CN112920246B - 一种合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成On‑DNA 1,4‑硫氮杂卓化合物的方法，该方法是以On‑DNAα,β‑不饱和羰基化合物与邻巯基胺类化合物反应得到On‑DNA产物。该反应方法能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，不引入金属类试剂，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

一种合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法

技术领域

本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库构建中合成On-DNA1,4-硫氮杂卓化合物的方法。

背景技术

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。

DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。

1,4-硫氮杂卓类化合物是一类重要的药物化合物骨架结构，将1,4-硫氮杂卓化合物骨架引入到DNA编码化合物库中能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选到有效化合物的概率。然而目前并没有报道通过On-DNA α,β-不饱和羰基化合物合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法。因此希望开发一种新的适用于大批量多孔板操作的On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的合成方法，以增加DNA编码化合物库的多样性，进一步提升DNA编码化合物库技术的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种原料稳定存储、反应条件温和、底物普适性好，对DNA损伤小，适合于使用多孔板进行批量操作的DNA编码化合物的合成方法，可以快速将On-DNA α,β-不饱和羰基化合物通过一步反应转化为On-DNA1,4-硫氮杂卓化合物。

本发明提供了一种合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法，所述方法是以On-DNA α,β-不饱和羰基化合物和邻巯基胺类化合物为原料，在还原剂的存在下反应得到On-DNA产物；其中On-DNA α,β-不饱和羰基化合物的结构式为

邻巯基胺类化合物的结构式为/>

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；所述DNA的长度为10～200个碱基。

其中，结构式中的DNA与R₁或R₃通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与R₁或R₃直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与R₁或R₃之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与R₁或R₃之间通过一个亚甲基(-CH₂-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与R₁或R₃之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与R₁或R₃通过一个亚甲基羰基(-CH₂CO-)连接DNA的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。

R₁选自分子量1000以下与DNA和羰基碳原子直接相连的基团或者不存在；

R₂选自分子量1000以下与烯基碳原子直接相连的基团；

R₃选自分子量1000以下与DNA和烯基碳原子直接相连的基团或者不存在；

R₄选自分子量1000以下与羰基碳原子直接相连的基团；

R₅选自氢或分子量1000以下与烯基碳原子直接相连的基团；

或R₅分别与R₁、R₂、R₃或R₄成环；

R₆、R₆’选自氢或分子量1000以下的基团；或者R₆、R₆’相连形成分子量1000以下的可选取代的环烷基、杂环、芳环、芳杂环。

作为优选，所述R₁、R₂、R₃、R₄分别选自烷基、取代烷基、羧基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C₁～C₂₀烷基或C₃～C₈环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、杂环基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基、三氟甲基中的一种或多种；

所述R₅选自氢、C₁～C₂₀烷基；所述R₆、R₆’选自C₁～C₂₀烷基；或者R₆、R₆'相连形成芳环。

更进一步地；

所述的R₁选自苯基、噻吩基；

所述的R₂选自苯基、取代苯基、C₁～C₆烷基、羧基、吡啶基、取代吡啶基、呋喃基；取代苯基的取代基选自羧基、C₁～C₆烷氧基、三氟甲基、C₁～C₆烷基；取代吡啶基的取代基选自C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基；

所述的R₃选自苯基、噻吩基；

所述的R₄选自苯基、取代苯基、C₁～C₆烷基、羧基、吡啶基、取代吡啶基、呋喃基；取代苯基的取代基选自羧基、C₁～C₆烷氧基、三氟甲基、C₁～C₆烷基；取代吡啶基的取代基选自C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基；

所述R₅选自氢、C₁～C₆烷基；所述R₆、R₆’选自C₁～C₆烷基；或者R₆、R₆'相连形成苯环。。

所述的On-DNA α,β-不饱和羰基化合物具体选自

/>

所述的邻巯基胺类化合物具体选自

一种合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法，向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA α,β-不饱和羰基化合物溶液中，加入10～1000倍摩尔当量的邻巯基胺类化合物，再加入10-500倍摩尔当量的还原剂，在10℃～100℃下反应0.5～24小时。

进一步地，所述还原剂选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠或氢化铝锂；优选地，所述还原剂为氰基硼氢化钠。

进一步地，所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有磷酸缓冲液。

更进一步地，所述磷酸缓冲液的pH为5～7；优选地，pH为5.5。

进一步地，所述反应的反应温度为10℃～100℃；优选地，反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

进一步地，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，所述反应的反应时间为1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或16小时。

进一步地，所述方法中On-DNA α,β-不饱和羰基化合物的摩尔当量为1，邻巯基胺类化合物的摩尔当量为50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量、1000当量；还原剂的摩尔当量为20当量、60当量、80当量、100当量、200当量、400当量。

最优选地，邻巯基胺类化合物的摩尔当量为400，还原剂的当量为100。

进一步地，所述反应的加料顺序为先加入On-DNAα,β-不饱和羰基化合物，再加入邻巯基胺类化合物，30℃反应16小时后，再加入氰基硼氢化钠，60℃反应1小时。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

本发明方法可以实现在DNA编码化合物库中通过On-DNA α,β-不饱和羰基化合物得到On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物，可广泛应用于各种On-DNA α,β-不饱和羰基底物，并且能大规模引入各种取代的邻巯基胺类化合物作为合成模块。该方法收率高，产物单一，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，不引入金属类试剂，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～C_b)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C₁～C₁₂烷基是指包含1～12个碳原子的直链或支链的烷基。

烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-CH₃、乙基-CH₂CH₃、亚甲基-CH₂-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C₁～C₆烷氧基，C₁～C₆烷基氨基。

环烷基是指具有多个碳原子且没有环杂原子，且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。

所述卤素为氟、氯、溴或碘。

烷氧基是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH₃。

卤代苯基是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。

烷基苯基是指苯基上的H被烷基取代而形成的基团。

5～10元芳基是指不含杂原子，由C原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。

5～10元芳杂环基是指5～10个的C、O、S、N等原子构成具有芳香性的单一环状或多个环状基团。

杂环基是携带至少一个选自O、S、N的3至8个原子的饱和或不饱和的单环或多环烃基。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明实施例2得到的25种On-DNA1,4-硫氮杂卓化合物相应的转化率分布图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明中DNA-NH₂是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH₂接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH₂结构。也例如下述的DNA结构：

其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。

DMSO：二甲基亚砜。

实施例1、On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的合成

步骤1、On-DNAα,β-不饱和羰基化合物的合成

将On-DNA芳基乙酮类化合物(1)溶解到250mM,pH＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向溶液中依次加入苯甲醛(4000nmol,200当量，200mM DMSO)，氢氧化钠(10000nmol，500当量，500mM双蒸水)，混合均匀，30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到On-DNAα,β-不饱和羰基化合物(2)的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认反应转化率为90％。

步骤2、On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的合成

将On-DNAα,β-不饱和羰基化合物(2)溶解到250mM,pH＝5.5的磷酸缓冲液中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向溶液中加入邻巯基苯胺(8000nmol，400当量，400mMDMSO)混合均匀，30℃反应16小时后，向体系中加入氰基硼氢化钠(2000nmol，100当量，200mM DMSO)混合均匀，60℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认反应转化率为87％。

实施例2、On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的合成

将25种On-DNAα,β-不饱和羰基化合物溶解到250mM,pH＝5.5的磷酸缓冲液中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向溶液中加入邻巯基苯胺(8000nmol，400当量，400mMDMSO)混合均匀，30℃反应16小时后，向体系中加入氰基硼氢化钠(2000nmol，100当量，200mM DMSO)混合均匀，60℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认反应转化率。

综上所述，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、pH等条件，在还原剂的存在下，由On-DNAα,β-不饱和羰基化合物和邻巯基胺类化合物反应可以得到On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物。该方法底物适用范围广，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，不引入金属类试剂，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Claims (8)

1.一种合成On-DNA 1,4-硫氮杂卓化合物的方法，其特征在于：所述方法是以On-DNAα,β-不饱和羰基化合物和邻巯基胺类化合物为原料，在氰基硼氢化钠的存在下反应得到On-DNA产物；其中On-DNA α,β-不饱和羰基化合物的结构式为

邻巯基胺类化合物的结构式为/>

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；

R₁选自分子量1000以下与DNA和羰基碳原子直接相连的基团或者不存在；

R₂选自分子量1000以下与烯基碳原子直接相连的基团；

R₃选自分子量1000以下与DNA和烯基碳原子直接相连的基团或者不存在；

R₄选自分子量1000以下与羰基碳原子直接相连的基团；

R₅选自氢或分子量1000以下与烯基碳原子直接相连的基团；

或R₅分别与R₁、R₂、R₃或R₄成环；

R₆、R₆'选自氢或分子量1000以下的基团；或者R₆、R₆'相连形成分子量1000以下的环烷基、芳环；

所述方法包括以下步骤：将On-DNA α,β-不饱和羰基化合物溶解到pH＝5.5的磷酸缓冲液中，向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA α,β-不饱和羰基化合物溶液中，加入10～1000倍摩尔当量的邻巯基胺类化合物，再加入10-500倍摩尔当量的氰基硼氢化钠，在10℃～100℃下反应0.5～24小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的R₁、R₂、R₃、R₄分别选自烷基、取代烷基、羧基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C₁～C₂₀烷基或C₃～C₈环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、杂环基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基、三氟甲基中的一种或多种；

所述R₅选自氢、C₁～C₂₀烷基；所述R₆、R₆'选自C₁～C₂₀烷基；或者R₆、R₆'相连形成芳环。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的加料顺序为先加入On-DNA α,β-不饱和羰基化合物，再加入邻巯基胺类化合物，30℃反应16小时后，再加入氰基硼氢化钠，60℃反应1小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中On-DNA α,β-不饱和羰基化合物的摩尔当量为1，邻巯基胺类化合物的摩尔当量为50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量、1000当量；氰基硼氢化钠的摩尔当量为20当量、60当量、80当量、100当量、200当量、400当量。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作。

8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

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