CN113577255B - 肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途 - Google Patents

肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途。本发明的肿瘤纳米疫苗是由酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物与肿瘤相关抗原/抗原肽所构成的复合纳米胶束，所述酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物具有如下式1所示的结构。本发明的肿瘤纳米疫苗能够选择性靶向***并将肿瘤新生抗原和免疫佐剂高效递送到树突细胞，激活抗原特异性T细胞免疫效应，高效抑制肿瘤生长和转移。

Description

肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种可用于共递送肿瘤相关抗原和免疫佐剂的纳米疫苗，其制备方法以及在肿瘤免疫治疗方面的应用。
背景技术
近年来，免疫治疗在恶性肿瘤临床治疗中取得了重大突破，显著改善了肿瘤患者的生存期及生活质量，为肿瘤患者带来了新的希望。以肿瘤新生抗原(neoantigen)为代表的的肿瘤相关抗原可激活肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应，有望用于个性化免疫治疗。基于肿瘤相关抗原的肿瘤免疫治疗也因此受到了广泛关注。激活机体的抗肿瘤免疫效应需要通过抗原递呈细胞，尤其是树突细胞(dendritic cells，DCs)摄取抗原，加工处理后呈递给初始T细胞，实现T细胞的激活，从而产生细胞毒性T细胞，实现肿瘤细胞的免疫清除。DCs是激活抗肿瘤免疫过程中的关键免疫细胞。然而，肿瘤新生抗原属于多肽分子，其血清稳定性差且不易靶向***。同时，实体瘤存在免疫抑制微环境，严重抑制DCs抗原识别和提呈功能。
免疫佐剂可调节机体免疫细胞功能，对肿瘤免疫治疗发挥辅助性作用。其中，Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂可促进DCs对抗原的交叉呈递以激活肿瘤特异性T淋巴细胞。同时，干扰素基因刺激物(stimulator of interferon genes,STING)激动剂通过刺激DCs分泌I型干扰素，可有效增强DCs对抗原的交叉呈递作用。此外，STING激动剂与TLR激动剂等可促进DCs对其他炎性细胞因子的分泌，改善细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的清除能力，从而改善肿瘤免疫治疗效果。但是小分子免疫佐剂体内代谢行为不佳，生物利用度较低且缺乏***和肿瘤靶向特性，制约其临床转化应用。
发明内容
针对如何实现肿瘤相关抗原和小分子免疫佐剂高效递送的关键技术瓶颈，本发明的目的在于提供一种可用于共递送肿瘤新生抗原和免疫佐剂的纳米疫苗，及其制备方法和在抗肿瘤免疫治疗方面的应用。
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种肿瘤纳米疫苗，其是一种或多种由酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物与肿瘤相关抗原或抗原肽所构成的复合纳米胶束，
其中，所述肿瘤相关抗原/抗原肽是指肿瘤相关基因变异所产生的具有免疫原性的蛋白/蛋白片段肽或衍生肽，以及致瘤病毒基因相关的具有免疫原性的蛋白/蛋白片段肽或衍生肽；
所述酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物具有如下式1所示的结构：
其中，在式1中，
R1选自N,N-二乙基氨基、N,N-二丁基氨基、N,N-二异丙基氨基、五亚甲基氨基、六亚甲基氨基；
R2为衍生自免疫佐剂的基团；
R3为CnH2n+1的烷基，n为3-12的整数；
R4选自其中Ligand为衍生化的树突状细胞靶向配体；
Linker为R2与羰基之间的连接链，该连接链与羰基之间形成p,π-共轭连接；
x为10-145的整数，优选100-140的整数；
y为20-60的整数，优选40-50的整数；
z为0-60的整数，优选1-10的整数。
在具体实施方式中，R1选自N,N-二丁基氨基、N,N-二异丙基氨基或六亚甲基氨基；R3为CnH2n+1的烷基，n为12；x为113；y为40、42、50；z为0、3或5。
在具体实施方式中，所述Ligand具有下式2所示的结构：
在具体实施方式中，所述Linker选自以下结构中的任意一种：
在具体实施方式中，所述免疫佐剂包括：选自STING激动剂和TLR激动剂中任意一种。
在具体实施方式中，所述免疫佐剂R2选自以下基团中的任意一种：
在具体实施方式中，所述酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物选自以下各项中的一种或多种：
在具体实施方式中，所述述肿瘤相关抗原/抗原肽包括但不限于具有免疫原性的卵清蛋白抗原肽段、人***瘤病毒抗原肽。所述具有免疫原性的卵清蛋白抗原肽段可以具有不同氨基酸序列。在具体实施方式中，所述卵清蛋白抗原肽段包括：氨基酸序列为SIINFEKL的卵清蛋白多肽或其盐(例如，三氟醋酸盐)，氨基酸序列为SIIGFEKL的卵清蛋白G4肽或其盐(例如，三氟醋酸盐)。
在具体实施方式中，相对于所述复合纳米胶束的重量，所述肿瘤相关抗原/抗原肽的负载质量比为1-90wt％。
另一方面，本发明提供一种上述肿瘤纳米疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：
将上述酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物和烷基化的己二醇二丙烯酸酯衍生物溶于有机溶剂中，在超声处理下加入含肿瘤相关抗原/抗原肽的溶液，接着进行超滤或透析获得所述肿瘤纳米疫苗。
在具体实施方式中，所述烷基化的己二醇二丙烯酸酯衍生物为C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯。
在具体实施方式中，所述有机溶剂包括：四氢呋喃、甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲亚砜中的至少一种。
在具体实施方式中，所述含肿瘤相关抗原/抗原肽的溶液使用溶剂DMSO和/或水配制。
再一方面，本发明还提供了一种所述肿瘤纳米疫苗在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途，所述恶性肿瘤包括但不限于：乳腺癌、***、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或***癌。
有益效果
本发明的肿瘤纳米疫苗，能够选择性靶向***并将包括肿瘤新生抗原在内的肿瘤相关抗原和免疫佐剂高效递送到DCs，激活抗原特异性T细胞免疫效应，高效抗肿瘤生长和转移。该纳米疫苗中酸敏性的聚合物使之具有酸敏性，在溶酶体中酸性条件下可发生质子化从而实现溶酶体逃逸功能，避免溶酶对抗原肽的降解。共递送小分子免疫佐剂可增强DCs的抗原加工和呈递性能，有效激活细胞毒性T细胞免疫效应。
附图说明
图1：在本发明的制备实施例2中制备的mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)的核磁谱图。
图2：在本发明的制备实施例3中制备的Mannose-PEG113-b-PDPA40的核磁谱图。
图3：在本发明的制备实施例4中制备的mPEG113-b-P(DPA42-co-FAA3)的核磁谱图。
图4：在本发明的制备实施例5中制备的纳米疫苗PDPR@OVA及Man-PDPR@OVA的a)动态光散射粒径分布图及b)扫描电镜照片(图中标尺为100nm)。
图5：本发明制备的纳米胶束的结构示意图。
图6：a)OVA标准曲线；b)甘露糖修饰的R848-OVA纳米疫苗中OVA的载药量与纳米疫苗中PDPE含量的关系(PDPE即为C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯)。
图7：本发明的肿瘤纳米疫苗对B16-OVA小鼠移植瘤的生长抑制曲线。
具体实施方式
通过下列实例举例对本发明的进行说明，但本发明的保护范围不局限于此。
以下实施例中所用试剂及仪器如下：
甲氧基封端的聚乙二醇胺5000、聚乙二醇二胺5000、2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯、雷西莫特(R848)、米托拉酮(FAA)、4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸均购自西格玛奥德里奇(中国)公司。4-异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷购自百灵威科技有限公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
卵清蛋白抗原肽SIINFEKL(下文称为“OVA抗原肽”)购自国肽生物。B16-OVA黑色素瘤细胞购自中科院上海细胞库，细胞培养用DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
4-5周龄的Balb/c白鼠及C57BL/6黑鼠均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并通过于小鼠右背部接种体外培养的B16-OVA黑色素瘤癌细胞构建荷B16-OVA肿瘤的荷瘤小鼠模型。整个动物实验的操作过程均严格遵循上海药物研究所动物护理与使用委员会的相关规定。
样品数据由以下仪器测定：核磁共振氢谱(1H-NMR)用Varian-MERCURY Plus-400核磁共振仪，以TMS为内标，化学位移单位为ppm-1；
阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位由MALVERN NANO SIZER型粒径测定仪测定透射电镜照片由Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射电子显微镜获得。
在本发明中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。
制备实施例1：PEG化Raft引发剂mPEG113-CTA的合成
将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(CTA)(19.3mg,0.048mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(27.5mg,0.144mmol)，1-羟基苯并***(HOBT)(19.4mg,0.144mmol)，三乙胺(TEA)(16.16mg,0.160mmol)室温下反应1.5h。随后，向其中加入mPEG113-NH2(200.8mg,0.040mmol),室温反应24h后，反应液以乙醇和去离子水透析，透析袋截留分子量为3500D，冻干后获得淡黄色粉末状固体182mg，产率84.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.84–3.80(m,3H),3.69–3.62(m,456H),3.56(dd,J＝9.9,5.1Hz,6H),3.47(dd,J＝9.2,4.7Hz,6H),3.39(s,3H),3.35–3.30(m,2H),2.51(d,J＝3.9Hz,3H),1.69(dt,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.45–1.36(m,4H),1.35–1.28(m,8H),1.26(s,12H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).
制备实施例2：雷西莫特聚合物偶联物mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)的合成
将化合物1(6.0g,0.04mol)，TEA(8.08g,0.08mol)溶于10mL二氯甲烷中，冰水浴下，向其中缓慢滴加10mL甲基丙烯酰氯(2.08g,0.08mol)的二氯甲烷溶液，滴毕，室温反应12h。反应液以水洗，二氯甲烷萃取后，无水硫酸钠干燥，柱分离后得3.8g化合物2，产率87.2％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.15(s,1H),5.64–5.55(m,1H),4.35–4.30(m,2H),3.79–3.75(m,2H),3.75–3.71(m,2H),3.69(s,4H),3.64–3.60(m,2H),1.96(s,3H).
将化合物2(0.20g,0.91mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(354mg,2.75mmol)溶于10mL四氢呋喃中，冰水浴下向其中加入二(对硝基苯)碳酸酯(NPC)(418mg,1.37mmol)，室温下反应12h。反应完毕后，反应液先后以水，饱和氯化铵溶液洗涤，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，柱分离获得285mg化合物3，产率81.8％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(d,J＝9.2Hz,2H),7.40(d,J＝9.2Hz,2H),6.14(s,1H),5.59(s,1H),4.47–4.43(m,2H),4.35–4.31(m,2H),3.85–3.81(m,2H),3.80–3.76(m,2H),3.72(s,4H),1.96(s,3H).
将化合物3(80mg,0.21mmol),雷西莫特(55mg,0.17mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，向其中加入1-羟基苯并***(HOBT)(35.1mg,0.26mmol)，室温下反应12h。反应完毕后，旋去溶剂，反应液以水洗，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后，柱分离得72mg化合物4，产率77.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47(s,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(dd,J＝11.3,4.1Hz,1H),7.49–7.43(m,1H),6.12(s,1H),5.59–5.53(m,1H),4.90(s,2H),4.78(s,2H),4.46–4.40(m,2H),4.30–4.24(m,2H),3.84–3.79(m,2H),3.77(dd,J＝5.5,4.2Hz,2H),3.71(s,4H),3.64(q,J＝7.0Hz,2H),3.35(s,1H),1.93(s,3H),1.33(s,6H),1.25(t,J＝7.0Hz,3H).
将化合物4(65mg,0.12mmol)，mPEG113-CTA(89.5mg,16.6μmol),2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸(DPA)(177mg,0.83mmol)及偶氮二异丁腈(AIBN)(0.27mg,1.7μmol)溶于1mL无水二氧六环(Dioxane)中，通过三次冻融循环除去体系中氧气，随后在70℃下反应24h。反应结束后，反应液以乙醇及去离子水透析后冻干，透析袋截留分子量为3500D，得210mg淡黄白色固体mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)，产率75.8％。1H-NMR如图1所示。
制备实施例3：甘露糖衍生化聚合物Mannose-PEG113-b-PDPA40的合成
将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(CTA)(19.7mg,0.048mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(28.1mg,0.144mmol)，1-羟基苯并***(19.8mg,0.144mmol)，三乙胺(16.2mg,0.160mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温下反应2h后，向其中加入NH2-PEG113-NH2(201.2mg,0.040mmol)，室温下反应24h。反应完毕后，反应液以乙醇及去离子水透析，透析袋截留分子量为3500D，182mg淡黄白色固体粉末NH2-PEG113-CTA，产率84.5％。
将所获得的NH2-PEG113-CTA(100mg,0.019mmol),2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸(DPA)(237.3mg,1.114mmol)及偶氮二异丁腈(AIBN)(0.31mg,0.0019mmol)溶于1mL无水二氧六环中，通过三次冻融循环除去体系中氧气，随后在70℃下反应24h。反应结束后，反应液以乙醇及去离子水透析后冻干，透析袋截留分子量为3500D。所得NH2-PEG113-b-DPA40溶解于3ml N,N-二甲基甲酰胺中，向其中加入化合物5(6.3mg,0.02mmol)及N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(2.6mg,0.02mmol)后室温下反应24h。反应完毕后，反应液以乙醇及去离子水透析(透析袋截留分子量为3500D)，冻干后所得淡黄色固体即为Mannose-PEG113-b-DPA40。1H-NMR如图2所示。
制备实施例4：FAA衍生化聚合物mPEG113-b-P(DPA42-co-FAA3)的合成
将化合物6(192.5mg,1.55mmol)，三乙胺(TEA)(303.5mg,3.00mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，冰水浴下向其中缓慢滴加2mL甲基丙烯酰氯(104.5mg,1.00mmol)的二氯甲烷溶液。加毕，室温下反应12h。反应液旋干后，柱分离获得289mg化合物7，产率97.0％。
将所获得的化合物7(288.3mg,1.50mmol)溶于无水二氯甲烷中，向其中加入FAA(282.5mg,1.00mmol),2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(1.140g,3.0mmol)及三乙胺(TEA)(303.5mg,3.00mmol)，室温下反应12h。反应完毕后，反应液以水洗，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后旋干，柱分离得270mg化合物8，产率59.4％。
将化合物8(260.2mg,0.296mmol)，mPEG113-CTA(100.4mg,0.019mmol),2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸(DPA)(237.3mg,1.114mmol)及偶氮二异丁腈(AIBN)(0.31mg,0.0019mmol)溶于1mL无水二氧六环中，通过三次冻融循环除去体系中氧气，随后在70℃下反应24h。反应结束后，反应液以乙醇及去离子水透析后冻干，透析袋截留分子量为3500D，得295mg淡黄白色固体mPEG113-b-P(DPA40-co-FAA10)，产率84.3％。1H-NMR如图3所示。
制备实施例5：纳米疫苗的制备
将OVA抗原肽DMSO溶液分散于纯水中配置为OVA水溶液，浓度1mg/mL,将制备实施例2中制备的聚合物mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)和C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯(PDPE)溶于四氢呋喃后，在超声条件下逐渐加入至OVA抗原肽水溶液中。随后，超滤离心1h，除去体系中的游离肽及四氢呋喃(超滤离心管截留分子量为50000D)，所得即为纳米疫苗PDPR@OVA。
将OVA抗原肽DMSO溶液分散于纯水中配置为OVA水溶液，浓度1mg/mL。将制备实施例2和3中制备的聚合物mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483),Mannose-PEG113-b-DPA40和C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯(PDPE)溶于四氢呋喃后，在超声条件下逐渐加入至OVA抗原肽水溶液中。随后，超滤离心1h，除去体系中的游离肽及四氢呋喃(超滤离心管截留分子量为50000D)，所得即为纳米疫苗Man-PDPR@OVA。利用动态光散射仪分别测定胶束流体力学半径，同时通过透射电子显微镜照片确定其形貌，测试结果如图4所示。
如图4所示，所形成的两种纳米疫苗的平均水化粒径分别为46.28nm和43.30nm，其透射电子显微镜照片所示平均粒径接近70nm，表明该体系均可以形成具有良好物理形态的纳米颗粒，甘露糖化修饰对纳米胶束的粒径无明显影响。
制备的纳米胶束的结构示意图如图5所示。
测试实施例1：纳米疫苗中OVA含量的测定
将游离OVA抗原肽溶于甲醇溶液中，分别配制成浓度为4,8,16,32,64,128μg/mL的溶液，利用高效液相色谱测定其在280nm波长下吸收面积，绘制标准曲线，如图6a所示。将制备实施例5中所制备的纳米胶束PDPR@OVA冻干后称取1mg，以2mL甲醇溶解后，过0.22μm滤膜除去不溶物后利用相同的色谱条件测定其中OVA抗原肽的含量，测试结果如图6b所示。
测试结果显示，纳米胶束PDPR@OVA中的C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯(PDPE)的含量对纳米颗粒抗原肽的负载量有显著影响，随着C14链烷基化的己二醇二丙烯酸酯(PDPE)含量的增加，纳米颗粒对抗原肽负载能力逐渐增加，最高可达约70％。
测试实施例2：纳米疫苗对B16-OVA移植瘤荷瘤鼠的肿瘤增殖抑制
于C57BL/6鼠右背部接种B16-OVA细胞后，当肿瘤体积达到50mm3左右时将小鼠随机分为5组，每组6只，组别分别为PBS；OVA；PDPR；PDPR@OVA；Man-PDPR@OVA，每七天给药1次，给药两次，每三天记录一次肿瘤的体积，测试结果如图7所示。图7中，OVA组为游离抗原肽,给药剂量2.5mg/kg；PDPR组为雷西莫特聚合物所形成的纳米胶束组，给药给药剂量等效为雷西莫特1mg/kg；PDPR@OVA组为同时负载雷西莫特及抗原肽的纳米疫苗，给药剂量等效为雷西莫特1mg/kg,OVA 2.5mg/kg；Man-PDPR@OVA组为甘露糖官能化的负载雷西莫特及抗原肽的纳米疫苗，给药剂量等效为雷西莫特1mg/kg,OVA2.5mg/kg，除R848组为腹腔给药外，其他组别给药方式均为足垫皮下注射。
测试结果显示，同时负载雷西莫特及抗原肽的纳米疫苗均可有效抑制B16-OVA肿瘤的生长，表明Toll样受体激动剂可显著促进机体免疫***对抗原肽的识别，实现对B16-OVA移植瘤的生长抑制。通过甘露糖的官能化后，纳米颗粒对B16-OVA移植瘤的生长抑制作用可得到有效增强。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途
<130> DI20-0473-XC03
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 卵清蛋白多肽
<400> 1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 卵清蛋白G4肽
<400> 2
Ser Ile Ile Gly Phe Glu Lys Leu
1 5

Claims (7)

1.一种肿瘤纳米疫苗，其是由一种或多种酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物与肿瘤相关抗原/抗原肽所构成的复合纳米胶束，
其中，所述肿瘤相关抗原/抗原肽是指肿瘤相关基因变异所产生的具有免疫原性的蛋白/蛋白片段肽或衍生肽，以及致瘤病毒基因相关的具有免疫原性的蛋白/蛋白片段肽或衍生肽，
所述酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物选自以下各项的一种或多种：
并且所述肿瘤相关抗原/抗原肽为具有免疫原性的卵清蛋白抗原肽段，并且所述肿瘤为黑色素瘤。
2.根据权利要求1所述的肿瘤纳米疫苗，其中，
所述卵清蛋白抗原肽段包括：氨基酸序列为SIINFEKL的卵清蛋白多肽或其盐。
3.根据权利要求1所述的肿瘤纳米疫苗，其中，
所述卵清蛋白抗原肽段包括：氨基酸序列为SIIGFEKL的卵清蛋白G4肽或其盐。
4.根据权利要求2或3所述的肿瘤纳米疫苗，其中，
所述盐为三氟醋酸盐。
5.根据权利要求1所述的肿瘤纳米疫苗，其中，
相对于所述复合纳米胶束，所述肿瘤相关抗原/抗原肽的负载质量比为1-90wt％。
6.一种如权利要求1至5中任一项所述的肿瘤纳米疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：
将权利要求1所述的酸敏感性聚合物免疫佐剂偶联物和烷基化的己二醇二丙烯酸酯衍生物溶于有机溶剂中，在超声处理下加入含肿瘤相关抗原/抗原肽的溶液，接着进行超滤或透析获得所述肿瘤纳米疫苗。
7.一种如权利要求1至5中任一项所述的肿瘤纳米疫苗在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途，所述恶性肿瘤为黑色素瘤。
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