CN113583141A - 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒的Nsp9蛋白进行了原核表达，其蛋白产量相当高，另外，本发明首次证明重组Nsp9的原核表达可在小鼠体内诱导活跃的体液和细胞免疫，Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度达1:64000，MBP‑Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度高达1:128000。同时证明了MBP可增强Nsp9的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的Nsp9蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。

Description

猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)主要引起仔猪严重呕吐、腹泻、脱水和死亡。2010年以来，PEDV变异株所致的腹泻在中国、美国等多个国家流行，初生仔猪的发病率和死亡率均高达100％。PEDV感染猪类造成了的严重后果，给许多国家的养猪业带来了巨大的经济损失。PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，其基因组为单股正链RNA，包括至少7个开放阅读框(ORF)，按照ORF1a/ORF1b-S-ORF3-E-M-N的顺序排列。ORF1a编码病毒多聚蛋白pp1a，pp1a蛋白被裂解成非结构蛋白nsp1～nsp16。其中，Nsp9具有结合RNA和DNA的活性，可形成二聚体，参与病毒复制，还可能具有在RNA合成中防止新生核酸被核酸酶降解的作用。但是，关于Nsp9免疫性能的研究目前尚未见报道。
发明内容
本发明首次发现Nsp9免疫小鼠可诱导体液及细胞免疫反应，MBP能增强Nsp9的免疫诱导能力，上述结果表明，PEDV的Nsp9蛋白可用于制备PEDV诊断试剂和疫苗。
本发明的技术方案为：
本发明分析了PEDV的非结构蛋白9(Nsp9)，分析了其空间结构和B细胞抗原表位，合计预测了6个B细胞抗原表位。然后，根据CV777的Nsp9序列委托公司合成,并进行密码子优化，根据优化后的密码子，设计引物，将Nsp9克隆至pET-28a载体，获得Nsp9融合表达载体pMAL-c2x-MBP-Nsp9(表达融合蛋白MBP-Nsp9)和Nsp9单独表达载体pET-28a-Nsp9。通过PCR、酶切和测序鉴定。将重组表达载体pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9，和pMAL-c2x-MBPTFF转化原核表达菌株BL21，优化诱导表达条件(温度、时间和IPTG浓度)，结果表明在32℃、1mM IPTG诱导8小时可获得较高表达的重组蛋白MBP-Nsp9。并同时表达重组蛋白Nsp9和MBPTFF。然后，利用SDS-PAGE和Western Blot检测重组蛋白的表达，Ni柱纯化表达蛋白。
将纯化的表达蛋白(MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF)分别腹腔注射免疫3～5周龄雌性BALB/c鼠，PBS溶液免疫的鼠作为阴性对照，收集小鼠血清并通过间接ELISA检测其抗体滴度。结果表明：Nsp9免疫小鼠抗体效价高达1:64000，MBP-Nsp9免疫小鼠抗体效价高达1:128000。进一步的Western blot和间接免疫荧光检测结果表明，Nsp9多克隆抗体能特异性识别重组Nsp9蛋白和PEDV感染的细胞Nsp9蛋白。qPCR检测小鼠外周血细胞因子水平，结果显示IL-1β、TNF-α、IFN-γ上调表达，IL-4和IL-10下调表达。上述结果表明Nsp9蛋白能诱导细胞免疫。总的来说，本发明结果显示Nsp9免疫小鼠可诱导体液及细胞免疫反应，MBP能增强Nsp9的免疫诱导能力。
上述PEDV的Nsp9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的有益效果为：
1、本发明发现重组Nsp9的可在小鼠体内诱导体液和细胞免疫，且MBP可增强Nsp9的免疫诱导能力，具体的，Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度达1:64000，MBP-Nsp9蛋白免疫鼠产生的Nsp9抗体滴度高达1:128000。因此，重组蛋白Nsp9和MBP-Nsp9可参与制备PEDV疫苗。MBP还可以作为Nsp9的免疫佐剂应用。
2、将MBP-Nsp9包被的ELISA和市售PEDV ELISA检测试剂盒的比较，在检测的30份样品中，MBP-Nsp9作为抗原有29份样品检测与商业化试剂盒的检测符合。符合率为96.67％。表明使用重组MBP-Nsp9为包被抗原的ELISA方法结果稳定可靠，可用于临床样品的检测。
附图说明
图1为Nsp9蛋白的B细胞抗原表位分析图。
图2为Nsp9蛋白的三维结构分析，和对应位置的B细胞抗原表位位置(圈出部分)。
图3为pMAL-c2x-MBP-Nsp9，pMAL-c2x-MBPTFF，pET-28a-Nsp9重组质粒的设计简图。
图4为pMAL-c2x-MBP-Nsp9质粒鉴定双酶切结果。
图5为pET-28a-Nsp9质粒鉴定双酶切结果。
图6为MBP-Nsp9重组蛋白表达温度的摸索，在MBP-Nsp9表达时间8h下，1mM的IPTG浓度下，摸索最合适的表达温度，设置了的梯17℃，22℃，27℃，32℃，37℃，42℃温度，结果表明32℃时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的5.33％。
图7为MBP-Nsp9重组蛋白表达时间的摸索，在MBP-Nsp9最适表达温度32℃下，1mM的IPTG浓度下，摸索最合适的表达时间，设置了2h，4h，6h，8h，10h的梯度，结果表明8h时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的7.16％。
图8为MBP-Nsp9重组蛋白表达最适IPTG浓度的摸索，在MBP-Nsp9最适表达时间下，最适表达温度下，摸索最合适的IPTG浓度，设置了的梯度IPTG 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2(mM)浓度度，结果表明IPTG浓度为1.0mM时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的7.57％。
图9为对MBP-Nsp9表达的大肠杆菌(30g/L)进行破碎和纯化的结果图。通过ImageJ分析，MBP-Nsp9在整个细菌蛋白表达水平中为15.65％，上清液中的表达水平为21.12％。图中泳道1为IPTG诱导前全菌裂解物，泳道2为IPTG诱导后全菌裂解物，泳道3为诱导后全菌破碎上清，泳道4为诱导后包涵体，泳道5为纯化得到的目的蛋白，目的蛋白占全菌蛋白含量均通过ImageJ分析得出。
图10为对Nsp9表达的大肠杆菌(30g/L)进行破碎和纯化的结果图，通过ImageJ分析，Nsp9在整个细菌蛋白表达水平中的整个细菌蛋白表达水平为5.03％，且表达在水平上清液中的总量为8.14％。图中泳道1为IPTG诱导前全菌裂解物，泳道2为IPTG诱导后全菌裂解物，泳道3为诱导后全菌破碎上清，泳道4为诱导后包涵体，泳道5为纯化得到的目的蛋白，目的蛋白占全菌蛋白含量均通过ImageJ分析得出。
图11为MBPTFF的表达和纯化结果图。图中标记“-”的泳道代表未添加IPTG、标记“+”的泳道代表添加IPTG，浓度为1mM。
图12为Western Blot检测重组蛋白MBP-Nsp9、MBPTFF结果图。
图13为Western Blot检测重组蛋白Nsp9结果图。
图14为MBP-Nsp9与不同来源的抗体反应图，左图为Western Blot检测MBP-Nsp9与MBP-Nsp9免疫后的小鼠血清反应，右图为WB检测MBP-Nsp9与猪血清反应。
图15为以纯化的MBP-Nsp9包被板子检测被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清0～10week的血清滴度对比。
图16为以纯化的Nsp9包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。
图17为以纯化的MBPTFF包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。
图18为以纯化的MBP-Nsp9包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白，Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。
图19为ELISA实验定量分析了被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠抗血清中IFN-γ的含量。
图20为间接免疫荧光法IFA测定鼠抗MBP-Nsp9血清、鼠抗Nsp9血清、鼠抗MBPTFF血清对PEDV病毒的结合情况。
图21为Western Blot检测自制的鼠抗Nsp9血清与天然的PEDV蛋白的反应，自制的鼠抗Nsp9血清与PEDV Nsp9蛋白形成了特异的抗原抗体反应带，而非免疫的鼠血清与PEDVNsp9蛋白未形成相应条带。
图22为在两次加强免疫后的第一周收集被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的全血，并将从血液中提取的RNA用于RT-qPCR分析IL-1β，TNF-α，IFN-γ，IL-4和IL-10表达水平。
图23为MBP-Nsp9包被的ELISA和市售PEDV ELISA检测试剂盒的比较图。
图24为重组蛋白免疫BABL/c小鼠的免疫过程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
pal-MBPTFF质粒为中科院动物所向阳老师赠送。
雌性BALB/c鼠购自江西中医药大学。
一、PEDV Nsp9重组表达载体的鉴定
1、PEDV Nsp9的生物信息学分析
根据NCBI GenBank中查询的PEDV CV777株(AF353511.1)查询Nsp9的氨基酸序列，将PEDV Nsp9的氨基酸简写序列导入https://www.expasy.org/网站，分析PEDV Nsp9的疏水性、空间结构和B细胞抗原表位。
图1的，横坐标上方部分为暴露的B细胞抗原表位对应的氨基酸，横坐标上方图形面积大小表示暴露面积大小，Nsp9蛋白的线性肽链存在的B细胞抗原表位集中于2～35位氨基酸、49～52位氨基酸、105～117位氨基酸处共有6个抗原表位，暴露的最大部分的抗原表位如图2中的4个圈标注出的部分。B细胞抗原表位的存在表明了Nsp9作为免疫反应抗原的可行性。疏水性分析是为了方便后续目的蛋白的表达和纯化过程。基于疏水性的分析，PEDVNsp9蛋白水溶性不足以充分地表达在上清，获得可溶性蛋白。因而将Nsp9和MBP融合表达以获得水溶性更高的MBP-Nsp9蛋白是必要的且可行的。一般来说，MBP在大肠杆菌对麦芽糖的新陈代谢过程发挥重要作用。在现代分子生物学研究中，MBP融合表达的蛋白具有水溶性高，产量足等特点，因此MBP标签被广泛应用。本发明利用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)与PEDV Nsp9蛋白的重组得到融合蛋白MBP-Nsp9，可增加Nsp9的可溶性。
2、设计PEDV Nsp9的引物
根据NCBI GenBank中查询的PEDV CV777株(AF353511.1)RNA序列设计Nsp9的引物，分别在pMAL-c2x-MBP-Nsp9引物加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，在pET28a-Nsp9的引物加入EcoR I和HindⅢ的酶切位点，并***合适的保护碱基，送往擎科公司合成。
用于pMAL-c2x-MBP-Nsp9的Nsp9扩增引物；
正向引物：5’-ccggaattcatgctgaaacagcgtagcatcaaagc-3’；
反向引物：5’-acgcgtcgactcagtggtggtggtggtggtgggcctgttccgt-3’。
用于pET28a-Nsp9的Nsp9扩增引物：
正向引物：5’-ccggaattcatgctgaaacagcg-3’；
反向引物：5’-cccaagctttcagtggtggtggtg-3’。
pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pMAL-c2x-MBPTFF、pET-28a-Nsp9重组质粒的设计简图如图3所示。
普通PCR扩增Nsp9基因程序如下：
反应程序 反应时间
预变性(94℃) 200秒
变性(94℃) 30秒
退火(56℃) 30秒
延伸(72℃) 50秒
持续延伸(72℃) 600秒
3.扩增PEDV Nsp9基因
基于普通PCR的方法扩增PEDV的Nsp9，但由于设计的pMAL-c2x-MBP-Nsp9的引物和pET28a-Nsp9的引物不同，所以不同的质粒载体酶切位点不同，为了后期Nsp9片段的获取和鉴定重组，要分开进行Nsp9的PCR扩增步骤。
用于pMAL-c2x-MBP-Nsp9中的Nsp9扩增体系如下：
反应物名称 剂量
pMAL-c2x-MBP-Nsp9质粒DNA模板 1μL
pMAL-c2x-MBP-Nsp9正向引物 1μL
pMAL-c2x-MBP-Nsp9反向引物 1μL
dNTPstaq mix 4μL
双蒸水 Up to 10μL
构建pET28a-Nsp9重组质粒时，用于pET28a-Nsp9中的Nsp9扩增体系如下：
反应物名称 剂量
pMAL-c2x-MBP-Nsp9质粒DNA模板 1μL
pET28a-Nsp9正向引物 1μL
pET28a-Nsp9反向引物 1μL
dNTPstaq mix 4μL
双蒸水 Up to 10μL
普通PCR扩增Nsp9基因程序如下：
反应程序 反应时间
预变性(94℃) 200秒
变性(94℃) 30秒
退火(56℃) 30秒
延伸(72℃) 50秒
持续延伸(72℃) 600秒
4、PEDV Nsp9基因克隆片段的回收纯化
将上述PCR过程获得的混合PCR产物进行琼脂糖电泳。结束后，在凝胶成像***下，打开切胶模式，戴上手套用刀片切下紫外灯模式下Nsp9的发亮条带，做到胶体饱满，条带单一纯净。将获得的条带用PCR纯化回收试剂盒回收PEDV Nsp9目的基因。步骤如下：
(1)将胶体条带放入1.5mL EP管中，加入3倍体积的GSB溶液。
(2)将EP管放到56℃金属浴直到胶体完全溶化。
(3)将EP管取出，室温静置5分钟，将混合溶液转移到纯化柱中
(4)10000g常温离心1分钟，取出纯化柱，晾干。
(5)将纯化柱放入干净的EP管，加入DNA回收Buffer，重复步骤(4)。
(6)收集EP管中的DNA溶液，-20℃保存。
5、提取pET28a-Nsp9空载体质粒
将pET28a-Nsp9空载体质粒转化进DH5a大肠杆菌感受态中，涂板过夜培养，第二天分别挑取单菌落，转接进5mL的BL大肠杆菌生长培养基(含质粒对应的抗生素抗性)，做好pET28a-Nsp9的标记，在37℃的条件下，180r过夜培养。第二天收取菌液，根据质粒提取试剂盒进行质粒提取：
(1)吸取1mLpET28a-Nsp9空载体质粒转化后的菌液。
(2)10000g常温离心1分钟。
(3)弃去培养基，用吸水纸将多余的培养基吸干。
(4)加入250μL buffer Ⅰ，用移液器吹吸混合均匀。
(5)加入和buffer Ⅰ等量的buffer Ⅱ250μL，轻轻使其中和混匀。
(6)加入buffer Ⅱ体积1.5倍的buffer Ⅲ，轻轻使其中和混匀，出现白色沉淀。
(7)用步骤(2)的方法低温离心10分钟，轻轻吸取上清。
(8)将上清转移到DNA结合柱上，用步骤(2)的方法低温离心，加入600μL洗涤Buffer。
(9)用步骤(2)的方法低温离心，弃去洗涤Buffer，重复2次，将DNA结合柱室温晾干。
(10)换用干净的EP管，在DNA结合柱中加入DNA洗脱液30～50μL。
(11)用步骤(2)的方法离心，收集提取的质粒。
6、pET28a-空载体质粒双酶切
pET28a-质粒双酶切体系如下：
反应物名称 剂量
pET28a-质粒 1μg
EcoR I 1μL
HindⅢ 1μL
10×K buffer 2μL
双蒸水 Up to 10μL
用干净的EP管以上体系混合好后，将EP管置于37℃水浴，尽量使体系完全浸没在水中，水浴时间根据酶切效率决定，一般为2～4小时。如效率不足，可适量延长酶切的时间。
7、pET28a-Nsp9载体质粒与PEDV Nsp9基因片段的连接
将上述步骤回收得到的对应pET28a-载体的Nsp9基因片段，分别与双酶切后的pET28a-空载体质粒连接。具体的，根据基因大小计算摩尔质量比，以摩尔质量比例1:3、1:5、1:7、1:9设计连接。1:3的连接体系如下：
反应物名称 剂量
pET28a-空载体质粒 1μL
对应pET28a-载体的Nsp9基因 20.9μL
T4 DNA连接酶 1μL
10×T4 Buffer 2μL
双蒸水 UP to 30μL
充分混匀后，将连接产物置于4℃条件下，连接反应24小时。
8、将重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9转化大肠杆菌
将上述步骤获得的产物，转化进DH5α大肠杆菌，首先将保藏的大肠杆菌置于冰盒上溶化，10min后加入连接产物1μL，分别做好pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9标记以及区分连接的比例，冰浴30分钟后，立即拿出42℃热激90秒，加入3倍混合物体积的BL大肠杆菌生长培养基，置于37℃摇床活化1小时，取出大肠杆菌，分别将混合的菌液涂在对应pMAL-c2x-MBP-Nsp9(AMP)、pET-28a-Nsp9(KANA)所具备的抗性固体培养基板子上,置于37℃恒温培养箱，过夜培养。
9、鉴定重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9
将上述步骤过夜生长的抗性固体培养基板子取出，首先观察不同比例1:3、1:5，1:7、1:9下单菌落的数量，对生长单菌落数量多的比例加以记录，以备后期实验直接使用。分别挑取pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9单菌落，转接到BL大肠杆菌生长培养基里，过夜摇菌，次日将不同的菌液分别保种，并做好pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9和标记。并进行鉴定。
9.1重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9的PCR鉴定
将上述步骤中获得的pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9菌液，作为菌液PCR的模板进行普通PCR鉴定，扩增体系如下：
Figure BDA0003196684850000081
Figure BDA0003196684850000091
PCR扩增步骤参照步骤5。
9.2重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9双酶切鉴定
(1)提取重组pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9质粒。
(2)将重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9产物双酶切，双酶切体系如下：
pMAL-c2x-MBP-Nsp9双酶切体系：
试剂名称 体积
10×k Buffer 2μL
pMAL-c2x-MBP-Nsp9质粒 1μg
EcoR I 1μL
Sal I 1μL
双蒸水 Up to 20μL
pET-28a-Nsp9双酶切体系：
试剂名称 体积
10×k Buffer 2μL
pET-28a-Nsp9质粒 1μg
EcoR I 1μL
HindⅢ 1μL
双蒸水 Up to 20μL
(2)将混合物置于干净EP管，37℃恒温水浴，4小时后收取酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析。
重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp9鉴定结果如图4所示，经过双酶切后的重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp9得到两条条带，一条为pMAL-c2x-MBP载体的线性片段，另外一条在500bp下方的位置，与预期条带一致。初步确定重组质粒pMAL-c2x-MBP-nsp9构建成功。
重组质粒pET-28a-Nsp9鉴定结果如图5所示，经过双酶切后的重组质粒pET-28a-Nsp9得到两条条带，一条为pET-28a载体的线性片段，另外一条在500bp下方的位置，与预期条带一致。初步确定重组质粒pET-28a-Nsp9构建成功。
9.3重组质粒pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9测序鉴定
将PCR鉴定和双酶切鉴定正确的pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9重组质粒送至擎科公司测序，测序鉴定正确的重组质粒命名为pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET-28a-Nsp9。二、重组PEDV Nsp9重组蛋白的表达、纯化和鉴定
1、表达重组蛋白
(1)将pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET28a-Nsp9和pMAL-c2x-MBPTFF质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)。
(2)分别挑取pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET28a-Nsp9和pMAL-c2x-MBPTFF单菌落，转接至BL大肠杆菌生长培养基，在37℃，180r条件下过夜培养。
(3)次日，将pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET28a-Nsp9和pMAL-c2x-MBPTFF的菌液，以1:100的比例转接至新的BL大肠杆菌生长培养基，在37℃，180r条件下培养2～4小时。
(4)将新转接的pMAL-c2x-MBP-Nsp9、pET28a-Nsp9和pMAL-c2x-MBPTFF的菌液取出，以1:100的比例转接至2×YT大肠杆菌表达培养基。
(5)根据实验需求调整蛋白的表达条件，包括温度、时间和IPTG浓度。
(6)表达时间结束后，收取菌液，离心获得大肠杆菌湿菌。
(7)超声破菌获取重组蛋白。
2、SDS-PAGE分析
(1)收取湿菌，超声破菌获得重组蛋白
(2)将湿菌或蛋白分装在新的EP管中，按1/5的比例加入SDS蛋白上样缓冲液，混匀。
(3)将EP管的盖子合盖好，放入金属浴或水浴加热至100℃，待沸腾10～20分钟后取出。
(4)将样品置于冰上冷却1～3分钟，4℃低温1000g离心1分钟。
(5)将蛋白质Marker和样品加入事先制作好的SDS-PAGE胶泳道孔。
(6)加入稀释至1×的甘氨酸电泳缓冲液，打开电泳仪开关，设定电压90V，运行时间1～2小时后取出SDS-PAGE胶。
(7)将SDS-PAGE胶通过考马斯亮蓝染色约0.5～1小时后取出
(8)将染色过的SDS-PAGE胶放入配置好的蛋白脱色液，待胶体蛋白条带外的考马斯亮蓝洗净，分析蛋白条带。
3、MBP-Nsp9重组蛋白表达的优化
3.1最适诱导温度的摸索
根据大肠杆菌最适生长温度37℃，将摸索温度设置在17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃。为摸索MBP-Nsp9蛋白表达最适温度，将所有实验组的表达时间和IPTG浓度设定在8小时和1mM。用6个摇床设置不同温度17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃来同时表达MBP-Nsp9蛋白。做好标记，8小时后，收取菌体蛋白，SDS-PAGE分析蛋白。
结果如图6所示，32℃时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的5.33％。
3.2最适诱导时间的摸索
在大肠杆菌最适表达温度为32℃的条件下，将摸索时间设置在2h、4h、6h、8h、10h，为摸索MBP-Nsp9蛋白表达最适诱导时间，将所有实验组的表达温度和IPTG浓度设定在32℃和1mM。用5个摇床同时设置32℃，然后分别在加入IPTG后的2h、4h、6h、8h、10h来收取MBP-Nsp9蛋白。做好标记，按不同时间点收取菌体蛋白，SDS-PAGE分析蛋白。
结果如图7所示，诱导时间为8h时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的7.16％。
3.3最适诱导IPTG浓度的优化
在大肠杆菌适表达温度32℃的条件下，将摸索IPTG浓度设置在0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM、1.2mM。为摸索MBP-Nsp9蛋白表达最适诱导IPTG浓度，用摇床设置在32℃温度来同时表达MBP-Nsp9蛋白。做好标记，8小时后，将试管同时取出，收取菌体蛋白，SDS-PAGE分析蛋白。
结果如图8所示，IPTG浓度为1.0mM时，蛋白质的表达量最高，目的蛋白占全菌总蛋白的7.57％。
总的来说，通过正交分析得到重组蛋白的最合适表达条件为：32℃条件下，1.0mM的IPTG浓度诱导8h。
3.4MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF的表达
表达MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF，并通过SDS-PAGE分析蛋白。为对比Nsp9蛋白和MBP-Nsp9蛋白的水溶性，需要在相同的条件下表达两种重组蛋白，同等量的湿菌进行超声破碎分析。
MBP-Nsp9表达情况如图9所示，结果显示，MBP-Nsp9在整个细菌蛋白表达水平中为15.65％，上清液中的表达水平为21.12％。
Nsp9表达情况如图10所示，结果显示，Nsp9在整个细菌蛋白表达水平中的整个细菌蛋白表达水平为5.03％，且表达在水平上清液中的总量为8.14％。
MBPTFF在37℃表达，且表达的蛋白产物直接存在于上清，MBPTFF的表达和纯化结果如图11所示。
3.5重组蛋白的纯化
重组蛋白MBP-Nsp9和Nsp9都存在6*His-tag标签，可以使用NI柱亲和层析进行蛋白纯化。步骤如下：
(1)将超声破碎后的大肠杆菌收集，10000g离心30分钟后收集上清和菌体沉淀。
(2)在收集的上清中加入1mM的PMSF防止上清蛋白被降解，上清经0.22μm的滤膜过滤。
(3)将过滤后的蛋白上清加入到平衡好的NI柱上，收集过柱的溶液。
(4)加入10倍柱体积的平衡液再次过柱，收集过柱的溶液。
(5)此时蛋白都结合在了NI柱上，用低浓度的咪唑进行杂蛋白洗脱步骤，收集洗杂液。
(6)杂蛋白洗脱后，加入100～250mM浓度的咪唑进行目的蛋白的梯度洗脱，收集洗脱液。
(7)洗脱完成后用500mM的咪唑清洗NI柱，再用大量的清水洗去多余的咪唑。
(8)NI柱清洗完成后，加入2～5体积的20％酒精，将NI柱保存于4℃。
(9)纯化的蛋白在洗脱液中，通过SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE电泳对重组蛋白进行初步分析显示，pMAL-c2x-MBP-Nsp9表达载体表达的重组蛋白全部表达在上清中，而pET28a-Nsp9表达载体表达的重组蛋白虽然大部分是表达在上清，在包涵体的蛋白泳道中仍然出现了条带，这表明仍然有少部分重组的Nsp9蛋白是以包涵体的形式存在的。重组蛋白能够高效表达得利于表达条件的优化；某些蛋白表达的影响因素如表达的温度过长或IPTG浓度过高会导致蛋白质不能折叠到正确的构象。此外，一般可溶性蛋白质容易受到蛋白酶的影响。而构建的pMAL-c2x-MBP-Nsp9表达载体的蛋白是全部表达在上清中的，且目的蛋白的表达量也明显高于pET28a-Nsp9表达载体。这极大的提高了蛋白的获取效率，同时也方便了后期对重组蛋白的纯化和鉴定工作。
在NI柱纯化His-Tag标记的重组蛋白，使用不同浓度的咪唑洗脱MBP-Nsp9、Nsp9蛋白，在梯度浓度的咪唑溶液下收集所有重组蛋白。然后通过SDS-PAGE分析不同咪唑浓度下重组蛋白的收集情况，以得到最合适的重组蛋白洗脱浓度。由于pET28a-Nsp9的表达水平不高，因此需要大量的摇瓶培养大肠杆菌来收集细菌，提高Nsp9蛋白的浓度，以利于后续的纯化。优化得到的Nsp9的最佳咪唑浓度为150Mm。
另外，MBPTFF蛋白通过剪切胶纯化。
3.6重组蛋白的Western Blot鉴定
将重组蛋白MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF转印至PVDF膜上，根据蛋白大小决定转膜时长，平均一分钟1kDa，则MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF的转膜时长分别设定为56分钟，12分钟和42分钟。鉴定MBP-Nsp9重组蛋白一抗选用鼠抗MBP和鼠抗6*His抗体，鉴定Nsp9重组蛋白的一抗选用鼠抗6*His抗体，鉴定MBPTFF蛋白的一抗选用鼠抗MBP抗体。具体Western Blot步骤如下：
(1)重组蛋白转印至PVDF膜上，根据重组蛋白大小决定转膜时间。
(2)转膜结束后将PVDF膜放入事先配置好的5％的脱脂奶粉溶液封闭1小时。
(3)用无菌PBST洗膜10分钟，重复3次。
(4)将PVDF膜放入事先稀释好的一抗溶液中4℃孵育16-24小时。
(5)重复步骤(4)。
(6)加入稀释好的二抗，孵育1～2小时。
(7)重复步骤(4)。
(8)加入200μL A液与B液混合好的ECL显色液上机观察结果。
Western Blot检测重组蛋白MBP-Nsp9、MBPTFF结果如图12所示，Western Blot检测重组蛋白Nsp9结果如图13所示，结果显示，MBP-Nsp9能同时被带有His-tag的鼠一抗和带有MBP-tag的鼠一抗检测到特异性条带，而Nsp9只能被带有His-tag的鼠一抗检测到特异性条带，MBPTFF只能被带有MBP-tag的鼠一抗检测到特异性条带，进一步证明了大肠杆菌表达的重组蛋白的正确性。
三、重组蛋白的免疫原性分析
1、动物免疫
用纯化好的MBP-Nsp9重组蛋白免疫BABL/c小鼠，免疫过程如图24所示，在第一天将重组蛋白MBP-Nsp9按1:1的比例混完全弗氏佐剂免疫小鼠，在第二周和第四周分别用相同的比例混不完全弗氏佐剂加强免疫两次。从小鼠免疫第二周开始小鼠尾部取血，此后每2周取血一次，取血操作一直到第十周。
另外，用纯化好的MBP-Nsp9与猪血清反应。
图14为MBP-Nsp9与不同来源的抗体反应图，左图为Western Blot检测MBP-Nsp9与MBP-Nsp9免疫后的小鼠血清反应，右图为WB检测MBP-Nsp9与猪血清反应。
2、间接ELISA
ELISA是分子生物学常用的分析抗原抗体反应的方法，本发明以纯化的重组蛋白MBP-Nsp9、Nsp9和MBPTFF为包被抗原，分别检测不同的抗血清，来检测不同抗血清的抗体水平和血清中细胞因子的含量。方法如下：
(1)将纯化好的蛋白定量，用抗原包被缓冲液稀释到10μg/μL，每孔100μL，用保鲜膜包好，4℃过夜。
(2)取出96孔板，弃去抗原包被缓冲液，加入1％浓度的BSA溶液，室温封闭1小时，弃去1％浓度的BSA溶液。
(3)每孔加入PBST 200μL洗3次，吸水纸吸干水分。
(4)加入抗血清(用PBST按一定浓度梯度稀释血清)，室温孵育4～6小时，弃去血清溶液。
(5)重复步骤(3)。
(6)加入含HRP的羊抗鼠PBST稀释的二抗，室温孵育1小时，弃去二抗溶液。
(7)重复步骤3。
(8)加入TMB显色液每孔50μL，在避光的暗处反应约15～30分钟。
(9)加入与显色液等体积的2M的硫酸终止液，5分钟内上机检测。
结果如图15～19所示，图15为以纯化的MBP-Nsp9包被板子检测MBP-Nsp9，MBPTFF,Nsp9免疫后小鼠血清的抗体效价水平。
图16为以纯化的Nsp9包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。图17为以纯化的MBPTFF包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。
图18为以纯化的MBP-Nsp9包被板子，检测被免疫MBP-Nsp9蛋白，Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠的血清2～10week的血清最高OD450对比。
图19为ELISA实验定量分析了被免疫MBP-Nsp9蛋白、Nsp9蛋白和MBPTFF小鼠抗血清中IFN-γ的含量。
3、间接免疫荧光试验
PEDV感染VERO细胞后，进行间接免疫荧光实验，步骤如下：
(1)用移液器轻轻吸去培养基。
(2)加入PBS轻轻晃动清洗，再用移液器吸去多余液体，重复3次。
(3)每孔加入4％的细胞组织固定液将细胞层完全覆盖住，固定反应时间约30分钟，弃去反应液。
(4)重复步骤(2)，再加入预冷的0.1M的甘氨酸缓冲液将细胞层完全覆盖住，反应10分钟，弃去反应液。
(5)重复步骤(2)，加入免疫染色强力通透液，将细胞层完全覆盖住，反应10～30分钟。
(6)重复步骤(2)，加入1％浓度的BSA溶液，每孔500μL，1小时封闭反应。
(7)重复步骤(2)，加入自制的免疫重组蛋白后的小鼠血清作为一抗，稀释比例1:50-1:100，也可根据实验要求调整浓度，37℃孵育1小时。
(8)重复步骤(2)，加入稀释后的FITC标记的荧光羊抗鼠二抗，避光孵育约1～2小时。
(9)重复步骤(2)，在荧光显微镜下观察。
结果如图20所示，结果表明，自制的鼠抗MBP-Nsp9和自制的鼠抗Nsp9血清可以与PEDV感染过的Vero细胞发生荧光反应。而自制的鼠抗MBPTFF血清和免疫PBS组的小鼠血清则不能和PEDV感染过的Vero细胞发生荧光反应，图中的绿色荧光(如箭头所示)表示PEDV的Nsp9蛋白。通过观察绿色荧光的分布，可以预测PEDV感染Vero细胞后，PEDV表达的Nsp9蛋白主要分布在细胞质。
5、Western blot
Western Blot检测自制的鼠抗Nsp9血清与天然的PEDV蛋白的反应，结果如图21所示，自制的鼠抗Nsp9血清与PEDV Nsp9蛋白形成了特异的抗原抗体反应带，而非免疫的鼠血清与PEDV Nsp9蛋白未形成相应条带。
6、半定量PCR
在NCBI中根据小鼠(Mus musculus)的IL-1β、IL-10、IL-4、TNF-α、IFN-γ、β-actin基因设计引物。引物由擎科生物公司合成，引物序列如下表：
Figure BDA0003196684850000151
Figure BDA0003196684850000161
PCR反应程序(以β-actin为例)如下：
Figure BDA0003196684850000162
如图22所示，结果表明：注射外源蛋白MBP-Nsp9、MBPTFF和Nsp9的小鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明显高于PBS阴性小鼠，MBP-Nsp9的血清IL-1β和TNF-α水平均明显高于MBP和Nsp9的小鼠，而Nsp9小鼠组又略高于MBPTFF组小鼠，提示MBP和Nsp9都能引发小鼠的炎症反应，且MBP-Nsp9重组蛋白能引发更高的炎症反应。对于IL-4和IL-10，PBS阴性组的小鼠数值显著高于重组蛋白注射组的小鼠，MBPTFF组比Nsp9组略高，而MBP-Nsp9又显著低于Nsp9组。PEDV Nsp9蛋白感染增强了小鼠细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α以及II型干扰素IFN-γ的表达，下调抗炎因子IL-4和IL-10的表达。所有这些结果表明，与接种PBS的小鼠相比，接种Nsp9，MBPTFF和MBP-Nsp9蛋白的小鼠的I型和II型干扰素应答被显着激活。
四、重组表达蛋白ELISA与商业ELISA对比
将MBP-Nsp9包被的ELISA和市售PEDV ELISA检测试剂盒(购自韩国安捷Bionote公司)的比较。猪血清样本采集于中国江西省养猪场。
来自养殖场的猪PEDV抗体阳性和阴性血清样品随机30份混合(n＝30)通过MBP-Nsp9包被的ELISA(图23左)和商业试剂盒抗原包被的ELISA(图23右)进行ELISA测试。每个点代表一个样本，实线代表截止值，根据试剂盒说明书阐述，即OD450值高于1.0则判定为阳性。样品显示出MBP-Nsp9作为抗原与商业化的PED IgA抗原不同的反应，存在差异的样本用箭头表示。经对比，30份样品，MBP-Nsp9作为抗原有29份样品检测与商业化试剂盒的检测符合。符合率为96.67％。表明使用重组MBP-Nsp9为包被抗原的ELISA方法结果稳定可靠，可用于临床样品的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西农业大学
<120> 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 1
Met Leu Lys Gln Arg Ser Ile Lys Ala Glu Gly Asp Gly Ile Val Gly
1 5 10 15
Glu Gly Lys Ala Leu Tyr Asn Asn Glu Gly Gly Arg Thr Phe Met Tyr
20 25 30
Ala Phe Ile Ser Asp Lys Pro Asp Leu Arg Val Val Lys Trp Glu Phe
35 40 45
Asp Gly Gly Cys Asn Thr Ile Glu Leu Glu Pro Pro Arg Lys Phe Leu
50 55 60
Val Asp Ser Pro Asn Gly Ala Gln Ile Lys Tyr Leu Tyr Phe Val Arg
65 70 75 80
Asn Leu Asn Thr Leu Arg Arg Gly Ala Val Leu Gly Tyr Ile Gly Ala
85 90 95
Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Lys Gln Thr Glu Gln Ala His His His
100 105 110
His His His
115
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr
355 360 365

Claims (9)

1.含猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由MBP蛋白和猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白组成，所述猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，MBP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有用于表达权利要求1中融合蛋白的核苷酸序列。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求2所述的重组表达载体。
4.猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白和权利要求1所述的融合蛋白在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。
5.猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白和权利要求1所述的融合蛋白在制备猪流行性腹泻病毒诊断试剂中的应用。
6.权利要求1中所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取猪流行性腹泻病毒RNA，反转录为Nsp9cDNA；
步骤2：设计与合成猪流行性腹泻病毒的Nsp9基因的引物，扩增猪流行性腹泻病毒的Nsp9基因；
步骤3：将猪流行性腹泻病毒的Nsp9基因与含有MBP基因的载体连接，鉴定后转化感受态细胞；
步骤4：重组蛋白MBP-Nsp9的表达，纯化，鉴定。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述MBP-Nsp9蛋白最佳表达温度为32℃。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述MBP-Nsp9蛋白最佳表达时间为8h。
9.根据权利要求6所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述MBP-Nsp9蛋白最佳IPTG浓度为1mM。
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