CN113563265B - 一种合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成On‑DNA N,N‑单取代吲唑酮类化合物的方法，该方法以On‑DNA邻硝基芳酰胺化合物为原料，在碱、四羟基二硼存在下反应得到On‑DNA N,N‑单取代吲唑酮类化合物。本发明提供的On‑DNA N,N‑单取代吲唑酮类化合物的合成方法能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，后处理简单，条件温和，能够在较短时间内高收率得到高多样性的DNA编码化合物，并且适用于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

一种合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物的方法

技术领域

本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种合成On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物的方法。

背景技术

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、 WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果 (Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。

DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称 On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。

吲唑酮类化合物是一类重要的药物化合物骨架结构，将吲唑酮类骨架引入到DNA编码化合物库中能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选到有效化合物的概率。然而目前并没有报道过通过On-DNA邻硝基芳甲酸或On-DNA邻硝基芳酰胺化合物构建 On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物的方法。因此需要开发一种新的适用于大批量多孔板操作的合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物的方法，显著增加DNA编码化合物库的多样性，进一步提升DNA编码化合物库技术的应用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明开发了一种原料稳定存储、反应条件温和、产率高，底物普适性好，对DNA损伤小，适合于使用多孔板进行批量操作的DNA编码化合物库的合成方法，可以快速将DNA编码邻硝基芳酰胺化合物库通过一步反应转化为DNA编码 N,N-单取代吲唑酮类化合物库。

本发明提供了一种合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物的方法，所述方法以On- DNA邻硝基芳酰胺化合物为原料，在碱、四羟基二硼存在下反应得到On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物；其中On-DNA邻硝基芳酰胺化合物的结构式On- DNAN,N-单取代吲唑酮类化合物的结构式为/>

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与Ar相连；

其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键或基团连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键或基团时，指结构式中的DNA 与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH₂-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH₂CO-)连接DNA，也是通过三个化学键连接。

其中，Ar是单环或双环的芳香环；优选地，Ar为分子量1000以下，取代的芳香环或芳香杂环；R₂选自氢或分子量1000以下与酰胺氮原子直接相连的基团。

R₂选自烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中，所述烷基为C₁～C₂₀烷基或C₃～C₈环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；

所述芳香基选自吡啶基、喹啉基、噻唑基、噻吩基或苯基；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代芳香基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、烷氧基、烷氨酰基、烷酰基、C₁～C₂₀烷基中的一种或多种。

优选地，所述的R₂选自直链或支链C₁～C₁₂烷基；更进一步地，所述的R₂选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基。

优选地，所述的R₂选自C₃～C₆饱和环烷基，具体选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

优选地，所述的R₂选自取代烷基，所述烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基，取代烷基的取代基为苯基、烷基苯基或卤代苯基；更进一步地，所述的烷基苯基选自甲基苯基、乙基苯基、正丙基苯基、异丙基苯基、正丁基苯基、异丁基苯基、叔丁基苯基、戊烷基苯基、己烷基苯基；所述的卤代苯基选自氟代苯基、氯代苯基、溴代苯基、碘代苯基。

优选地，所述的R₂选自取代芳香基，所述芳香基为苯基，取代芳香基的取代基为 C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、烷氨酰基、C₁～C₆烷酰基或卤素；更进一步地；所述C₁～C₆烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述C₁～C₆烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；所述烷氨酰基选自氨酰基、甲氨酰基、乙氨酰基、正丙氨酰基、异丙氨酰基、正丁氨酰基、异丁氨酰基、叔丁氨酰基、戊氨酰基、己氨酰基；所述C₁～C₆烷酰基选自甲烷酰基、乙烷酰基、正丙烷酰基、异丙烷酰基、正丁烷酰基、异丁烷酰基、叔丁烷酰基、戊烷酰基、己烷酰基；所述卤素为氟、氯、溴或碘。

所述的Ar选自以下基团：

优选地，Ar为

本发明中的On-DNA邻硝基芳酰胺化合物可通过On-DNA邻硝基芳香羧酸化合物制得，反应路线如下：

步骤1将On-DNA邻硝基芳香羧酸化合物为底物，在20℃～100℃反应条件下，与胺缩合得到On-DNA邻硝基芳酰胺化合物；所述反应是在N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑和N, N'-二异丙基碳二亚胺存在下发生酰胺缩合；所述反应在溶剂中进行，溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMA、DMSO、THF、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或几种含水的混合溶剂。

优选地，所述溶剂为含有DMA的硼酸盐缓冲液；进一步地，所述缓冲液的pH＝9.4。

优选地，所述反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。

所述反应中On-DNA邻硝基芳香羧酸化合物的摩尔当量为1，胺的摩尔当量为150～300当量，优选地，所述胺的摩尔当量为150当量、200当量、250当量或300当量。

步骤2以On-DNA邻硝基芳酰胺化合物为原料，在碱、四羟基二硼反应条件下，反应得到On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物。反应步骤如下：

将摩尔当量为1，摩尔浓度为0.1～2mM的On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液、 300～500倍摩尔当量的碱、80～150倍摩尔当量的B₂(OH)₄混合，在室温下反应0.5～24h。

进一步地，所述On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液的摩尔浓度是0.5mM、1.0mM或2mM。

优选地，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、N,N-二异丙基乙胺或1,1,3,3-四甲基胍。

优选地，当On-DNA邻硝基芳酰胺化合物的摩尔当量为1，所述碱的的摩尔当量是300当量、350当量、400当量或500当量；四羟基二硼的摩尔当量为80当量、90当量、 100当量、120当量或150当量。

进一步地，所述的反应时间为1h、2h、3h、4h、6h、8h或24h。

进一步地，所述反应在溶剂中进行，溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMA、DMSO、 THF、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或几种含水的混合溶剂。

优选地，所述溶剂含有乙醇，乙醇的加入量是反应体系总体积的5～20％。

进一步地，乙醇的加入量是On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液与碱溶液总体积的10～20％。

进一步地，所述反应的加料顺序为：依次加入On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液、碱、乙醇，最后加入四羟基二硼。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

本发明方法可以实现在DNA编码化合物库中通过On-DNA邻硝基芳酰胺化合物合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物，可广泛应用于各种On-DNA邻硝基芳酰胺底物。本发明所使用的On-DNA邻硝基芳酰胺化合物可由On-DNA邻硝基芳甲酸和胺基化合物经酰胺缩合得到，可大规模引入胺基化合物作为合成模块。本发明方法收率高，产物单一，操作简单，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

在本发明的优选实施方案中，通过在反应体系中加入乙醇，可抑制副产物的产生，提升应用于DNA编码化合物库建库的准确度。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～C_b)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C₁～C₂₀烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。

烷基是指烷烃分子中少掉一个氢原子而成的直链或支链的烃基，例如甲基-CH₃，乙基-CH₂CH₃。烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团为例如C₁～C₆烷氧基。

“环烷基”是指具有多个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。

卤素为氟、氯、溴或碘。

芳香基是指芳香环上的部分H被取代得到的基团，例如吡啶基、喹啉基、噻唑基或苯基。

烷氧基是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH₃。

卤代苯基是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。

烷酰基是指烷基与羰基中的C原子连接形成取代基，例如乙酰基为-C(O)CH₃。

氨酰基是指氨基中的N原子与羰基中的C原子连接形成取代基，例如氨酰基为- C(O)NH₂，甲氨酰基为-C(O)NHCH₃。

芳香杂环指包含至少一个杂原子的芳香性不饱和环；其中杂原子指氮原子、氧原子、硫原子。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明实施例5得到的22种On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物相应的转化率分布。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明中，“室温”指20～25℃。

HOAT：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑；DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺；

DMA：二甲基乙酰胺；DMF：二甲基甲酰胺。

HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；

DIPEA：N,N-二异丙基乙胺。

DMSO：二甲基亚砜；THF：四氢呋喃。

本发明中DNA-NH₂是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH₂接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound 1”的DNA-NH₂结构。

实施例1：On-DNA邻硝基芳香羧酸化合物的合成

将100倍摩尔当量的4-硝基-3-甲氧基羰基苯甲酸或2-硝基对苯二酸单甲酯溶液(浓度为200mM,溶于DMA中)分别和100倍摩尔当量的HATU(浓度为400mM,溶于 DMA中)、100倍当量的DIPEA(浓度为400mM,溶于DMA中)分别放置于-20℃冰箱中降温5min后混合，将该混合物用涡旋振荡充分混匀，然后放置于4℃冰箱中保存5min，之后将上述混合物加入到DNA-NH₂溶液中(1mM的浓度；硼酸盐缓冲液，pH＝9.4，250 mM溶液)，再将反应液用涡旋振荡充分混匀，室温反应2h，反应完毕后进行乙醇沉淀，冻干试剂溶解于双蒸水中置成0.5mM的浓度，向该溶液中加入300倍摩尔当量的1M 的氢氧化钠水溶液，用涡旋振荡充分混匀后60℃反应1h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，冻干后直接用于下一步反应。

实施例2、On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物的合成

步骤1、On-DNA邻硝基苯酰胺化合物的合成

将On-DNA邻硝基苯甲酸1溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中依次加入苯胺(300摩尔当量，300mM的 MeCN/H₂O＝1:1溶液)、HOAt(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)、DIC(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)，室温反应1h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，冻干，得到On-DNA化合物2；

步骤2、On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物的合成

将On-DNA化合物2溶解在水中，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中依次加入NaOH(300摩尔当量，1M的H₂O溶液)、EtOH(On-DNA化合物2溶液与NaOH溶液总体积的10％)、B₂(OH)₄(80摩尔当量，100mM的H₂O溶液)，室温反应2 h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，送LCMS确认反应转化率为90％。

实施例3、On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物的合成

R₂＝C₆H₅-或C₆H₅-CH₂-CH₂-。

步骤1：On-DNA邻硝基苯酰胺化合物的合成

将On-DNA邻硝基苯甲酸1溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中分别加入苯胺或苯乙胺(300摩尔当量，300mM 的MeCN/H₂O＝1:1溶液)、HOAt(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)、DIC(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)，室温反应1h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，冻干，得到两种On-DNA化合物2；

步骤2、On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物的合成

将两种On-DNA化合物2分别溶解在水中，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中依次加入NaOH(X摩尔当量，1M的H₂O溶液)、EtOH(Y％V/V)、B₂(OH)₄ (Z摩尔当量，100mM的H₂O溶液)，室温反应24h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物 3的溶液，送LCMS确认反应转化率，具体反应条件和产物转化率如下面表1：

Y％表示EtOH加入量的体积占On-DNA化合物2溶液与NaOH溶液总体积的比例。

表1：实施例3的具体反应条件和产物转化率

实施例4、On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物的合成

R₂＝C₆H₅-或C₆H₅-CH₂-CH₂-。

步骤1：On-DNA邻硝基苯酰胺化合物的合成

将On-DNA邻硝基苯甲酸1溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中分别依次加入苯胺或苯乙胺(300摩尔当量，300 mM的MeCN/H₂O＝1:1溶液)、HOAt(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)、DIC(600 摩尔当量，600mM的DMSO溶液)，室温反应1h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，冻干，得到两种On-DNA化合物2；

步骤2、On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物的合成

将两种On-DNA化合物2分别溶解在水中，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中依次加入NaOH(X摩尔当量，1M的H₂O溶液)、EtOH(Y％V/V)、B₂(OH)₄ (Z摩尔当量，100mM的H₂O溶液)，室温反应2h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物 3的溶液，送LCMS确认反应转化率，具体反应条件和产物转化率如下面表2：

Y％表示EtOH加入量的体积占On-DNA化合物2溶液与NaOH溶液总体积的比例。

表2：实施例4的具体反应条件和产物转化率

上述实验结果表明，向反应体系中加入乙醇可以抑制副产物的产生，有效的提高反应的产率。反应条件2制备的目标产物产率最高。

实施例5、不同底物的On-DNAN,N-单取代吲唑酮化合物的合成

将On-DNA邻硝基苯甲酸1溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中分别依次加入22种伯胺分子(300摩尔当量，300 mM的MeCN/H₂O＝1:1溶液)、HOAt(600摩尔当量，600mM的DMSO溶液)、DIC(600 摩尔当量，600mM的DMSO溶液)，室温反应1h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，冻干，得到22种On-DNA化合物2；

将22种On-DNA化合物2分别溶解在水中，配制成1mM浓度溶液(10μL，10 nmol)，向该溶液中依次加入NaOH(300摩尔当量，1M的H₂O溶液)、EtOH(反应溶液总体积的10％)、B₂(OH)₄(80摩尔当量，100mM的H₂O溶液)，室温反应2h；

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2h，之后在12000 rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到22种On-DNA 产物3的溶液，送LCMS确认反应转化率。

综上所述，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、pH等条件，在四羟基二硼的存在下由On-DNA邻硝基苯酰胺化合物可以得到On-DNA N,N-单取代吲唑酮化合物。该方法能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，产物单一，操作简单，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Claims (8)

1.一种合成On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物的方法，其特征在于：所述方法以On-DNA邻硝基芳酰胺化合物为原料，在碱、四羟基二硼反应条件下，反应得到On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物；其中，On-DNA邻硝基芳酰胺化合物的结构式为On-DNA N,N-单取代吲唑酮类化合物的结构式为/>

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与Ar相连；

其中，所述的Ar选自以下基团：

R₂选自烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中，取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；所述烷基为C₁～C₂₀烷基或C₃～C₈环烷基；

所述芳香基选自吡啶基、喹啉基、噻唑基、噻吩基或苯基；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代芳香基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、C₁～C₆烷氧基、氨酰基、C₁～C₆烷酰基、C₁～C₂₀烷基中的一种或多种；

所述方法包括以下步骤：将摩尔当量为1，摩尔浓度为0.1～2mM的On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液、300～500倍摩尔当量的碱、80～150倍摩尔当量的B₂(OH)₄混合，在室温下反应0.5～24h；

所述碱为氢氧化钠；所述反应在溶剂中进行，溶剂为乙醇、水的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液的摩尔浓度是0.5mM、1.0mM或2mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：On-DNA邻硝基芳酰胺化合物的摩尔当量为1，所述碱的摩尔当量是300当量、350当量、400当量或500当量，所述四羟基二硼的摩尔当量为80当量、90当量、100当量、120当量或150当量。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反应时间为1h、2h、3h、4h、6h、8h或24h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙醇的加入量是反应体系总体积的5～20％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的加料顺序为：依次加入On-DNA邻硝基芳酰胺化合物溶液、碱、乙醇，最后加入四羟基二硼。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述方法用于批量的多孔板操作。

8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。