CN113528364A - 一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用。该基因选自基因YJL120W、YJR130C、YJR131W、YJL078C中的一种或多种；抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。本发明基因是在SCRaMbLE重排的基础上，结合生物信息学分析和RT‑qPCR手段进行基因挖掘工作，得到了耐受性相关基因YJL120W、YJL078C、YJR130C和YJR131W，并对它们进行功能验证，最终发现基因YJL120W的过表达，基因YJL078C、YJR130C和YJR131W的删除能提升菌株耐受性。

Description

一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用。

背景技术

菌种改造技术是利用遗传学、生物化学等原理，对目标菌种进行分子改造以及对应条件筛选，为生产提供优良菌种进而促进生产发展的一门技术。菌种改造技术目前主要包括基因突变(如诱变等)、基因重组(如杂交、原生质体融合、基因工程等)、基因直接进化(如易错PCR、DNA改组、外显子改组等)等方法。菌种生理耐受性的改造对生物炼制和生物经济的发展有着重要意义。

酵母与人们的生活息息相关，在酿酒、烘焙、生物燃料、污染治理、营养品、生物医药等领域中都起着至关重要的作用，是理想的工业菌株。提高酵母的耐受性，将大大降低工业发酵成本，提高发酵产量。

目前，有关酵母耐受性的工作涉及到酿酒酵母的耐受乙醇、耐高温、耐酸性、耐受雷帕霉素、耐碱性等工作，采用的手段包括适应性进化和 SCRaMbLE重排技术等，并以此挖掘到ACE2、GLN3、YER161C等基因。对于新的可提高酵母耐受性的基因有待进一步挖掘。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用。经功能验证，发现基因YJL120W的过表达，基因YJL078C、YJR130C和YJR131W 的敲除能提升菌株耐受性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用，该基因选自基因YJL120W、YJR130C、YJR131W、YJL078C中的一种或多种；

抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

作为优选，呋喃类抑制剂为糠醛，弱酸类抑制剂为乙酸，酚类抑制剂为苯酚。

在本发明提供的具体实施例中，抑制剂为糠醛、乙酸、苯酚的混合物。

作为优选，菌株为酵母菌株。

在本发明提供的具体实施例中，菌株为酿酒酵母菌株。

在本发明中，基因YJL120W正调控菌株对抑制剂耐受性，基因YJR130C、 YJR131W、YJL078C负调控菌株对抑制剂耐受性。

本发明还提供了一种提高菌株对抑制剂耐受性的方法，该方法包括如下一种或多种改造：

a)过表达基因YJL120W；

b)敲除基因YJR130C；

c)敲除基因YJR131W；

d)敲除基因YJL078C；

抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

作为优选，呋喃类抑制剂为糠醛，弱酸类抑制剂为乙酸，酚类抑制剂为苯酚。

在本发明提供的具体实施例中，抑制剂为糠醛、乙酸、苯酚的混合物。

作为优选，菌株为酵母菌株。

在本发明提供的具体实施例中，菌株为酿酒酵母菌株。

本发明还提供了一种生物工程菌株，该生物工程菌株经如下一种或多种改造制得：

a)过表达基因YJL120W；

b)敲除基因YJR130C；

c)敲除基因YJR131W；

d)敲除基因YJL078C；

抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

作为优选，呋喃类抑制剂为糠醛，弱酸类抑制剂为乙酸，酚类抑制剂为苯酚。

在本发明提供的具体实施例中，抑制剂为糠醛、乙酸、苯酚的混合物。

作为优选，菌株为酵母菌株。

在本发明提供的具体实施例中，菌株为酿酒酵母菌株。

本发明提供了一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用，该基因选自基因YJL120W、YJR130C、YJR131W、YJL078C中的一种或多种；抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。本发明具有如下技术效果：

本发明所介绍的基因是在SCRaMbLE重排的基础上，结合生物信息学分析和RT-qPCR手段进行基因挖掘工作，得到了耐受性相关基因YJL120W、 YJL078C、YJR130C和YJR131W，并对它们进行功能验证，最终发现基因 YJL120W的过表达，基因YJL078C、YJR130C和YJR131W的删除能提升菌株耐受性，由于基因YJL120W的过表达对耐受性提升具有显著效果，对基因 YJL120W进行机制解析，最终发现基因YJL120W的过表达可以调控磷酸戊糖途径氧化阶段的基因表达量提升，提高胞内NADPH的含量，促进了糠醛的降解，最终提高菌株耐受性。

附图说明

图1示重排后筛选条件的确定；

图2示耐受性菌株文库构建全流程；

图3示重排筛选菌株的表征；

图4示synV和synX变异事件统计；

图5示删除区段71的菌株构建及验证和基因挖掘，其中图5a示区段71 的删除设计及验证；图5b示删除区段71的菌株的生长表征；图5c示yCT388 中区段71上下游基因的表达量变化；图5d示验证基因YJL120W的过表达菌株的耐受性；

图6示基因YJR130C和YJR131W敲除的表征；

图7示基因YJL078C敲除的表征；

图8示基因YJL120W过表达的表征；其中图8A、8B示在SC-His的培养条件；图8C、8D示SC-His+60％FAP的培养条件；

图9示基因YJL120W过表达在SC-His+50％水洗液的培养条件；

图10示敲除基因YJR130C提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征；其中图10A、10B示SC培养基条件；图10C、10D示40％FAP的SC培养基条件；

图11示敲除基因YJR131W提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征；其中图11A、11B示SC培养基条件；图11C、11D示40％FAP的SC培养基条件；

图12示敲除基因YJL078C提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征；其中图12A、12B示SC-His培养基条件；图12C、12D示40％FAP的SC-His培养基条件；

图13示基因YJL120W的影响磷酸戊糖途径基因表达量。

具体实施方式

本发明公开了一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，YJL120W、YJL078C、YJR130C和YJR131W的基因序列已经公开，具体序列如下：

YJL120W：

ATGACATTCGCAACCCAAGTTGGCGAAGTCAGAAGCAAGGATACTGGGAGCTATA ATTGGTTTGACCATTTTTTCTTGTGTGTTTACCTCGCTCTTGGAATTAGCAAATGGCC TTCTTGCATGAAATTGTATCGAGTTTGCTTTATTTTTCTTTTTACGGGCGGATTCTTT CTATTCTGGCTTTCCTATAACAGAGATCATGAAAGAAGTTCCAGCTTACGGATCAA GAAAGTACCTATACATATACAAAAATCTGATTACTTTCCCAGCTCGACTTGGATAG CTGTTCTTGTTTTCTCTTGGCGACACATTTTTTGTTTCTGA

YJL078C：

ATGCTGGAGTTTCCAATATCAGTTCTGCTAGGATGCCTAGTAGCCGTCAAGGCACA AACCACGTTTCCAAACTTCGAGAGCGATGTGCTGAACGAGCATAACAAGTTCAGAG CGCTACATGTTGACACAGCGCCGCTCACCTGGTCCGACACTCTGGCCACCTATGCG CAGAACTACGCCGACCAATATGATTGTTCGGGTGTCTTAACGCATTCCGATGGCCC ATATGGTGAGAACCTTGCCCTTGGTTACACAGACACGGGAGCGGTGGACGCCTGGT ACGGGGAGATAAGCAAGTATAATTATTCAAATCCCGGATTTTCTGAATCCACGGGT CACTTCACACAGGTGGTTTGGAAGTCAACCGCCGAGATTGGATGTGGTTATAAATA TTGTGGTACGACATGGAACAATTATATTGTGTGCTCCTACAACCCTCCTGGAAACT ACCTGGGTGAGTTTGCAGAGGAAGTGGAACCACTTATAAGCACTGTTTCCTCGTCC TCATCCTCGTCCTCTTCTACCTCAACTACATCAGACACAGTCTCCACCATCTCATCC AGTATTATGCCCGCTGTAGCGCAAGGGTATACAACAACGGTATCGTCTGCGGCTAG CAGCAGTTCTTTAAAATCGACGACCATAAACCCTGCCAAGACCGCTACCCTCACTG CGTCCTCTTCTACCGTAATTACTAGTAGCACAGAATCAGTTGGATCCTCCACTGTCT CATCAGCCTCAAGCTCTTCTGTCACTACTTCCTATGCTACCTCCTCGAGTACCGTCG TCTCTAGTGATGCTACTTCATCCACTACCACCACCTCATCGGTTGCTACATCGTCCA GTACCACTTCTTCCGACCCTACCTCGAGCACTGCTGCTGCTTCTTCTTCTGATCCTGC CTCAAGTTCCGCTGCCGCTTCCTCCAGCGCGAGTACCGAGAACGCCGCTTCTTCTAG CAGCGCCATCTCGAGCTCTTCATCAATGGTTTCTGCTCCTTTGAGTAGTACTCTTAC TACTTCCACCGCAAGCTCCAGAAGTGTAACTTCCAATTCAGTTAATTCTGTTAAGTT TGCAAACACAACTGTGTTTTCTGCTCAAACAACCTCTTCTGTAAGCGCCTCATTATC ATCATCTGTAGCTGCTGACGATATTCAGGGTAGCACTTCCAAGGAGGCCACAAGCT CAGTTTCCGAACATACTAGTATAGTAACTAGTGCAACTAATGCTGCCCAATATGCA ACGAGACTTGGGTCATCTTCCAGAAGTTCTTCCGGGGCCGTCTCTTCCTCAGCTGTG TCGCAATCTGTTCTGAATTCCGTTATAGCCGTCAACACCGACGTATCTGTAACCTCA GTTAGTAGCACAGCCCATACCACAAAGGACACCGCCACCACTTCAGTAACCGCCTCAGAAAGTATCACTTCGGAAACTGCTCAGGCTTCAAGTTCAACAGAGAAGAATATTA GTAACAGTGCCGCCACATCGAGTAGCATTTACTCCAACAGTGCTTCTGTGTCAGGA CACGGTGTAACATACGCTGCCGAATACGCCATTACATCCGAGCAATCCTCTGCGCT TGCCACATCTGTGCCTGCTACAAATTGCTCTAGTATCGTGAAGACCACAACTTTAGAAAATTCGAGTACCACAACCATCACAGCCATTACTAAGAGTACTACAACCTTGGCC ACTACTGCTAACAACTCCACAAGGGCAGCTACCGCAGTAACCATAGATCCCACATT GGACCCTACCGACAACTCAGCTAGTCCAACCGACAATGCTAAACACACCTCTACAT ATGGATCTTCTTCCACAGGCGCATCTTTAGATAGCTTACGCACAACCACCAGTATTAGTGTCTCAAGCAACACCACACAGTTAGTCTCTACCTGCACTTCCGAGAGCGATTAT TCCGATAGTCCTAGCTTCGCCATCTCCACTGCCACCACCACTGAAAGCAATCTGATC ACAAACACCATCACAGCTTCTTGTAGTACGGATAGTAATTTCCCTACCTCCGCTGCT TCTTCTACAGATGAGACGGCCTTCACTAGAACAATCTCGACATCTTGTAGCACTTTG AACGGCGCCTCAACCCAAACCAGTGAGCTAACCACATCGCCTATGAAAACCAACA CGGTGGTTCCAGCTTCTTCTTTCCCTTCAACTACAACCACTTGTCTAGAAAATGATG ACACTGCCTTTTCTAGTATCTACACTGAAGTCAACGCCGCAACTATCATTAACCCCG GAGAAACATCTTCTCTCGCTAGCGATTTCGCCACATCTGAAAAGCCAAACGAGCCC ACTTCTGTCAAATCCACCTCAAACGAAGGCACCTCTTCCACAACAACAACCTACCA ACAGACTGTTGCTACACTGTATGCCAAGCCCTCCAGCACAAGCCTAGGTGCAAGAA CAACTACTGGTAGCAACGGTCGTTCAACTACCAGCCAACAAGACGGGTCTGCCATG CATCAGCCAACTTCCTCGATCTACACTCAACTAAAAGAAGGCACATCAACCACCGC AAAACTTTCTGCATACGAAGGTGCTGCAACACCTCTTTCCATTTTCCAGTGCAATAG TCTAGCTGGAACGATTGCCGCTTTTGTCGTAGCTGTTCTGTTCGCCTTCTAG

YJR130C：

ATGATATCTAGAACCATTGGTGAATCTATTCCGCCCAACACAAAACATGCTGTTTC CGTGTGTTTGCCCACATGGGAAGCTACAGTAGGCTATGAAGAGGGTGAAAGCAGT ATAATTAACTCGCTTACTACCGGATATCCAAGATTTTTCATACACAAGTCAATAAA GAAATTATGTGAAATTTTATCCGCTAAGTACTCCATGGAAGATGAAGCTTGTCTTTG CTTCCCCTCTTACAAGGTTGCCAATAGGTGCAGAGAGTTTATCAAAGTGAAAACGG GTCTTTCTACCAAAGTACGCATCTTACAACTATGTACACCTAAACCTATGAACCAA GAGGAAAAGCTCTGGAGAAGGGAATGTAAAATCACGGTGGTGTTTGTAGACCAGG AAATATTCCCCGTGATGAAGCAGTATTGGCAACATTCTGGTGAGATTGTATCTAGC AGAATGGCGGAGTATATTTTACATGAATTACAAGTCAAGGATAATCTTAAGAAGAT GGAAACAGTGGATAACGGTAAAAAATTTATGACCGAAGATGAAAACAGAGTGAAC GAAGAATATATAGAAACGAGATTTGGGAGAAATTTAAATTTTCTTGCTGCTGATAA AGCCAAATATCTAATACGAAAGAGGATTGCCACAAAAGTTGTTGAAAAAATTGAC TCTGAAGGTCTATCGGACCTATTCTCTTTTGAACACTATAACGAGAGCAACGGTCC ATTCAATGTTGGCAGTGGAGAGGCTCTGGATGATGATCAGTTGAATTCGGACATAC CTGCCGAAACAATTACTTCTATGGGAGAAAGTGGCTCAAACAGTACTTTTGAAAAC ACAGCTACCGATGACTTGAAGTTTCATGTCAACCCTAATACGGATGTTTACTTATTT CCAAGTGGAATGGCGTCCATTTTCACTGCCCACAGGCTGCTTTTAAACTTCGATGCC AAGCGCTTATCAAGGTCTTCTAGTAGACAAGATAAGTTGATTGGATATGGACCTCC GTTCAAGAAGACCGTCATGTTTGGATTCCCATATACAGATACTCTGAGCATTCTTCG GAAGTTCAATCACACACATTTCTTGGGACAGGGAGATTCAACGTCAATGAACGCTC TGAAAAATATTTTACATTCTGGTGAGCAAATACTGGCGGTATTTATAGAAGCTCCA TCGAACCCACTGTTGAAAATGGGAGATTTACAAGAACTGAAAAGGCTATCAGACTT GTATTCATTTTACATAGTGGTCGATGAAACTGTGGGTGGCTTTGTCAATATAGATGT ATTACCGTATGCCGATATTGTTTGTAGTTCGCTAACGAAAATCTTCAGCGGCGACTC GAACGTTATTGCAGGATCCTTAGTACTAAATCCTAGAGGAAAGATTTATGAGTTTG CTAGAAAATTTATGAAGACTGAAGACGGATATGAAGATTGCCTATGGTGCGAAGA TGCGTTATGCCTGGAAAGAAATTCGAGAGACTTCGTGGAACGTACAATCAAGGTGA ATACAAACACTGATATATTGTTAAAAAGGGTGTTATTGCCTCAGGTGGGAAAATTG TTCAAGAAAATATATTACCCCAGTTTAACATCAGAGGATACCAAGCGGAATTATGA CAGCGTTATGTCTACAAAAGATGGTGGGTATGGAGGTTTATTTTCACTAACTTTTTT CAATATTGAAGAGGCAAAGAAGTTTTTCAATAATCTGGAATTGTGCAAAGGACCTT CTCTCGGTACGAATTTCACTTTGGCGTGTCCATATGCTATTATTGCCCACTACCAGG AATTAGACGAGGTAGCTCAATATGGTGTCGAAACAAATCTTGTAAGAGTGAGCGTC GGTTTGGAAAATAGCGACGTTTTATGCAATGTTTTTCAGCGTGCCATTGAGAAAGC TTTAGGGGAATAA

YJR131W：

ATGAAGAACTCTGTCGGTATTTCAATTGCAACCATTGTTGCTATCATAGCAGCTATA TACTATGTGCCATGGTACGAACACTTTGAGAGAAAGTCACCGGGGGCCGGAGAAA TGAGAGATCGGATTGAAAGCATGTTCTTGGAATCGTGGAGAGACTATTCCAAGCAT GGCTGGGGATACGATGTGTATGGACCTATTGAGCACACTTCCCATAATATGCCTCG TGGCAACCAGCCGTTAGGCTGGATTATCGTAGATTCAGTGGATACCTTGATGTTAA TGTATAACTCCTCCACACTATACAAAAGTGAGTTCGAGGCAGAAATTCAGAGATCG GAGCATTGGATAAACGATGTTTTGGATTTTGATATTGATGCCGAAGTGAATGTTTTT GAAACTACTATTAGAATGCTAGGTGGTTTATTATCCGCATATCATCTATCTGATGTT TTAGAAGTAGGTAATAAGACTGTCTACTTGAACAAAGCAATAGATTTGGGGGATAG GCTTGCTTTGGCGTTCTTATCCACTCAGACCGGAATTCCATACTCAAGTATAAACCT TCATAGTGGCCAAGCGGTTAAGAACCATGCAGATGGGGGGGCATCTTCTACCGCAG AATTCACTACGCTACAAATGGAATTCAAATATCTGGCGTATTTGACAGGAAATCGT ACTTATTGGGAGCTGGTGGAGCGTGTTTACGAGCCATTATACAAAAATAACGATCT TCTAAATACCTACGATGGATTGGTTCCAATTTATACATTTCCAGATACTGGGAAGTT TGGTGCTTCGACTATCCGGTTCGGATCAAGAGGTGATTCTTTTTATGAGTATTTACT AAAACAATATTTATTGACGCACGAAACACTTTATTATGATCTGTACAGAAAATCCA TGGAAGGTATGAAAAAGCATTTATTAGCACAATCCAAACCCTCTTCTCTGTGGTAC ATTGGGGAAAGAGAACAAGGTCTACATGGACAACTTTCTCCTAAGATGGACCACCT CGTGTGCTTTATGGGGGGATTGTTAGCATCAGGCTCTACTGAGGGCCTTTCTATTCA TGAAGCCCGAAGACGTCCGTTTTTCTCTCTTTCCCTTGAAAGAAAAAGTGACTGGG ATTTGGCTAAAGGGATAACTGACACATGTTATCAAATGTACAAGCAGTCTTCCTCG GGGCTTGCGCCTGAAATCGTTGTCTTCAATGATGGAAACATAAAACAGGATGGTTG GTGGCGGTCGTCTGTGGGTGATTTTTTTGTTAAACCACTCGATAGGCACAACCTACA AAGACCAGAAACGGTGGAATCGATTATGTTCATGTATCATTTATCTCATGATCACA AATATCGTGAATGGGGGGCGGAAATCGCAACTAGCTTCTTTGAAAATACCTGTGTT GATTGTAATGACCCAAAATTAAGGCGGTTCACCAGTTTAAGTGATTGTATCACGTT ACCTACAAAGAAATCTAACAATATGGAAAGTTTCTGGTTGGCAGAGACTTTAAAGT ATTTATATATATTGTTTTTAGACGAGTTTGATTTGACCAAAGTTGTTTTCAACACAG AAGCTCATCCTTTTCCAGTATTAGACGAAGAAATATTAAAATCGCAGTCTCTGACCACAGGTTGGTCGTTGTAG

本发明中所用原料或试剂、仪器均可由市场购得。

其中，出发菌株yXZX1875、ySC041和菌株yCT89-2、yCT89-3、yCT104-3、 yCT138-1、yCT153、yCT405、yCT646、yCT649、yCT651、BY4741、 BY4741+pRS413由天津大学元英进实验室提供，复合抑制剂是指糠醛、乙酸、苯酚混合物(FAP)，是纤维素水解液中抑制成分的代表物质，对酵母生长起到严重抑制作用，纤维素水洗液由玉米秸秆经氢氧化钠预处理制备。

FAP母液浓度：乙酸5.3g/L，糠醛1.3g/L，苯酚0.5g/L。

表1不同浓度FAP组成

浓度	乙酸(g/L)	糠醛(g/L)	苯酚(g/L)
				30％	1.59	0.39	0.15
40％	2.12	0.612	0.2
				50％	2.65	0.65	0.25
60％	3.18	0.78	0.3

以下实施例中，基因的过表达和敲除均为本领域常规技术操作。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1出发菌株的复合抑制剂耐受性检测和筛选条件的确定

出发菌株yXZX1875具有环形合成型V号染色体和线型合成型X号染色体(ring_synV&synX)；出发菌株ySC041具有环形合成型V号染色体及环形合成型X号染色体(ring_synV&ring_synX)。

将yXZX1875和ySC041在含有不同浓度FAP的固体平板上进行稀释点板，观察它们在不同浓度下的长势情况。最终得到以40％FAP浓度作为基因组重排的筛选压力，如图1所示。

实施例2基因组重排

将质粒pRS413和pCRE4转化进入出发菌株yXZX1875、ySC041，后续进行染色体诱导重排。

SCRaMbLE诱导重排

1.将验证已导入pCRE4和携带目的基因的质粒的菌株挑取3个单菌落接入5mL SC-His培养基中，30℃条件下置于220r/min摇床过夜培养。

2. 5000rpm离心收集菌体，用无菌水清洗3次，确保无葡萄糖残留。

3.转接菌液至5mL含有1μM***的2％SGal-His半乳糖培养基，使控制OD₆₀₀为1，30℃下置于220r/min摇床诱导8h。

4. 5000rpm离心收集菌体，菌体用无菌水清洗3次，确保无半乳糖和***残留。

5.按照一定稀释比例涂布在含抑制剂的平板中，放入30℃培养箱培养 3-5天。

此时，初步得到一批菌株文库，将长势良好的菌株进行保存，并以两种策略进行耐受性提升的改造。第一种策略是对菌株进行一段时间的适应性进化后，再进行下一轮的重排，第二种策略是直接进行下一轮重排，以此都获得了耐受性的进一步提升的菌株。

实施例3连续传代退化获得表型稳定的菌株文库

为保证菌株增强表型稳定，在基因组重排后进行连续传代退化操作，因为菌株包含pCRE4质粒，所以退化实验在SC-His中进行。

1.将重排筛选出的菌株接种在含有200μL SC-His培养基的96孔板中，用微孔板恒温振荡器在30℃下过夜培养。

2.准备新的96孔板，添加180μL SC-His培养基，从第一步的96孔板中转接20μL菌液，继续进行培养。

3.重复操作2六次。

4.转接菌液至200μL加入一定量抑制剂的SC-His培养基中，控制OD₆₀₀为0.5，30℃下培养3～4天。

5.测量菌株OD₆₀₀，将能快速生长的菌株在SC-His培养基中涂布以备后续实验使用，并制备甘油菌保存在﹣80℃冰箱中。

7天后在含有抑制剂浓度高于筛选出发菌株的培养基中培养，监测菌株生长情况，筛选出生长较快速的菌株，在含有60％FAP的YPD平板上进行稀释点板，最终发现重排筛选菌株在平板上的长势都明显优于出发菌株，说明重排筛选菌株耐受表型是稳定的。

操作全流程见图2，最终得到54种耐受性稳定增强的菌株，构成表型稳定的耐受性菌株文库，并且可以依照上述方法继续进行菌株文库的扩建。从文库中筛选到的5株表型优异的菌株的表征如图3所示，后续将对这5株进行***分析。

实施例4基因组变异信息分析

synV和synX被在染色体上分布的loxPsym位点分成175和248个区段， SCRaMbLE发生的染色体重排都是通过不同的区段之间发生的删除、复制、反转、易位导致的。通过生物信息学手段统计loxPsym位点两侧序列与参比序列之间的差异，最终得到yCT89-2、yCT89-3、yCT104-3、yCT153、yCT138-1 共5株菌株的发生在synV和synX发生的基因组变异数据。

表2图4原始数据

由上表结合生物信息学软件以及PCR验证结果，确定了各个菌株发生在 synV和synX上发生的结构变异。

实施例5耐受FAP基因的挖掘

对于区段的反转、删除、复制等结构变异，本发明从synX上 183738-184470bp的删除中发掘到上游基因YJL120W的过表达会提升菌株耐受性，如图5所示；从synX的631427-637507bp的删除中发掘到内部的基因YJR130C和YJR131W的删除会提升菌株耐受性，如图6所示；从synX的 276636-585463bp的反转挖掘到反转接口附近的基因YJL078C的删除会提升菌株耐受性，如图7所示。具体操作如下：

以yXZX1875出发筛选的重排菌株和ySC041出发筛选到的重排菌株中均出现了synX上183738-184470bp(区段71)的删除，据此推测该处区域的缺失会提升对复合抑制剂的耐受性。为了验证这一推测，使用URA3作为筛选标签以酵母同源重组的方式在野生型菌株BY4741删除与基因组中与区段71同源的731bp的片段，将正确敲除的菌株命名为yCT388。

通过RT-qPCR技术检测yCT388和BY4741中该区域上下游的三个基因 YJL121C、YJL120W、YJL117W的表达量，观察这些基因是否受到影响。对菌株BY4741和yCT388分别提取RNA，并对RNA进行反转录，得到cDNA，以cDNA为模板，检测三个基因的表达量。结果显示yCT388中YJL121C的表达量降低至BY4741的0.33，而YJL120W的表达量提高至BY4741的10.36 倍，YJL117W则几乎不受影响。

已有文献指出YJL121C的缺失会造成酿酒酵母菌株对糠醛的耐受性降低，因此该基因的表达量的降低应当不会提升菌株对复合抑制剂的耐受性，起作用的可能是YJL120W的过表达。为了验证YJL120W的功能，需要在菌株内部过表达该基因观察菌株对复合抑制剂的耐受性是否会有提升，结果显示yCT405的生长情况较对照菌株有明显提升，这说明YJL120W的过表达可以提升酿酒酵母对复合抑制剂的耐受性。以上述方法也挖掘到耐受性相关的基因YJR130C、YJR131W和YJL078C。

实施例6基因YJL120W过表达提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征

菌株yCT405是基因YJL120W过表达的菌株，是将基因YJL120W组装到pRS413并导入BY4741。如图8所示，在不含抑制剂的SC-His培养基中，菌株yCT405和BY4741+pRS413进行发酵，从生长曲线可看出，在正常条件下，两株菌株的生长速率几乎一致，在4h左右即可进入对数期，在16h左右就进入到平台期，菌株最终的生长密度都在5-6之间。菌株对葡萄糖的消耗速率也基本一致，分别是1.30g/L/h和1.34g/L/h，乙醇生产速率分别是0.67 g/L/h和0.63g/L/h，乙醇的产率分别是91.63％和83.44％；

在60％FAP的培养条件下，菌株yCT405和BY4741+pRS413都受到了很强的抑制效果，其中对照菌株受到抑制作用尤其明显。yCT405的延迟期再度延长，到了12h左右才进入对数期，36h左右进入平台期，菌株的生长密度下降到了2-3之间。出发菌株的延迟期则长达约136h，进入对数期后，生长也极为缓慢，到了172h左右才进入平台期，菌株的生长密度降低到了 2-3之间。葡萄糖的消耗速率yCT405大约是0.52g/L/h，出发菌株大约是0.12 g/L/h，乙醇生产速率分别为0.25g/L/h和0.05g/L/h，乙醇产率分别为95％和 91％。

在50％水洗液的培养基的条件下，菌株yCT405和BY4741+pRS413进行发酵。结果显示，在该抑制条件下，yCT405在4h左右进入对数期，20h 左右就进入了平台期，细胞最终生长密度在4-5之间。出发菌株延迟期较长，大约在40h才进入对数期，76h左右进入平台期，细胞最终生长密度在3-4 之间。yCT405约为1.12g/L/h，出发菌株约为0.24g/L/h，乙醇生产速率分别为0.58g/L/h和0.1g/L/h，乙醇产率则分别为99.12％和86.14％(图9)。

由上述结果得到，yCT405的性能优异，发酵参数仅略低于无抑制条件，这说明YJL120W的过表达对菌株的耐受性有巨大提升。

实施例7敲除基因YJR130C提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征

菌株yCT646是敲除基因YJR130C的BY4741菌株。如图10所示，在没有抑制作用的时候，yCT646与BY4741在生长上几乎是一致的，它们都在4 h左右进入到对数期，在18h左右就进入到平台期，菌株最终的生长密度都在5-6之间，葡萄糖消耗速率分别是1.02g/L/h和1.26g/L/h，乙醇生产速率分别是0.43g/L/h和0.54g/L/h，乙醇的产率分别是85.71％和84.06％；

40％FAP的条件下显示，两株菌的生长相较于正常条件下都受到了抑制作用，其中yCT646表现出更快的生长速率，延迟期维持了大约12h，32h 左右进入到平台期，最终细胞生长密度在3左右。而BY4741在该条件下生长速率更为缓慢，进入对数期的时间大约在28h，48h左右进入平台期，最终细胞密度在4左右。yCT646的葡萄糖消耗速率为0.54g/L/h，乙醇生产速率约为0.26g/L/h，乙醇产率为93.93％，BY4741的葡萄糖消耗量约为0.4 g/L/h，乙醇生产速率约为0.19g/L/h，乙醇产率为96.01％。

实施例8敲除基因YJR131W提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征

菌株yCT649是敲除基因YJR131W的BY4741菌株。如图11所示，在没有抑制作用的时候，yCT649在4h左右进入对数期，20h左右进入平台期，与BY4741相比各项参数几乎一致，葡萄糖消耗速率约为1.01g/L/h，乙醇生产速率约为0.42g/L/h，乙醇的产率约为83.23％。这说明YJR131W的敲除也对菌株没有造成过大的影响；

而在40％FAP的条件下，yCT649的生长也受到了明显的抑制作用，不过各项参数表征要优于BY4741。yCT649在12h左右进入对数期，32h左右进入平台期，最终细胞密度在3左右。葡萄糖的消耗速率约为0.56g/L/h，乙醇生产速约为0.22g/L/h，乙醇产率约为80.83％。

实施例9敲除基因YJL078C提升酿酒酵母对FAP的耐受性的表征

菌株yCT651是敲除基因YJL078C的BY4741菌株。如图12所示，yCT651 的生长和发酵性能也与BY4741进行了比较，在SC培养基中，两株菌株各项表征参数相似，yCT651在6h左右进入对数期，22h左右进入平台期，葡萄糖消耗速率约为1.26g/L/h，乙醇生产速率约为0.48g/L/h，乙醇产率约为 89.12％，这表明了YJL078C的敲除对于菌株自身的生长没有太大的影响；

在40％FAP的环境下，yCT651也受到了明显的抑制作用，不过生长和发酵性能各项参数优于BY4741。yCT651在12h左右进入对数期，32h左右进入平台期，最终细胞密度在3-4之间。葡萄糖消耗速率约为0.59g/L/h，乙醇生产速率约为0.27g/L/h，乙醇产率约为97.36％。

实施例10基因YJL120W的耐受机制解析

NADPH可以加速糠醛转化成低毒性的糠醇，进而减小对细胞的抑制作用，酵母体内NADPH主要通过磷酸戊糖途径氧化阶段生产，因此可以尝试探究基因YJL120W与磷酸戊糖途径的关联。因此对yCT405和BY4741中的磷酸戊糖途径上的19个基因的表达量进行了检测，如图13所示，RT-qPCR 结果显示，氧化阶段的基因YNL241C、YCR073W-A、YGR248W、YNR034W、YGR256W、YHR183W的表达量都是有一定提升的，而非氧化阶段的基因中只有YBR117C表达量提升，其余基因表达量都或多或少降低了。因此推得在菌株内部YJL120W的过表达或许可以调控磷酸戊糖途径氧化阶段的基因表达量提升，NADPH的含量也随之提升，并促进了糠醛的降解，恢复菌株的生长和发酵。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用，其特征在于，所述基因选自基因YJL120W、YJR130C、YJR131W、YJL078C中的一种或多种；

所述抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述呋喃类抑制剂为糠醛，所述弱酸类抑制剂为乙酸，所述酚类抑制剂为苯酚。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为糠醛、乙酸、苯酚的混合物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌株为酵母菌株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌株为酿酒酵母菌株。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其特征在于，所述基因YJL120W正调控菌株对抑制剂耐受性，所述基因YJR130C、YJR131W、YJL078C负调控菌株对抑制剂耐受性。

7.一种提高菌株对抑制剂耐受性的方法，其特征在于，包括如下一种或多种改造：

a)过表达基因YJL120W；

b)敲除基因YJR130C；

c)敲除基因YJR131W；

d)敲除基因YJL078C；

所述抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌株为酵母菌株。

9.一种生物工程菌株，其特征在于，所述生物工程菌株经如下一种或多种改造制得：

a)过表达基因YJL120W；

b)敲除基因YJR130C；

c)敲除基因YJR131W；

d)敲除基因YJL078C；

所述抑制剂选自呋喃类抑制剂、弱酸类抑制剂、酚类抑制剂中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的生物工程菌株，其特征在于，所述菌株为酵母菌株。

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