CN110066308A - 用于DNA编码化合物库构建中的On-DNA磺酰胺类化合物的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种DNA编码化合物库构建中On‑DNA磺酰胺类化合物的合成方法，该方法以DNA氨基化合物为底物，在卤素或其类似物存在下，与亚磺酸盐反应得到On‑DNA磺酰胺类化合物。本发明所提供的On‑DNA磺酰胺类化合物的合成方法，不需要金属参与，反应试剂廉价易得，原料稳定易存储，反应条件温和，产率高，底物普适性好，适合于使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成，可以快速将DNA氨基化合物库通过一步反应转化为DNA磺酰胺类化合物库，可以显着提高其合成的成功率。

Description

用于DNA编码化合物库构建中的On-DNA磺酰胺类化合物的合 成方法

技术领域

本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库中由DNA氨基化合物制得On-DNA磺酰胺类化合物的方法。

背景技术

美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381，专利：US5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过DNA独有的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。

DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。

除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN201711263372.3，CN201711318894.9)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN201711247220.4)，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN201810378969.0)。

DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称on-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的on-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。

目前公开报道的On-DNA化学反应种类有50多种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，On-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。

表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件

在On-DNA化学反应中，缓冲液的选择十分重要，我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利：CN201811181396.9)，并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利：CN201811181396.9)。

磺酰胺类化合物具有多种生物活性，其本身以及由它衍生的一系列有机化合物在临床药物、农药、染料以及材料等方面有着广泛的用途。目前在DNA编码化合物库领域，合成On-DNA磺酰胺类化合物的主要方法是通过On-DNA氨基化合物与小分子磺酰氯试剂在碱性条件下直接反应制得(参考文献：ACS Med.Chem.Lett.,2015,919)，但是由于DNA编码化合物库批量操作、磺酰氯溶液稳定性差且不易储存、过量的磺酰氯不易去除且容易造成DNA降解等原因，在实际生产中，小分子磺酰氯试剂作为DNA编码氨基化合物库的盖帽试剂，由其制备DNA编码磺酰胺类化合物库并不理想。

为了解决如上问题，我们希望开发一种原料稳定易存储，反应条件温和，产率高，底物普适性好，对DNA损伤小，适合于使用多孔板进行批量操作的DNA编码化合物库的合成，可以快速将DNA编码氨基化合物库通过一步反应转化为DNA编码磺酰胺类化合物库。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种用于DNA编码化合物库构建中的On-DNA氨基化合物(DNA-NHR₁化合物)转化成On-DNA磺酰胺类化合物的方法，其中，所制备得到的On-DNA磺酰胺类化合物的结构式如所示：DNA-NR₁-SO₂-R₂；

其中，DNA-NHR₁是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的带有裸露伯胺基或仲胺基的单链或双链的核苷酸链；其中，R₁为氢、烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中烷基为C₁～C₂₀烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等；取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基中的一种或多种；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基等取代基中的一种或多种；

其中，DNA-NR₁-SO₂-R₂结构式中的R₂为烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中烷基为C₁～C₂₀烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等；取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基中的一种或多种；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基中的一种或多种。

进一步的，本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种原料稳定易存储、反应条件温和、简便、快捷、适用于大批量多孔板的DNA编码化合物库生产的DNA-NHR₁转化成On-DNA磺酰胺类化合物的方法。

具体是以On-DNA氨基化合物(DNA-NHR₁化合物)为底物，以亚磺酸盐为原料，以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液(硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐)、有机酸缓冲液(醋酸、HEPES、TAPS、MES)、有机碱缓冲液(三乙胺、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一项或几项为溶剂，在卤素或其类似物存在下，温度为0～100℃的条件下反应0.5～24小时得到On-DNA磺酰胺类化合物，具体反应方程式如下：

所述的DNA-NHR₁是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的带有裸露伯胺或仲胺的单链或双链的核苷酸链；其中，R₁为氢、烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中烷基为C₁～C₂₀烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等；取代烷基为卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基等取代的烷基，取代基的数量为一个或多个；取代芳香基为卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基等取代基的芳基，取代基的数量为一个或多个；

所述的亚磺酸盐是亚磺酸锂、亚磺酸钠、亚磺酸钾、亚磺酸铯、亚磺酸镁、亚磺酸钙、亚磺酸铝、亚磺酸铜、亚磺酸铁、亚磺酸钴、亚磺酸镍、亚磺酸铜、亚磺酸锌、亚磺酸钯、亚磺酸钌；优选地，是亚磺酸钠；

其中，DNA-NR₁-SO₂-R₂结构式中的R₂为烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基。其中烷基为C₁～C₂₀烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等；取代烷基为卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基等取代的烷基，取代基的数量为一个或多个；取代芳香基为卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基取代的芳香基，取代基的数量为一个或多个。

所述的卤素或其类似物是单质溴、单质碘、N-氯代丁二酰亚胺、N-溴代丁二酰亚胺、N-碘代丁二酰亚胺、氯化铵、溴化铵、碘化铵、四丁基氯化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基溴化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基碘化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基氯化铵和过氧化氢叔丁基、四丁基溴化铵和过氧化氢叔丁基、四丁基碘化铵和过氧化氢叔丁基中的一种或几种的混合物；优选地，所述卤素或其类似物是单质碘。

本发明提供的On-DNA磺酰胺类化合物的合成方法，相较于传统的DNA-NHR₁与磺酰氯试剂的反应，本发明的方法反应原料稳定易存储，反应条件温和，产率高，底物普适性高，反应条件对DNA损伤小，适合于使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成，可以快速将DNA氨基化合物库通过一步反应转化为DNA磺酰胺类化合物库，可以显著提高其合成的成功率。

附图说明

图1为本发明的DNA-NH₂与亚磺酸钠混合反应制得相应的On-DNA磺酰胺类化合物的化学反应式。

图2为本发明的DNA-NH₂与亚磺酸钠混合反应制得相应的On-DNA磺酰胺类化合物的亚磺酸钠的代表结构式及制得产物的产率(产率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，

1)On-DNA磺酰胺类化合物的合成

将DNA-NH₂(例如专利CN108070009A提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中的26个孔(10μL,10nmol,1mM)，再向96孔板的每个孔依次加入亚磺酸钠溶液(5μL,1000nmol,200mM的水溶液,100当量)和单质碘溶液(1.25μL,500nmol,400mM的乙醇溶液,50当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后封膜，96孔板在摇床中20℃和150rpm下反应16小时。

反应完毕后乙醇沉淀：

向96孔板的每个孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LCMS确认每个小分子的转化率。

我们共计验证了26个亚磺酸钠与DNA-NH₂在单质碘存在下反应制得的On-DNA磺酰胺类化合物，亚磺酸钠的代表试剂结构和产率见图2。

为了扩大DNA编码化合物库的多样性，用磺酰氯小分子试剂给DNA氨基化合物库盖帽是常见的方法之一，但是由于磺酰氯稳定性差，其溶液难以存储，过量加入的磺酰氯对DNA有一定的降解作用，本发明可以规避如上问题，亚磺酸钠水溶性好，易存储，且反应的整体转化率高，可以显著提高DNA编码磺酰胺类化合物库的合成成功率。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种用于DNA编码化合物库构建中的On-DNA氨基化合物转化成On-DNA磺酰胺类化合物的方法，其特征在于，On-DNA氨基化合物的结构式为：DNA-NHR₁，所制备得到的On-DNA磺酰胺类化合物的结构式如所示：DNA-NR₁-SO₂-R₂；将On-DNA氨基化合物的溶液，与10～1000摩尔当量的亚磺酸盐、10～1000摩尔当量的卤素或其类似物混合，于0～100℃的条件下反应0.5～24小时直至反应结束；

其中，DNA-NHR₁是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的带有伯胺基或仲胺基的单链或双链的核苷酸链；其中，R₁为氢、烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中烷基为C₁～C₂₀烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基中的一种或多种；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代芳香基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基中的一种或多种；

其中，DNA-NR₁-SO₂-R₂结构式中的R₂为烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中烷基为C₁～C₂₀烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基中的一种或多种；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、苄氧基、乙烯基、炔基或烷基中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述On-DNA氨基化合物的摩尔浓度为0.1～5.0mM。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，On-DNA氨基化合物溶于反应溶液后的摩尔浓度是0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM，3.0mM，3.5mM，4.0mM，4.5mM或5.0mM；优选地，摩尔浓度为1.0mM。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的亚磺酸盐选自亚磺酸锂、亚磺酸钠、亚磺酸钾、亚磺酸铯、亚磺酸镁、亚磺酸钙、亚磺酸铝、亚磺酸铜、亚磺酸铁、亚磺酸钴、亚磺酸镍、亚磺酸铜、亚磺酸锌、亚磺酸钯、或亚磺酸钌中的一种或多种；优选地，所述的亚磺酸盐是亚磺酸钠。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卤素或其类似物选自单质溴、单质碘、N-氯代丁二酰亚胺、N-溴代丁二酰亚胺、N-碘代丁二酰亚胺、氯化铵、溴化铵、碘化铵、四丁基氯化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基溴化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基碘化铵和间氯过氧苯甲酸、四丁基氯化铵和过氧化氢叔丁基、四丁基溴化铵和过氧化氢叔丁基、四丁基碘化铵和过氧化氢叔丁基中的一种或几种的混合物；优选地，所述卤素或其类似物是单质碘。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述On-DNA氨基化合物溶于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、或有机碱缓冲液中的任意一种或几种溶液，且最终反应液中的水的含量不低于20％；优选地，所述DNA-NHR₁化合物溶于无机盐缓冲液、有机酸缓冲液或有机碱缓冲液；更优选地，所述DNA-NHR₁化合物溶于浓度为250mM且pH＝9.5的硼酸缓冲液。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亚磺酸盐的摩尔当量是10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，150当量，200当量，250当量，300当量，350当量，400当量，450当量，500当量，550当量，600当量，650当量，700当量，750当量，800当量，850当量，900当量，950当量，或1000当量；优选地，所述亚磺酸盐的摩尔当量是100当量。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卤素或其类似物的摩尔当量是10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，150当量，200当量，250当量，300当量，350当量，400当量，450当量，500当量，550当量，600当量，650当量，700当量，750当量，800当量，850当量，900当量，950当量，或1000当量；优选地，所述卤素或其类似物的摩尔当量是50当量。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的反应温度为0℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，或100℃；优选地，所述反应温度为20℃。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应时间为0.5小时，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，23小时或24小时；优选地，所述反应时间是16小时。

11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作；优选的，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。