CN113583007B - 一种吡咯并嘧啶类btk抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种吡咯并嘧啶类BTK抑制剂及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。所述化合物具有如式(I)所示的结构通式：

其中R₁选自不同的吸电子或者供电子基团；R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为酰胺、酯、磺酰胺中的任意一种；所述化合物还包括其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药。经试验证明，其能够有效抑制高表达BTK的Ramos细胞增殖，同时对正常的hPBMC细胞毒性较低，因此有望用于类风湿性关节炎及相关疾病的治疗，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种吡咯并嘧啶类BTK抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种吡咯并嘧啶类BTK抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种常见的自身免疫***疾病，其病理特征主要以滑膜炎、软骨损伤为主，严重地可导致畸形和其他并发症，极大地影响患者的生活质量。流行病学调查发现，目前全球约有4000多万患者正遭受类风湿性关节炎困扰，中国约占其中的七分之一。

目前，类风湿性关节炎的发病机制尚不明确，可能与基因、遗传、环境、翻译后修饰等因素有关。在这些因素的影响下，抗瓜氨酸肽抗体(Autoantibodies againstCitrullinated Peptides,ACPA)能与含有瓜氨酸的抗原结合形成免疫复合物，随后与类风湿因子(Rheumatoid Factors,RF)结合，促使补体大量激活，使免疫***失去耐受性，导致无症状的滑膜炎症，进一步导致软骨损伤和关节破坏；组织的破坏又导致额外的自身抗原的释放，进一步加重了疾病。

药物治疗仍是该病治疗的主要方式，除非甾体抗炎药、糖皮质激素及传统合成改善病情抗风湿药外，生物制剂及蛋白酪氨酸激酶抑制剂因其较高的临床缓解率近些年得以更广泛的使用；但大部分生物制剂价格昂贵且使用不便，研发新的小分子酪氨酸激酶抑制剂成为潜在的临床需要。目前针对RA的小分子酪氨酸激酶抑制剂主要包括JAK(JanusKianse)抑制剂和布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’sTyrosine Kinase,BTK)抑制剂，目前已有8款JAK抑制剂上市，但还未有一款针对类风湿性关节炎的BTK抑制剂获批上市。

布鲁顿酪氨酸激酶隶属非受体酪氨酸激酶Tec家族一员，其在B细胞和髓样细胞信号通路中起关键作用，抑制过度活化BTK减少细胞因子分泌及自身抗体的产生，有助于减轻类风湿性关节炎的症状。目前尚未有针对RA的BTK抑制剂上市，所以研发新的BTK抑制剂具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种吡咯并嘧啶类BTK抑制剂及其制备方法与应用。本发明设计并合成了一系列非共价吡咯并嘧啶类化合物，经试验证明，其能够有效抑制高表达BTK的Ramos细胞增殖，同时对正常的hPBMC细胞毒性较低，因此有望用于类风湿性关节炎及相关自身免疫性疾病的治疗。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种化合物，所述化合物具有如式(I)所示的结构通式：

其中R₁选自不同的吸电子或者供电子基团；R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为酰胺、酯、磺酰胺中的任意一种；

进一步的，R₁是4-甲基，4-乙基，4-三氟甲基，4-异丙基，4-环丙基，4-甲氧基，4-叔丁基，4-二甲氨基，4-氰基，2,4-二甲基，3-三氟甲基，2-氟-4-三氟甲基中的任意一种；

所述化合物还包括其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药。

进一步的，所述化合物的结构可进一步如式(II)所示：

其中，所述R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为酰胺、酯、磺酰胺中的任意一种。

本发明的第二个方面，提供上述化合物的制备方法，所述制备方法包括：

a)当所述化合物为式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药时，其合成路线为：

b)当所述化合物为式(II)所示化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药时，其合成路线如下：

本发明的第三个方面，提供一种药物组合物，其包含上述第一方面中所述化合物。

以及，一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述化合物和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。

本发明的第四个方面，提供上述第一方面中所述的化合物或者上述第三方面中所述的药物组合物或药物制剂在制备抑制布鲁顿酪氨酸激酶过表达药物或试剂中的应用。

本发明的第五个方面，本发明提供了上述第一方面中所述的化合物或者上述第三方面中所述的药物组合物或药物制剂在制备治疗与布鲁顿酪氨酸激酶过表达相关疾病的药物中的应用；优选的，所述疾病为自身免疫***疾病，进一步优选为类风湿性关节炎。

本发明的第六个方面，本发明提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的化合物或本发明第三方面所述的药物组合物或药物制剂。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案设计的一系列非共价吡咯并嘧啶类BTK抑制剂，结构较新颖，未见有文献报道。根据细胞水平的活性结果：部分化合物如W-10、W-8、W-17在10μM浓度下对Ramos细胞的增殖抑制率明显高于阳性药Fenebrutinib，部分化合物与阳性药水平相当。

上述技术方案研究发现以4-甲基哌嗪基代替先导化合物的吗啉基作为新的溶剂暴露区时化合物活性升高，当铰链区引入7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶母核时活性降低；后续对“H3”口袋区改造发现当为R₁基团为甲基、乙基、甲氧基、二甲氨基等较小的给电子基活性较优，其中以二甲氨基取代活性最好，对Ramos细胞的增殖抑制率高约两倍；磺酰胺类化合物活性优于酯基、酰胺等；关于R₂基团的不同取代，对活性影响较小。在正常人的hPBMC细胞中，化合物W-10浓度在12μM以内对正常淋巴细胞的毒性低于阳性药，且细胞活力维持在80％以上；化合物浓度升高至25μM及以上时，对正常淋巴细胞毒性升高，细胞活力明显降低。

综上，上述技术方案的化合物对BTK过表达具有良好的抑制作用，可用于类风湿性关节炎及疾病的预防与治疗，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明化合物对Ramos细胞抗增殖活性结果图，A为化合物在10μM浓度下对Ramos细胞增殖抑制率；B为化合物W-10的IC₅₀；C为阳性药Fenebrutinib的IC₅₀。

图2为本发明化合物W-10与Fenebrutinib对hPBMC毒性比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，布鲁顿酪氨酸激酶隶属非受体酪氨酸激酶Tec家族一员，其在B细胞和髓样细胞信号通路中起关键作用，抑制过度活化BTK减少细胞因子分泌及自身抗体的产生，有助于减轻类风湿性关节炎的症状。目前尚未有针对RA的BTK抑制剂上市，所以研发新的BTK抑制剂具有重要意义。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种化合物，所述化合物具有如式(I)所示的结构通式：

其中R₁选自不同的吸电子或者供电子基团；R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为酰胺、酯、磺酰胺中的任意一种；

进一步的，R₁是4-甲基，4-乙基，4-三氟甲基，4-异丙基，4-环丙基，4-甲氧基，4-叔丁基，4-二甲氨基，4-氰基，2,4-二甲基，3-三氟甲基，2-氟-4-三氟甲基中的任意一种；

所述化合物还包括其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药。

进一步的，所述化合物的结构可进一步如式(II)所示：

其中，所述R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为酰胺、酯、磺酰胺中的任意一种。

在本发明的实施方式中，作为示例，本发明的化合物可以为下列结构：

4-叔丁基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-3)；

4-甲基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-4)；

4-乙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-5)；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-6)；

4-异丙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-7)；

4-甲氧基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-8)；

4-环丙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-9)；

4-二甲氨基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-10)；

4-氰基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-11)；

2,4-二甲基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-12)；

2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]吡啶-2-基}-N-[4-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(W-13)；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-14)；

2-氟-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-15)；

N-{2-甲基-3-{4-[(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯磺酰胺(W-16)；

4-(叔丁基)-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯磺酰胺(W-17)；

2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基-4-苯甲酸叔丁酯(W-18)；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(W-19)；

N-{3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-20)；

N-{2-氟-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-21)；

N-{2-氰基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(W-22)。

本发明上述吡咯并嘧啶类化合物可以游离形式或以盐的形式存在，目的是为了提高水溶性，增加生物利用度。“药学上可接受的盐”是指常规的无毒性的盐，包括无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和抗坏血酸盐；无机碱盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐、镁盐和铝盐；以及有机碱盐，例如精氨酸盐、苄星盐、胆碱盐、二乙胺盐、二醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐和氨基丁三醇盐。此外，本领域熟练技术人员可以根据溶解度、稳定性、容易制剂等取某种盐而舍去另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。

在本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物的制备方法，所述制备方法包括：

a)当所述化合物为式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药时，其合成路线为：

b)当所述化合物为式(II)所示化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶体或前药时，其合成路线如下：

其中，

a条件为加入草酰氯、DCM，在0-30度下反应1-5h。

b条件为加入DIPEA、DCM，在0-20度下反应3-8h。

c条件为加入Pd(dppf)Cl₂、KOAc、双联频哪醇基二硼、二恶烷，在80-110度下反应8-12h。

d条件为加入TsCl、TEA、DMAP、DCM，在0-30度下反应4-8h。

e条件为加入DIPEA、EtOH，在40-80度下反应4-8h。

f条件为加入Pd(OA_C)₂、PCy₃、Cs₂CO₃、DMF、H₂O，在微波反应器80-140度下反应10-30min。

在本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包含上述第一方面中所述化合物。

以及，一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述化合物和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。

本发明所述辅料是指药物组合物或药物制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。本领域常用的辅料比如缓冲剂、稳定剂、防腐剂或赋型剂，常用的赋形剂例如粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂等。

作为示例，本发明的所述制剂中可选用的赋形剂包括但不限于：所述赋形剂选自磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精、淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐和聚乙烯吡咯烷酮。

本发明所述药物载体可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂、囊泡、纳米材料等，用于将本发明上述第一方面所述的化合物递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择。蛋白和脂质体也是药物载体。

本领域技术人员可采用公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或制剂。比如将本发明上述第一方面中披露的任意化合物(至少一种化合物)与药用辅料混合，然后如果需要，使所得混合物形成所需的形状。除本发明提到的除外，也可根据已知药物制剂进行药物制剂的制备。以及，除本发明提到的以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)。

在本发明的又一具体实施方式中，提供上述第一方面中所述的化合物或者上述第三方面中所述的药物组合物或药物制剂在制备抑制布鲁顿酪氨酸激酶过表达药物或试剂中的应用。

在本发明的又一具体实施方式中，提供上述第一方面中所述的化合物或其异构体或其溶剂化物或其药学上可接受的盐或者上述第三方面中所述的药物组合物或药物制剂在制备治疗与与布鲁顿酪氨酸激酶过表达相关疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为自身免疫***疾病，进一步优选为类风湿性关节炎。

在本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗类风湿性关节炎的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的化合物或本发明第三方面所述的药物组合物或药物制剂。

本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。

本发明所述治疗有效量是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药物制剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织***、动物或人的生物学或医学响应，所述响应包括减轻或部分减轻所述治疗疾病、综合征、病症或障碍的症状。

本领域的研究者、兽医、医生或其他医疗人员可根据临床试验或者本领域其他公知的手段获知可使用的治疗有效量的范围。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：化合物W-3至W-5的合成

中间体N-(3-溴-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(3b)的合成

冰浴条件下，将原料4(1.00g,5.37mmol)溶于15mL无水DCM(经

分子筛干燥)，待反应体系降至0℃后，缓慢滴加原料3a(1.16g,5.91mmol)，溶液由橙黄色变为乳白色混悬液，再加入DIEA(1.39g,10.75mmol)，冰浴下反应30min后，常温反应2h。TLC监测反应结束，加约1mL饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，减压蒸除溶剂后，加约50mL水稀释，乙酸乙酯萃取(15mL×3次)，合并有机相，有机相依次用1N HCl溶液(50mL×1次)、饱和NaHCO₃溶液(50mL×1次)、饱和食盐水(50mL×1次)洗，有机相经无水MgSO₄干燥30min后过滤，减压蒸除滤液得类白色粗产物，乙酸乙酯-石油醚体系重结晶得白色针状固体(1.64g,产率91％)。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.85–7.81(m,2H),7.79(s,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.10(t,J＝8.0Hz,1H),2.41(s,3H),1.36(s,9H)；ESI-MS,m/z:344.34[M-H]^-；C₁₈H₂₀BrNO(345.07)

中间体4-甲基苯甲酰氯(4b)的合成

冰浴条件下，将原料4a(1.00g,7.34mmol)溶于30mL无水DCM(经

分子筛干燥)中，待反应体系冷却后，缓缓滴加草酰氯(5mL,2.0mol/L in DCM)，再滴加2滴DMF，冒出大量气泡，冰浴条件下继续反应约2h。TLC监测反应结束，停止搅拌低温减压蒸除DCM和过量的草酰氯，得无色液体，因其不稳定，未进一步处理，溶于无水DCM后直接投下一步反应。

中间体N-(3-溴-2-甲基苯基)-4-甲基苯甲酰胺(4c)的合成

同中间体3b的合成方法，白色固体，产率53％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.78(d,J＝7.9Hz,3H),7.72(s,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),7.10(t,J＝8.0Hz,1H),2.44(s,3H),2.41(s,3H)；ESI-MS,m/z:302.23[M-H]^-；C₁₅H₁₄BrNO(303.03)

中间体N-(3-溴-2-甲基苯基)-4-乙基苯甲酰胺(5b)的合成

同中间体3b的合成方法，白色固体，产率99％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.07(s,1H),7.91(d,J＝8.1Hz,2H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.33(d,J＝7.8Hz,1H),7.17(t,J＝7.9Hz,1H),2.69(q,J＝7.6Hz,2H),2.27(s,3H),1.21(t,J＝7.6Hz,3H)；ESI-MS,m/z:316.45[M-H]^-；C₁₆H₁₆BrNO(317.04)

中间体4-(叔丁基)-N-[2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基]苯甲酰胺(3c)的合成

于50mL双口瓶中依次加入双联频哪醇硼酸酯(0.18g,0.69mmol)、无水醋酸钾(0.17g,1.73mmol)、Pd(dppf)Cl₂·CH₂Cl₂(44mg,0.017mmol)，依次接球形冷凝管、三通阀、氩气球，安装好装置后，抽真空氩气置换三次；准确称取中间体3b(0.20g,0.58mmol)，将其溶于5mL超干1,4-二氧六环中，超声1min后氩气置换30s，重复此操作三次，将溶液注射入反应瓶中，氩气置换三次，于80℃油浴中反应约10h。TLC监测反应完毕，硅藻土过滤，少量乙酸乙酯洗涤滤饼，减压蒸除滤液，加约60mL水稀释，乙酸乙酯萃取(15mL×3次)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×1次)洗，有机相经无水MgSO₄干燥后过滤，浓缩后得黄棕色油状物，经硅胶柱色谱分离纯化得白色固体(100mg,产率43％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.82(s,1H),7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.55(s,2H),7.53(d,J＝2.2Hz,1H),7.40(s,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),2.37(s,3H),1.32(s,12H),1.31(s,9H)；ESI-MS,m/z:394.65[M+H]⁺；C₂₄H₃₂BNO₃(393.35)

中间体4-(叔丁基)-N-[2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基]苯甲酰胺(4c)的合成

同中间体3c的合成方法，白色固体，产率17％。¹H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.03(d,J＝7.2Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,2H),7.68(s,1H),7.64(dd,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),7.25(d,J＝7.7Hz,1H),2.54(s,3H),2.44(s,3H),1.36(s,12H).ESI-MS,m/z:352.24[M+H]⁺；C₂₁H₂₆BNO₃(351.20)

中间体4-乙基-N-[2-methyl-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基]苯甲酰胺(5c)的合成

同中间体3c的合成方法，白色固体，产率30％。¹H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.03(d,J＝7.1Hz,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,2H),7.71(s,1H),7.64(dd,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝7.7Hz,1H),2.73(q,J＝7.6Hz,2H),2.54(s,3H),1.36(s,12H),1.28(t,J＝7.6Hz,3H)；ESI-MS,m/z:366.56[M+H]⁺；C₂₂H₂₈BNO₃(365.22)

中间体2,4-二氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2)的合成

准备称取原料1(2.00g,10.64mmol)于100mL茄形瓶中，加约30mL二氯甲烷溶解，呈浅绿色混悬液；冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯(2.23g,11.70mmol),搅拌均匀后滴加TEA(2.15g,21.28mmol)，后加入催化量DMAP，溶液先变澄清后出现浅白色丝状物，室温搅拌下反应8h。TLC监测反应结束，加约30mL DCM稀释，1N HCl溶液(50mL×1次)洗、饱和食盐水(50mL×1次)洗，有机相经无水MgSO₄干燥后过滤蒸干得浅黄白色固体，石油醚打浆后过滤得白色固体(3.43g,94％)¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.12(d,J＝4.1Hz,1H),8.03(d,J＝8.4Hz,2H),7.50(d,J＝8.3Hz,2H),6.98(d,J＝4.1Hz,1H),2.38(s,3H)；ESI-MS,m/z:341.86[M+H]⁺；C₁₃H₉Cl₂N₃O₂S(340.98)

中间体2-氯-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(3)的合成

准确称取原料2(1.50g,4.39mmol)于100mL洁净干燥得茄形瓶中，加入约20mL无水乙醇超声使其混悬，成乳白色混悬液；搅拌均匀后加入4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(1.00g,5.26mmol)，溶液变为棕黑色，混匀后加入DIPEA(2.00g,13.08mmol)，80度砂浴反应5h。TLC监测反应完毕，放冷后呈混悬，直接过滤得淡紫色滤饼，滤饼用冷的乙酸乙酯打浆纯化，过滤后真空干燥得类白色固体(1.20g,产率55％)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.86(s,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,2H),7.62(s,1H),7.49–7.36(m,4H),6.95(d,J＝9.1Hz,2H),3.18–3.06(m,4H),2.48–2.42(m,4H),2.38(s,3H),2.22(s,3H)；ESI-MS,m/z:497.03[M+H]⁺；C₂₄H₂₅ClN₆O₂S(496.14)

终产物4-乙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-5)的合成

准确称量中间体5c(50mg,0.14mmol)、中间体3(68mg,0.14mmol)、碳酸铯(0.14g,0.41mmol)、Pd(OAc)₂(31mg,0.14mmol)、PCy₃(0.12g,0.42mmol)于35mL洁净干燥得微波反应管中；加约3mL经超声除氧-氩气置换后的超干DMF和1mL纯净水，预搅拌约2min后，微波反应仪(标准模式)140℃反应25min。TLC监测反应完毕，成黄棕色混悬液；加大量水有灰白色不溶物析出，乙酸乙酯甲醇的混合溶剂(体积比＝10:1)萃取(30mL×3次)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×1次)洗，有机相经无水MgSO₄干燥后过滤，减压浓缩后得白色乳状物，经硅胶柱色谱分离纯化得白色固体(10mg,10％)。m.p.＝246-248℃；¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.68(s,1H),9.85(s,1H),9.14(s,1H),7.94(d,J＝8.1Hz,2H),7.69(d,J＝8.9Hz,2H),7.52(d,J＝6.9Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(s,1H),7.28(t,J＝7.7Hz,1H),7.22–7.18(m,1H),6.91(d,J＝9.1Hz,2H),6.71(s,1H),3.10–3.07(m,4H),2.69(q,J＝7.6Hz,2H),2.47–2.44(m,4H),2.34(s,3H),2.22(s,3H),1.22(t,J＝7.6Hz,3H)；¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ165.84,159.91,151.85,148.07,142.36,137.41,132.81,132.63,128.32,128.23,127.14,125.43,122.37,116.16,101.78,99.32,55.16,49.18,46.20,28.55,15.88,15.86；ESI-MS,m/z:546.35[M+H]⁺；C₃₃H₃₅N₇O(545.29)

终产物4-叔丁基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-3)的合成

同终产物W-5的合成方法，得黄色油状物，将其溶于甲醇、水、四氢呋喃的混合溶液中，加入3倍当量的LiOH搅拌，加水后析出白色固体，经硅胶柱色谱分离纯化后得白色固体，产率12％。m.p.＝244-246℃；¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.73(s,1H),9.89(s,1H),9.19(s,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,2H),7.70(d,J＝8.8Hz,2H),7.56–7.53(m,2H),7.52(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.37(d,J＝7.1Hz,1H),7.28(d,J＝7.7Hz,1H),7.23–7.20(m,1H),6.91(d,J＝9.1Hz,2H),6.72(s,1H),3.09(s,4H),2.51(s,4H),2.34(s,3H),2.26(s,3H),1.32(s,9H)；¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ165.34,154.36,153.48,151.33,146.50,136.90,132.56,132.43,131.87,127.91,127.54,126.73,125.22,125.04,122.06,121.73,115.75,101.31,98.84,54.50,48.62,45.48,34.70,30.97,15.48；ESI-MS,m/z:574.40[M+H]⁺；C₃₅H₃₉N₇O(573.32)

终产物4-甲基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-4)的合成

同终产物W-5的合成方法，白色固体，产率12％。m.p.＝241-243℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.70(s,1H),9.86(s,1H),9.16(s,1H),7.93(d,J＝8.1Hz,2H),7.70(d,J＝8.9Hz,2H),7.53(d,J＝6.9Hz,1H),7.35(t,J＝9.0Hz,3H),7.28(t,J＝7.7Hz,1H),7.23–7.19(m,1H),6.91(d,J＝9.0Hz,2H),6.72(s,1H),3.11–3.05(m,4H),2.48–2.43(m,4H),2.39(s,3H),2.34(s,3H),2.22(s,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ165.81,153.99,151.81,147.13,142.35,141.91,137.37,133.05,132.80,132.27,129.40,128.36,128.15,127.23,125.48,122.48,122.29,116.16,101.78,99.33,55.15,49.15,46.20,21.49,15.93；ESI-MS,m/z:532.56[M+H]⁺；C₃₂H₃₃N₇O(531.27)

实施例2：化合物W-2的合成

中间体2-氯-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-4-胺(2c)的合成

准确称取原料2a(0.40g,2.68mmol)于50mL茄形瓶中，加约10mL无水乙醇溶解，不溶，超声后呈白色混悬液，加入DIEA(0.87g,8.05mmol)搅拌均匀后，再加入原料2b(0.40g,2.23mmol)于反应瓶中，溶液变为棕色混悬液，70℃砂浴反应4h。TLC监测反应结束，静置放冷，有沉淀析出，直接过滤，滤饼用少量冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥得黄绿色固体(0.48g，产率60％)。

终产物4-(叔丁基)-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺(W-2)的合成

准确称量中间体3c(0.10g,0.25mmol)、中间体2c(74mg,0.25mmol)、碳酸铯(0.25g,0.25mmol)、Pd(OAc)₂(23mg,0.10mmol)、PCy₃(84mg,0.30mmol)于35mL洁净干燥得微波反应管中；加约2.5mL经超声除氧-氩气置换后的超干DMF和0.5mL纯净水，预搅拌约2min后呈黄色混悬液，内有白色不溶物，微波反应仪标准模式下140℃反应25min。TLC监测反应完毕，变成灰黑色混悬液；加大量水有灰白色不溶物析出，乙酸乙酯甲醇的混合溶剂(体积比＝10:1)萃取(30mL×3次)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×1次)洗，有机相经无水MgSO₄干燥后过滤，减压浓缩后得浅绿色，经硅胶柱色谱分离纯化得白色固体，乙酸乙酯-石油醚体系重结晶后得白色固体(32mg,产率24％)。m.p.＝238-240℃；¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.90(s,1H),9.43(s,1H),8.31(d,J＝5.9Hz,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.51–7.45(m,3H),7.39(d,J＝7.1Hz,1H),7.30(t,J＝7.7Hz,1H),6.91(d,J＝9.0Hz,2H),6.63(d,J＝6.0Hz,1H),3.07(s,4H),2.44(s,4H),2.29(s,3H),2.21(s,3H),1.32(s,10H)；¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ165.35,154.41,140.82,137.01,132.59,131.76,127.53,125.23,115.91,48.61,34.70,30.97,15.35；ESI-MS,m/z:536.26[M+H]⁺,m/z:1069.89[2M+H]⁺；C₃₃H₃₈N₆O(534.31)

实施例3：终产物W-19的合成

中间体4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-酰氯(19b)的合成

同中间体4b的合成方法，淡黄色固体，未进一步处理，溶于无水DCM后直接投下一步反应。C₉H₉ClOS(200.01)

中间体N-(3-溴-2-甲基苯基)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(19c)的合成

同中间体3b的合成方法，白色固体，产率80％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.07(s,1H),7.71(s,1H),7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.29(d,J＝7.8Hz,1H),7.16(t,J＝7.9Hz,1H),2.75(t,J＝5.4Hz,2H),2.60(t,J＝5.4Hz,2H),2.25(s,3H),1.82–1.71(m,4H)；ESI-MS,m/z:348.23[M-H]^-；C₁₆H₁₆BrNOS(349.01)

中间体N-(2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(19d)的合成

同中间体3c的合成方法，类白色固体，产率49％。¹H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.00(d,J＝7.9Hz,1H),7.61(dd,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.47(s,1H),7.31(s,1H),7.23(t,J＝7.7Hz,1H),2.81(t,J＝6.1Hz,2H),2.64(t,J＝6.1Hz,2H),2.52(s,3H),1.89–1.85(m,2H),1.82(m,J＝8.2,3.1,2.6Hz,2H),1.35(s,12H)；ESI-MS,m/z:398.42[M+H]⁺；C₂₂H₂₈BNO₃S(397.19)

终产物N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(W-19)的合成

同终产物W-5的合成方法，二氯甲烷-石油醚体系重结晶得白色固体，产率60％。m.p.＝200-202℃；¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.61–9.53(m,2H),9.38(s,1H),7.69(dd,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.64–7.56(m,3H),7.50–7.41(m,2H),7.12(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),6.95–6.90(m,2H),6.88(d,J＝7.6Hz,1H),3.17(t,J＝7.1Hz,4H),2.82–2.76(m,2H),2.73(t,J＝6.9Hz,2H),2.61(t,J＝7.0Hz,4H),2.38(s,2H),2.27(s,2H),1.83–1.68(m,4H)；¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ162.53,158.16,153.98,152.15,145.65,143.36,137.25,136.94,135.36,135.17,134.26,129.44,125.39,125.10,125.03,124.82,124.19,122.17,115.01,107.13,100.29,54.04,48.81,44.57,27.06,25.13,23.05,22.84,13.45；ESI-MS,m/z:578.24[M+H]⁺；C₃₃H₃₅N₇OS(577.26)

实施例4：通式(Ι)和通式(II)所示化合物对Ramos细胞增殖抑制实验

采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测抗细胞增殖活力，WST-8能在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐(1-Methoxy PMS)存在下被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成水溶性的甲瓒(Formazan)，溶于培养基中显橙色。在一定细胞数量范围内，形成甲瓒的量与活细胞的数量成正比，故通过测定其在450nm处的OD值，反应活细胞数量。

取对数生长期的Ramos细胞，经细胞计数后将细胞悬液密度调整为1.5×10⁵个/mL。

将100μL混匀的细胞悬液沿孔壁加至透明的96孔板，为避免边缘效应，在96孔板最外圈每孔加100μL PBS，培养箱中稳定2h。

用培养基将化合物储备液进行梯度稀释，浓度为6.25μM-200μM，每孔加化合物10μL，轻轻敲击板以帮助其混匀；每个化合物设置6个浓度，每个浓度设置5个副孔，并设置不加化合物的100％对照组和不加化合物不加细胞的空白对照组。(第一次实验设置0.01％DMSO组和只加化合物和培养基的药物吸收组)

37℃、5％CO₂、95％湿度培养箱中培养24h。

避光条件下，沿孔壁向每孔中加10μL的CCK-8溶液，轻轻敲击以帮助混匀，避光条件下在培养箱中继续孵育4h。

利用多模式微孔板检测***测量其在450nm和650nm处的吸光度值。细胞存活率的计算公式如下：

通过公式计算化合物在10μM浓度下对Ramos细胞增殖毒性，选取较优化合物计算不同浓度化合物对Ramos细胞的增殖毒性，利用GraphPad Prism 8拟合曲线，通过[Inhibtor]vs normalized response–Variable Slope分析计算化合物的IC₅₀值。

表1化合物在10μM浓度下对Ramos细胞增殖抑制率

我们选择了高表达BTK的Ramos细胞，对目标化合物进行了抗增殖活性实验。实验结果表明，溶剂暴露区结构改造使活性升高；铰链区引入稠杂环使活性降低；口袋区R₁为吸电子基取代时，活性较优；X为磺酰胺时活性较优。后续我们选择了抑制率最优的化合物W-10测定了其对Ramos细胞的抗增殖活性的IC₅₀，其IC₅₀值为21μM，优于阳性药。

实施例5：通式(Ι)所示化合物W-10对hPBMC毒性实验

因所设计化合物适应症为类风湿性关节炎等非生命威胁类的疾病，故我们测试了化合物对正常人的淋巴细胞毒性，本实验利用台盼蓝染色显微计数及CCK-8法联合使用验证化合物对hPBMC毒性。

培养约48h，倒置显微镜下观察细胞状态良好。

根据文献报道，经细胞计数后将细胞悬液调整为3×10⁵个/mL。

实验分为两组，分别在96孔板和24孔板中进行。对于96孔板来说，每孔加100μL混匀后的细胞悬液。对于24孔板来说，每孔加约500μL混匀后的细胞悬液。37℃、5％CO₂、95％湿度培养箱稳定约1h。

用培养基将化合物储备液进行梯度稀释，浓度为6.25μM-200μM，96孔板每孔加化合物10μL(24孔板每孔加50μL)，轻轻敲击板以帮助其混匀。化合物W-10设置6个浓度，每个浓度设置5个副孔(24孔板为1个副孔)，并设置不加化合物的100％对照组和空白对照组。

37℃、5％CO₂、95％湿度培养箱中培养48h。

对于96孔板，避光条件下，沿孔壁向每孔中加10μL的CCK-8溶液，轻轻敲击以帮助混匀，37℃、5％CO₂培养箱孵育4h，利用酶标仪检测在450nm和650nm处的吸光度值。计算公式如下，

对于24孔板来说，轻轻吹打混匀，取100μL细胞悬液加约10uL过滤后的台盼蓝溶液，染色5min。吸取10μL经染色的细胞，利用计数仪进行计数，计算细胞存活率，进而计算活细胞数。

因所设计化合物适应症为类风湿性关节炎等非生命威胁的疾病，需长期用药，故我们选择最优化合物W-10，测定其对正常淋巴细胞的毒性。实验结果表明，化合物W-10浓度在12μM浓度以内对正常淋巴细胞的毒性低于阳性药，且细胞活力维持在80％以上；化合物浓度升高至25μM浓度及以上时，对正常淋巴细胞毒性升高，细胞活力明显降低。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种化合物，所述化合物具有如式(I)所示的结构通式：

其中R₁是4-甲基，4-乙基，4-三氟甲基，4-异丙基，4-环丙基，4-甲氧基，4-叔丁基，4-二甲氨基，4-氰基，2,4-二甲基，3-三氟甲基，2-氟-4-三氟甲基中的任意一种；R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为-NHCO-、-SO₂NH-、-COO-中的任意一种。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(II)所示：

其中，所述R₂选自甲基、氰基、氢原子、氟原子中的任意一种；X为-NHCO-、-SO₂NH-、-COO-中的任意一种。

3.如权利要求1-2任一项所述化合物，其特征在于，所述化合物的结构为下列结构式中任意一种：

4-叔丁基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-甲基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-乙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

4-异丙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-甲氧基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-环丙基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-二甲氨基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

4-氰基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

2,4-二甲基-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯甲酰胺；

2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]吡啶-2-基}-N-[4-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-3-(三氟甲基)苯甲酰胺；

2-氟-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯磺酰胺；

4-(叔丁基)-N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}苯磺酰胺；

2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基-4-苯甲酸叔丁酯；

N-{2-甲基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；

N-{3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

N-{2-氟-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

N-{2-氰基-3-{4-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基}苯基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺。

4.权利要求1-3任一项所述化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

a)当所述化合物为式(I)所示化合物时，其合成路线为：

；或，

b)当所述化合物为式(II)所示化合物时，其合成路线如下：

5.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1-3任一项所述化合物。

6.一种药物制剂，其特征在于，其包含权利要求1-3任一项所述化合物和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。

7.权利要求1-3任一项所述化合物或者权利要求5所述药物组合物或权利要求6所述药物制剂在制备抑制布鲁顿酪氨酸激酶过表达药物或试剂中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述化合物或者权利要求5所述药物组合物或权利要求6所述药物制剂在制备治疗与布鲁顿酪氨酸激酶过表达相关疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述权利要求1-3任一项所述化合物或者权利要求5所述药物组合物或权利要求6所述药物制剂在制备治疗与布鲁顿酪氨酸激酶过表达相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为自身免疫***疾病。

10.如权利要求8所述权利要求1-3任一项所述化合物或者权利要求5所述药物组合物或权利要求6所述药物制剂在制备治疗与布鲁顿酪氨酸激酶过表达相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎。

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