依次在酶促反应的 1-10 min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1mM-1.2mM的pNPC₂为底物（[S]），在50℃，pH9.0和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度（ν），如图9，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在50℃，pH9.0条件下，重组酯酶K91 Est8对乙酸-4-硝基苯酯（pNPC₂）的Km和Vmax分别为0.1882mM和117.647U/mg。

6、重组酯酶K91 Est8对底物pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8水解

在50℃，pH9.0条件下，重组酯酶K91 Est8对10mM的pNPC₂、pNPC₄、pNPC₆、pNPC₈的比活力分别为45.382U/mg、1.317U/mg、0.131U/mg、0.033U/mg。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>  云南师范大学

 

<120>  一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  217

<212>  PRT

<213>  芽孢杆菌（Bacillussp.）

 

<400>  1

 

Met Ala Asn His Ile Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His

            20                  25                  30         

 

 

Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Gly Gly Arg Ser

        35                  40                  45             

 

 

Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val

    50                  55                  60                 

 

 

Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys

                85                  90                  95     

 

 

Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His

            100                 105                 110        

 

 

Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val

        115                 120                 125            

 

 

Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala

    130                 135                 140                

 

 

Glu Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala

145                 150                 155                 160

 

 

Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile

                165                 170                 175    

 

 

Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn

            180                 185                 190        

 

 

Glu Met Ala Lys Leu Val Ala Lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro

        195                 200                 205            

 

 

Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg

    210                 215        

 

SEQ ID NO.2

 

<210>  2

<211>  654

<212>  DNA

<213>  芽孢杆菌（Bacillussp.）

 

<400>  2

 

atggcaaatc atatttatct tgccggcgat tcgactgttc aaacgtatgg agacagcaca       60

 

aatcaagggg gctgggggca gtttctcggc tcgcatctgc cggagcatat tcaagtgatc      120

 

aacagagcga tcgggggaag aagctcgaaa acatttgtgg aagagggcag gcttcaggca      180

 

atcctcgatg tgattgagcc ggatgattgg ctgttcgtgc agatgggcca taatgacgcg      240

 

tcaaaaaata agccggagcg ctacaccgag ccctatacta cttataaaca atatttaaag      300

 

cagtatatcg caggcgcgcg ggaaaaaggc gcccatccgc ttctcattac ccccgtagcc      360

 

cgctttcatt acgaaaacgg cgtgtttttg aacgattttc ctgattactg cattgccatg      420

 

aagcagacgg ctgaagagga gaatgtccag ctcattgatc tgatggagaa aagtctcgct      480

 

ttctttactg agaagggcga ggaaaaagtg tacacctatt ttatgatttc agaagggatt      540

 

aatgattaca cgcattttac aaaaaaaggc gcaaatgaaa tggcgaaact tgtggcaaaa      600

 

ggcataaagg agctcggcct gccattgaca gaatcgatca tcaaagaaag gtga            654

 

Claims (4)

1.一种碱性热稳定酯酶K91 Est8，其特征在于：它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的酯酶基因K91 Est8，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求2所述酯酶基因K91 Est8的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述酯酶基因K91 Est8的重组菌株。

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