CN115414494B - 一种多肽类纳米疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多肽类纳米疫苗及其制备方法，多肽类纳米疫苗包括载体和负载于所述载体上的佐剂，所述载体为β‑环糊精修饰的聚乙烯亚胺和抗原肽通过交联剂交联得到的纳米颗粒，所述交联剂为还原响应型交联剂。该多肽类纳米疫苗可实现抗原肽和佐剂共同递送，可在***高效富集，并且可以在细胞内还原性条件下裂解释放出多肽抗原，能充分刺激抗原呈递细胞、增强抗原的交叉呈递，提高免疫应答。该多肽类纳米疫苗原料价格低易获得，制备方法简单，对所有肽类抗原均通用，有良好的应用前景。

Description

一种多肽类纳米疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种多肽类纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
疫苗对保障人类健康，改善生活质量和促进社会发展做出了巨大的贡献。
疫苗一般分为两类：预防性疫苗和治疗性疫苗。熟知的预防性疫苗主要用于疾病的预防，接收者为健康个体或新生儿，例如百白破疫苗、新型冠状病毒肺炎疫苗等；治疗性疫苗主要用于患病的个体，接受者为患者，是在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品，例如治疗性乙肝疫苗、治疗性胰腺癌疫苗等，属于特异性主动免疫疗法。目前，治疗性疫苗主要包括亚单位疫苗、免疫复合物型疫苗、多肽类疫苗等。
近年来，全球恶性肿瘤的发病率及死亡率，每年保持约3.9％和2.5％的增幅，且恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，寻求有效提高癌症患者生存率，改善患者生存质量的治疗方式已成为一大研究难点。此时，以免疫学为基础的肿瘤免疫疗法在癌症治疗领域展现出了极大优势。肿瘤免疫疗法是利用机体免疫***特异性杀伤肿瘤细胞的治疗方法，该方法可以抑制肿瘤生长并使机体产生免疫记忆，可有效抑制恶性肿瘤的增殖、转移和复发，目前主要包括单克隆抗体治疗、过继细胞疗法和肿瘤疫苗等。
肿瘤疫苗可以利用DNA、RNA、蛋白质或肽等肿瘤相关抗原（TAA）去调节免疫***。在疫苗进入人体后，抗原会被存在于外周的巨噬细胞或树突状细胞（DCs）等抗原呈递细胞（APCs）表面的模式识别受体（PRRs）识别，将其转运至引流***或脾脏等免疫器官。由于抗原的不同，有的直接被B细胞识别，有的呈递给免疫器官中的T细胞，产生针对不同肿瘤抗原的特异性T细胞，也能重新激活休眠和失能的T细胞，从而激发新的或促进已有的抗肿瘤免疫反应，实现诱导并增强肿瘤特异性T细胞对癌症的应答。且这种免疫不同于免疫检查点阻断诱导的广泛免疫，肿瘤疫苗可以实现对肿瘤的精确免疫。近年来***、***癌等相关肿瘤疫苗也已有上市产品。
利用肿瘤表面特异性抗原多肽制备的多肽疫苗，提供了靶向特定表位的最直接方式，多肽疫苗含有的特定多肽表位由T细胞受体识别，可以刺激产生肿瘤特异性T细胞，精准杀伤肿瘤，减轻自身的不良炎症反应。
随着癌症共享抗原和突变源抗原的鉴定，预计多肽癌症疫苗的应用范围将大为扩展，有很大的造福患者的潜力。且基于抗原多肽的癌症疫苗安全性高、易于制造，且它们可以直接监测T细胞对抗原肽的CD4+和CD8+T细胞反应，这一点在疫苗开发中非常关键。
但目前基于多肽的肿瘤疫苗大多存在以下几个问题：第一抗原肽容易在递送中途被降解；第二难以共递送免疫佐剂，而在没有免疫佐剂的情况下，未成熟的抗原呈递细胞与抗原接触后触发免疫反应的几率较低。第三，多肽类疫苗的抗原肽序列多样，理化性质各异，现有的载体难以适用于所有的肽类抗原。
发明内容
本发明提供一种多肽类纳米疫苗及其制备方法与应用，能够适用于种类繁杂、结构多样、理化性质各异的多种抗原肽，且提供了抗原佐剂一体化的递送方案。
为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：
一种多肽类纳米疫苗，包括载体和负载于所述载体上的佐剂，
所述载体为β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺（β-CD-PEI）和抗原肽通过交联剂交联得到的纳米颗粒，所述交联剂为还原响应型交联剂。
优选的，所述佐剂包裹于β-环糊精的空腔中，或者通过静电作用负载于所述载体表面。
优选的，所述佐剂为疏水型佐剂或离子型佐剂，所述疏水型佐剂包裹于所述β-环糊精的空腔中，所述离子型佐剂通过静电作用负载于所述载体表面。
优选的，所述疏水型佐剂为瑞喹莫德（R848）或咪喹莫特（R837）。
优选的，所述离子型佐剂为寡脱氧核苷酸（CpG）或聚肌苷酸胞苷酸（Poly I:C）。
优选的，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺的结构式为：
；
其中，n为自然数。
优选的，所述还原响应型交联剂（PNC-DTDE-PNC）的结构式为：
。
优选的，所述抗原肽为具有预防性或者治疗性的抗原。例如来源于肿瘤基因组突变的新抗原，病毒表面特异性表达的多肽等。
优选的，所述抗原肽为抗原卵清蛋白OVA抗原肽SIINFEKL、靶向CT26的抗原肽QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE、靶向B16F10M27的抗原肽LCPGNKYEM、靶向MC38的抗原肽ASMTNMELM、靶向肝癌细胞HHCC的抗原肽SLIVHLNEV、靶向黑色素瘤的HLA-A2限制性抗原肽YLEPGPVTA、抗原肽ELAGIGILTV、抗原肽FVGEFFTDV以及破伤风类毒素肽AQYIKANSKFIGITEL、模型肽FFQNK。
优选的，所述载体的粒径为30~1000 nm。
本发明还提供上述多肽类纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）将β-CD-PEI、还原响应型交联剂和抗原肽于二甲亚砜中交联反应，得到所述载体；
（2）将所述佐剂和所述载体在溶液中共孵育，即得所述多肽类纳米疫苗。
优选的，步骤（1）中所述β-CD-PEI、所述还原响应型交联剂和所述抗原肽的摩尔比为0.5~4:1~4:1~3.5。
优选的，步骤（1）中所述β-CD-PEI由如下方法制得：
（1-1-1）向β-环糊精（β-CD）的NaOH溶液中加入对甲苯磺酰氯，搅拌反应得到产物β-CD-OTs；
（1-1-2）将β-CD-OTs与聚乙烯亚胺（PEI）于二甲亚砜（DMSO）中搅拌反应，得到β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺（β-CD-PEI）。
所述β-CD-OTs的结构式为：。
优选的，步骤（1-1-1）和步骤（1-1-2）还包括对得到的产品后处理的步骤。
优选的，步骤（1）中所述还原响应型交联剂由如下方法制得：
（1-2-1）将2-羟乙基二硫化物（DTDE）、吡啶和对硝基氯甲酸苯酯（PNC）于无水二氯甲烷中反应，得到还原响应型交联剂PNC-DTDE-PNC。
优选的，所述载体中β-CD与所述疏水型佐剂的摩尔比是1~20:1。
优选的，步骤（1）中所述交联反应的时间为12~72 h。
优选的，步骤（2）中所述共孵育的时间为1~12 h。
本发明还提供上述多肽类纳米疫苗在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的纳米疫苗的载体中β-CD-PEI的空腔及静电作用可实现不同抗原及佐剂的负载。
（2）本发明利用PNC-DTDE-PNC的两端基团可将β-CD-PEI的氨基和多肽的氨基进行交联，进一步，交联剂上的二硫键在细胞内被还原裂解，能实现在细胞胞浆内抗原多肽的释放。每条肽链至少含有1个游离氨基，本发明采用的交联剂PNC-DTDE-PNC适用于连接任意肽链，为构建通用型纳米疫苗载体提供可能。
（3）本发明的纳米疫苗为纳米粒子形态，能够增加树突状细胞（DCs）对抗原和佐剂的摄取，有利于***靶向递送，从而有利于进一步的生物运用，使药物更多富集于***部位。其上调表面共刺激分子及细胞因子的分泌，有利于激发机体的免疫应答，提高抗肿瘤效果。传统游离状态的肿瘤疫苗，难以靶向***，药物富集程度有限。
（4）本发明采用的原料价格较低，易于获得，制备方法简单，易于生产，具有抗原多肽的制备通用性，有较好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1制备的抗原肽多佐剂疫苗的红外吸收光谱图。
图2是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的粒径分布图。
图3是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
图4是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的***IVIS（红外成像***）成像。
图5是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
图6是实施例3制备的模型肽多佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图。
图7是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
图8是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的***IVIS成像。
图9是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
图10是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤重量图。
图11是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤图。
图12是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
图13是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
图14是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤图。
图15是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的预防性抑瘤曲线。
具体实施方式
实施例1
1. β-CD-PEI合成：
（1）第一步合成β-CD-OTs：β-CD (50 g, 44.0 mmol ) 溶解于500mL 0.4N的NaOH溶液中，冰水浴冷却至5℃，对甲苯磺酰氯（35 g, 184mmol）在5分钟内慢慢加入不断搅拌的溶液中。混合溶液在5℃搅拌30分钟，然后过滤。滤液用饱和盐酸中和后搅拌1h。然后过滤样品，滤饼用水洗3次，水洗后样品置于60℃真空干燥箱干燥一夜，得产物β-CD-OTs。
（2）第二步合成β-CD-PEI：PEI600（1.1 g，1.8 mmol）与β-CD-OTs（2.1 g，1.8mmol）溶解于适量DMSO中，混合物在氮气保护下搅拌3天，随后溶液透析，冻干，得到β-CD-PEI。采用核磁共振、质谱进行结构鉴定。
2. PNC-DTDE-PNC交联剂的合成：
将DTDE（4.0 g，46.7 mmol）和吡啶（7.4 g，93.4 mmol，使用前用5A分子筛静置过夜除水）溶于10 mL无水二氯甲烷中，N2保护，冰水浴条件下，在2 h内缓慢加入PNC的二氯甲烷溶液（10.3 g，5.1 mmol，溶于10 mL无水二氯甲烷），随后避光反应20 h。旋转干燥后用硅胶柱层析纯化（展开剂：二氯甲烷）。利用核磁共振和质谱确定PNC-DTDE-PNC的合成。
3.1. 纳米疫苗载体的构建：
抗原肽PEPTIDE（序列为QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE）、β-CD-PEI、以及PNC-DTDE-PNC溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~72h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO，通过调整投料比及反应时间控制纳米粒子的粒径、形貌及稳定性。
制得的多肽类纳米疫苗载体的结构式如下：
。
3.2 负载佐剂的纳米疫苗的构建：
将R848、CpG和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12h，R848通过β-CD的空腔包合，CpG通过静电作用吸附在载体上。通过控制投料比例和共孵育的时间，可调整佐剂的负载量，以控制最佳比例的免疫佐剂。
图1为负载抗原肽的双佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图、图2为此纳米疫苗的粒径、图3为此纳米疫苗的电镜图，由图可知在3324.12 cm-1处有N-H吸收峰，说明在本实施例中交联剂与多肽上的氨基连接，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为346 ± 39.7 nm。
实施例2
纳米疫苗***富集能力考察：
按照官能团比例β-CD-PEI600:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=1:3:4将抗原肽PEPTIDE（序列为QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE）、β-CD-PEI以及PNC-DTDE-PNC溶于1 mL DMSO中，控制pH在7.4左右，再加入20 uLCy-7荧光染料孵育24~72 h，制备得到荧光标记的纳米疫苗。
皮下注射100 uL纳米疫苗到BALB\C小鼠的尾根部（左右两侧各50 uL）中。分别在注射后6、12及24 h处死小鼠取出腹股沟***（LNs）进行离体成像的拍摄。
如图4所示，纳米疫苗组小鼠双侧腹股沟在6 h，12 h，24 h均有较强荧光，游离组（注射游离态β-CD-PEI、PEPTIDE、R848和CpG）仅在12 h有微弱荧光，这说明所制备的纳米疫苗具有较强的***富集能力。
考察β-CD-PEI-抗原肽双佐剂纳米疫苗的抑瘤效果：
于Day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成PBS组、游离组和纳米疫苗组，于Day7及Day14于尾根部给药。
如图5所示，与PBS组相比其余两组均减小，纳米疫苗组与游离组也有差异，具有统计学意义。
实施例3
按照官能团比例β-CD-PEI600:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=1:3:4将模型肽（序列为FFQNK，仅氨基）、β-CD-PEI以及PNC-DTDE-PNC溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~72h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。将R848、CpG和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12h制得负载模型肽的双佐剂纳米疫苗。图6为负载模型肽的双佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图，由图可知本实施例中交联剂与多肽上的氨基连接，在3312.65 cm-1处有N-H吸收峰。
实施例4
1. 负载抗原肽（序列为SIINFEKL）的双佐剂纳米疫苗的构建：
将与实施例1相同方法合成的β-CD-PEI、与实施例1相同方法合成的PNC-DTDE-PNC交联剂和抗原肽PEPTIDE（序列为SIINFEKL）按照官能比例β-CD-PEI600:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=1:3:4溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。将R848、CpG和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h制得负载双佐剂的多肽纳米疫苗。
图7为纳米疫苗的电镜图，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为197.8±11.1nm。
2. 纳米疫苗***富集能力考察：
按照官能团比例β-CD-PEI600:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=1:3:4将抗原肽（序列为SIINFEKL）、β-CD-PEI以及PNC-DTDE-PNC溶于1 mL DMSO中，控制pH在7.4左右，再加入20uLCy-7荧光染料孵育24~72 h，制备得到荧光标记的纳米疫苗。
皮下注射100 uL纳米疫苗到BALB\C小鼠的尾根部（左右两侧各50 uL）中。分别在注射后6、12及24 h处死小鼠取出腹股沟***（LNs）进行离体成像的拍摄。
如图8所示，纳米疫苗组小鼠双侧腹股沟在6 h，12 h，24 h均有较强荧光，游离组在6h，12 h虽有荧光但荧光强度明显比纳米疫苗组弱，24h荧光基本消失，这说明所制备的纳米疫苗具有较强的***富集能力。
3. 考察纳米疫苗的抑瘤效果：
于Day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成PBS组、游离组和纳米疫苗组，于Day7及Day14于尾根部给药。
如图9、10、11所示，纳米疫苗组小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量相比PBS组和游离组明显减小，纳米疫苗组与PBS组、游离组的差异具有统计学意义，说明纳米疫苗能抑制肿瘤生长。
实施例5
1. 负载抗原肽（序列为ASMTNMELM）的双佐剂纳米疫苗的构建：
将与实施例1相同方法合成的β-CD-PEI、与实施例1相同方法合成的PNC-DTDE-PNC交联剂和抗原肽PEPTIDE（序列为ASMTNMELM）按照官能团比例β-CD-PEI600:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=1:3:4溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。将R848、CpG和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12 h制得负载双佐剂的多肽纳米疫苗。
图12为制得的纳米疫苗的电镜图，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为309.8±4.9 nm。
2. 考察纳米疫苗的抑瘤效果：
于Day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成PBS组、游离组和纳米疫苗组，于Day7、Day14及Day21于尾根部给药。
如图13、14所示，纳米疫苗组小鼠的肿瘤体积均较PBS组和游离组小，纳米疫苗组2/5只小鼠肿瘤逐渐变小直至消失，说明纳米疫苗能抑制肿瘤生长。
3. 纳米疫苗肿瘤预防性能力评价：
给药前随机分成PBS组、游离组和纳米疫苗组，于Day-21、Day-14及Day-7于尾根部给药，于Day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞。
如图15所示，纳米疫苗组的肿瘤生长曲线均较PBS组和游离组平缓，说明纳米疫苗预防给药能一定程度上抑制肿瘤的生长速度。
实施例6
将与实施例1相同方法合成的β-CD-PEI、与实施例1相同方法合成的PNC-DTDE-PNC交联剂和抗原肽PEPTIDE（序列为YLEPGPVTA）溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌12~36h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。官能团比例β-CD-PEI:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=0.5:3.5:4。
将聚肌苷酸胞苷酸（Poly I:C）和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，Poly I:C通过静电作用吸附在载体上，制得负载Poly I:C的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为140 nm。
实施例7
将与实施例1相同方法合成的β-CD-PEI、与实施例1相同方法合成的PNC-DTDE-PNC交联剂和抗原肽PEPTIDE（序列为LCPGNKYEM）溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。官能团比例β-CD-PEI:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=4:1:3.5。
将R837和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，R837通过β-CD的空腔包合在载体中，制得负载R837的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为430 nm。
实施例8
将与实施例1相同方法合成的β-CD-PEI、与实施例1相同方法合成的PNC-DTDE-PNC交联剂和将模型肽（序列为FFQNK，仅氨基）溶于1 mL DMSO中，在25 ℃下搅拌24~48h，用1500 Da透析袋于纯水中透析除去DMSO。官能团比例β-CD-PEI:PEPTIDE:PNC-DTDE-PNC=4:1:1。
将R848和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，R848通过β-CD的空腔包合在载体中，制得负载R848的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为30 nm。

Claims (5)

1.一种多肽类纳米疫苗，其特征在于，包括载体和负载于所述载体上的佐剂，
所述载体为β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺和抗原肽通过交联剂交联得到的纳米颗粒，所述交联剂为还原响应型交联剂；
所述佐剂包裹于β-环糊精的空腔中，或者通过静电作用负载于所述载体上；所述佐剂为疏水型佐剂或离子型佐剂，所述疏水型佐剂包裹于所述β-环糊精的空腔中，所述离子型佐剂通过静电作用负载于所述载体上；所述疏水型佐剂为瑞喹莫德，所述离子型佐剂为寡脱氧核苷酸，
所述还原响应型交联剂的结构式为：
；
所述抗原肽为抗原卵清蛋白OVA抗原肽SIINFEKL、靶向CT26的抗原肽QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE、靶向MC38的抗原肽ASMTNMELM或模型肽FFQNK。
2. 根据权利要求1所述的多肽类纳米疫苗，其特征在于，所述载体的粒径为30~1000nm。
3.权利要求1-2任一所述多肽类纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、还原响应型交联剂和抗原肽于二甲亚砜中交联反应，得到所述载体；
（2）将所述佐剂和所述载体在溶液中共孵育，即得所述多肽类纳米疫苗。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺由如下方法制得：
（1-1-1）向β-环糊精的NaOH溶液中加入对甲苯磺酰氯，搅拌反应得到产物β-CD-OTs；
（1-1-2）将β-CD-OTs与聚乙烯亚胺于二甲亚砜中搅拌反应，得到β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。
5.权利要求1-2任一所述多肽类纳米疫苗在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
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