CN110195070A

CN110195070A - 大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用

Info

Publication number: CN110195070A
Application number: CN201910467006.2A
Authority: CN
Inventors: 王智文; 陈聪; 张双虹; 王倩; 李书廷; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110195070B

Abstract

本发明公开了大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用，大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp，所述突变基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示；大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示。本发明所构建的包括大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌株，生物安全，遗传背景清晰，包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌株在细菌耐药性机制研究方面具有重要应用。

Description

大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用

技术领域

本发明属于大肠杆菌遗传工程及抗生素耐药性的研究领域。具体地涉及一种大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)及该基因编码的氨基酸序列及应用。

背景技术

自1928年弗莱明发现青霉素开始，人们通过培养细菌获得次级代谢产物或者人工合成的方法获得了多种抗生素。抗生素不仅广泛应用于细菌感染性疾病治疗，而且应用于动物饲料添加剂的开发及动物疾病预防等方面。随着抗生素的广泛使用，耐受抗生素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以及携带NDM-1基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌(NDM-1)等“超级耐药菌”相继出现，而在医疗方面，新药开发停滞不前，使人类在医学用药的选择、兽医临床和食品安全等领域面临严峻挑战。此外，抗生素的使用使得抗生素进入水环境、土壤和沉积物中，造成了严重的环境污染,如Chen等研究发现人类活动频繁的珠江流域四环素抗性基因的频率和种类明显高于珠江河口地区(Chen,Liang,Huang,Zhang&Li,etal.2013)。因此，对细菌抗生素耐药性的研究成为热点。

微生物细胞具有精确严密的代谢调控网络，能够通过调控因子调控特异基因的表达来调节细胞的生长状态以适应外界环境的变化。CRP(cAMP受体蛋白)是大肠杆菌的全局调控因子之一，它能够调控其它20多种转录调控因子的表达从而间接调控下游基因的表达。CRP是一个同源二聚体蛋白，每个亚单位包括3个结构域：位于N端的蛋白二聚作用位点，能与cAMP结合改变构型的结构域，由第1-134位残基构成；位于C端的HTH结构的DNA结合结构域，由第140-209位残基构成；以及连接着两个结构域的铰链区。N端由3个α-螺旋和8个β-转角组成，负责变构效应物cAMP的结合及亚基二聚化的结构域；C端由3个α-螺旋和4个β-转角组成。CRP的突变可能通过调节下游基因表达，从而改变细胞的生长状态提高环境适应性或者将抗生素运送出细胞外，降低细菌对抗生素的敏感性，表现出抗生素耐药性(Uppal&Jawali.2016)。已有研究表明crp基因的突变对于提高微生物的耐药性有重要影响，Garst等研究发现CRP蛋白第128位苏氨酸突变为丝氨酸或者第13位谷氨酸突变为苯丙氨酸的突变菌株可能表现出抗生素耐药表型(Garst,Bassalo,Pines,Lynch,Halweg-Edwards,&Liu,et al.2016)。因此，鉴定细菌抗生素耐药性相关基因在细菌耐药性机制研究方面具有重要应用。

目前，研究大都以肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等多药耐药性菌株作为模式生物来研究抗生素多药耐药性，尚未有大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)在抗生素多药耐药性研究领域的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp。

本发明的第二个目的是提供大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp所编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供包括大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp的工程菌。

本发明的第四个目的是提供上述工程菌在细菌耐药性机制研究的应用。

本发明的技术方案概述如下：

大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)，所述突变基因的核苷酸序列是SEQ IDNo.1所示。

大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2所示。

包括所述的大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌。

上述工程菌在细菌耐药性机制研究的应用。

本发明所构建的包括大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌株，生物安全，遗传背景清晰，包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌株在细菌耐药性机制研究方面具有重要应用。

附图说明

图1为包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp的工程菌(简称工程菌株E.coliMG6)对庆大霉素耐药性验证。

图2为工程菌株E.coli MG6对甲砜霉素耐药性验证。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株E.coli MG1655来源为ATCC保藏的典型菌株(700926)。

本发明所用到的限制性内切酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

实施例1

全局调控因子突变文库的设计和高通量合成

基于CRISPR可追踪基因工程(CRISPR enabled trackable genome engineering,CREATE)***，包括三个质粒：***糖诱导Cas9蛋白表达的质粒X2-cas9、热激诱导表达λ-red重组***的温度敏感型质粒pSIM5、gRNA和供体DNA表达的全局调控因子突变文库质粒(Garst,Bassalo,Pines,Lynch,Halweg-Edwards,&Liu,et al)。全局调控因子突变文库质粒盒子序列总共200bp，包括17bp子文库引物序列、100bp同源臂、4bp间隔序列、35bp gRNA启动子序列、gRNA序列与Cas9蛋白结合的序列。通过将混合的文库质粒转化进入大肠杆菌，实现一次转化下的多个细胞的突变。

本发明中所用到的全局调控因子突变文库包含大肠杆菌23个全局调控因子涉及的34340个突变，是根据调控因子数据库RugulonDB和Ecocyc的分析选择了23个全局调控因子，然后从数据库RugulonDB，NCBI和Ecocyc中提取最可能对靶位点(即DNA结合位点，活性位点，二聚化位点和预测位点)的调节因子具有功能性影响的位点作为调控因子饱和突变位点，利用全局调控因子突变文库自动化设计工具Bioverse(http://www.thebioverse.org/)设计突变文库，设计的文库序列经由美国安捷伦公司(AgilentTechnologies)合成。通过公司合成的全局调控因子突变文库片段，首先经过20轮PCR延伸反应，然后延伸产物利用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)胶分离和纯化。纯化后的产物作为模板，利用设计的引物进行子文库的扩增，扩增产物进一步经过纯化，最后利用Gibson组装方法连接到全局调控因子突变文库载体质粒，获得5个质粒形式的不同子文库，这五个文库分别命名为G1，G2，G3，G4和G5，每个文库的信息详见表1。

表1文库的分类

实施例2

基于全局调控因子突变文库构建大肠杆菌突变体库

(1)采用电转法将X2-cas9质粒导入到菌株E.coli MG1655操作流程如下：

将-80℃冻存的野生型E.coli MG1655在LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有5ml LB液体培养基的试管中，在37℃、220rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在37℃、220rpm培养大约2h，至OD₆₀₀为0.35。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用预冷的无菌水和10％甘油各洗两次，然后用1mL预冷的10％甘油重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管100μl，得到制备好的MG1655感受态。向MG1655感受态中加入3μl X2-cas9质粒，混匀后加入电击杯中，使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪在1.8KV条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800μl LB液体培养基，然后在37℃、220rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在含有终浓度为40μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养至长出单菌落，用菌落PCR验证，得到X2-cas9质粒正确导入的菌株E.coli MG1。

(2)采用电转法将质粒pSIM5导入到菌株E.coli MG1操作流程如下：

将菌株E.coli MG1在含有终浓度为40μg/mL卡那霉素LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有终浓度为0.4％***糖、40μg/mL卡那霉素的5ml LB液体培养基的试管中，在37℃、220rpm培养12h。之后以1％的接种量接种到装有终浓度为0.4％***糖、40μg/mL卡那霉素的100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在37℃条件下培养大约2h，直至OD₆₀₀为0.35。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用预冷的无菌水和10％甘油各洗两次，然后用1mL预冷的10％甘油重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管100μl，得到制备好的E.coliMG1感受态。向E.coli MG1感受态中加入3μl预冷的pSIM5质粒，混匀后加入电击杯中，使用电穿孔仪在1.8KV条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800μl LB液体培养基，然后在30℃、220rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在含有终浓度为40μg/mL卡那霉素和30μg/mL氯霉素的LB平板上，30℃培养至长出单菌落，用菌落PCR验证，得到pSIM5质粒正确导入E.coli MG1的菌株E.coli MG2。

(3)采用电转法将全局调控因子突变文库质粒(G1、G2、G3、G4、G5)、空白对照ntg质粒、估计重组效率的galk-off质粒(Garst,Bassalo,Pines,Lynch,Halweg-Edwards,&Liu,et al)分别导入到菌株E.coli MG2获得不同转化子操作流程如下：

将E.coli MG2在含有终浓度为40μg/mL卡那霉素和30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有终浓度为0.4％***糖、40μg/mL卡那霉素、30μg/mL氯霉素的5ml LB液体培养基的试管中，在30℃、220rpm培养12h。之后以1％的接种量接种到装有终浓度为0.4％***糖、40μg/mL卡那霉素、30μg/mL氯霉素的100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、220rpm培养大约2h，直至OD₆₀₀为0.35。然后在42℃水浴条件下诱导15min，之后将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用预冷的无菌水和10％甘油各洗两次，然后用1mL预冷的10％甘油重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管300μl，得到制备好的E.coli MG2感受态。向E.coli MG2感受态中分别加入3μl透析后的全局调控因子突变文库质粒(G1、G2、G3、G4、G5)、空白对照ntg质粒、估计重组效率的galk-off质粒，混匀后加入电击杯中，使用电穿孔仪在2.5KV条件下电击约6.0ms,电击后迅速加入1mL LB液体培养基，将菌液转移至含4mL LB液体培养基的试管中，在30℃、220rpm复苏培养3h。复苏培养后，含全局调控因子突变文库质粒或ntg质粒的菌液取10μl涂布到含有终浓度为100μg/mL奇霉素的LB培养基上，含galk-off质粒的菌液取10μl涂布到含有终浓度为1％半乳糖和100μg/mL奇霉素的麦康凯琼脂培养基上，30℃培养至长出单菌落。涂板后，将试管中剩余菌液取1mL转移至装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中扩大培养，培养12h后保菌，得到含ntg质粒的对照菌株记为E.coli MG3(对照菌株)，含galk-off质粒的菌株记为E.coli MG4(估计重组效率)，及全局调控因子突变文库重组菌群(突变体库)。

LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。

LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度15g/L)，0.1Mpa压力下灭菌20min。

含1％半乳糖的康凯琼脂培养基配方为：蛋白胨17g/L，胨3g/L，胆盐1.5g/L，氯化钠5g/L，琼脂糖13.5g/L，中性红0.03g/L，结晶紫0.001g/L，1％半乳糖，0.1Mpa压力下灭菌30min。

本发明中的菌株代号如E.coli MG1、E.coli MG3等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。

实施例3

庆大霉素耐药性筛选及适应度分析

(1)在庆大霉素胁迫条件下的耐药性筛选

将E.coli MG3、E.coli MG4和全局调控因子突变文库重组菌群在装有终浓度为100μg/mL奇霉素的5mL LB液体培养基的试管中培养12h，然后将整管菌液接种到装有终浓度为100μg/mL奇霉素和50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，在37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为4.5。以初始接种量OD₆₀₀为0.1接入到装有终浓度为10μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，在37℃、220培养至优势菌群表现出明显生长优势，逐渐提高庆大霉素的浓度到20μg/mL再到30μg/mL，经过3次从低浓度到高浓度庆大霉素的转接及富集，可以筛选出正向突变富集文库菌群G2。

(2)全局调控因子突变的适应度分析

对筛选得到的正向突变富集文库菌群G2提取混合质粒，之后进行illumina测序(详细的测序过程可参考公开发表文献4)得到富集数据，然后进行不同突变的适应度分数计算，计算公式如下：

F_x,f是全局调控因子突变文库质粒盒子X在筛选后富集的频率，F_x,i是全局调控因子突变文库质粒盒子X在筛选前的频率，W表示每个突变的绝对适应度，突变的频率是指测序中的每个突变在测序中所有read counts所占的比例。通过适应度分数的计算，得到了与庆大霉素耐药性相关的突变基因crp(V140W)，其适应度分数为11.1088135691。上述突变基因即为大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)，该突变基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2所示。

实施例4

耐受庆大霉素突变菌株的重构

采用CRISPR基因组编辑***将突变基因crp(V140W)引入到E.coli MG1655的过程是通过Golden Gate组装构建出gRNA质粒、通过PCR及PCR融合构建出外源DNA片段，然后借助CRISPR基因组编辑***，将gRNA质粒和外源片段共转化进入感受态中，引入突变。

(1)gRNA质粒pGRC的构建的操作流程如下：

gRNA质粒的构建是通过Golden Gate反应完成的。利用引物pGRC-F/pGRC-L(SEQID No.3/SEQ ID No.4)，以质粒pGRB为模板(Li,Lin,Huang,&Yan,et al)，进行PCR扩增获得片段长度为2130bp的质粒骨架。将PCR得到的片段进行纯化，之后用核酸蛋白定量仪(Bio-Rad公司)定量DNA片段的浓度，按照Golden Gate克隆反应体系的要求配制反应体系，置于PCR仪中进行扩增，再进行转化和培养，挑取单克隆进行菌落PCR验证。用引物pGRC-test-F/pGRC-test-L(SEQ ID No.5/SEQ ID No.6)对构建完成的质粒进行PCR验证，扩增的PCR片段长度为365bp，将PCR片段送金维智公司测序，得到正确的质粒，该质粒命名为pGRC。

(2)外源供体DNA片段构建的操作流程如下：

利用140W-F1/140W-L1(SEQ ID No.7/SEQ ID No.8)和140W-F2/140W-L2(SEQ IDNo.9/SEQ ID No.10)两对引物，以E.coli MG1655基因组为模板，使用Fast Pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为830bp和700bp的上下游同源臂140W*-F和140W*-B。140W*-F和140W*-B的PCR片段经切胶回收后，利用引物140W-F1/140W-L2(SEQ ID No.7/SEQIDNo.10)，以140W*-F和140W*-B为模板，融合PCR得到突变crp(V140W)所需外源片段，长度1472bp。操作流程中使用的引物序列详见表2。

表2菌株构建所用引物序列

(3)CRISPR基因组编辑***实现crp(V140W)突变操作流程如下：

第一步：将pTKREDCas9质粒(Lin,Xu,Li,&Wang,et al)导入到野生型E.coliMG1655中，该菌株记为E.coli MG5,此处需说明pTKREDCas9质粒的抗性是奇霉素，电转后涂布含有100μg/mL奇霉素抗性的LB平板，其余步骤参考实施例1(2)。

第二步：将质粒pGRC和外源供体DNA片段共转化进E.coli MG5。将E.coli MG5在装有终浓度为100μg/mL奇霉素的LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有终浓度为100μg/mL奇霉素和5ml LB液体培养基的试管中，在30℃、220rpm培养12h。之后以1％的接种量接种到装有终浓度为2mM IPTG、100μg/mL奇霉素及100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、220rpm培养2.5h，直至OD₆₀₀长至0.35。然后将三角瓶取出置冰上冷却10min，之后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用预冷的无菌水和10％甘油各洗两次，然后用1mL预冷的10％甘油重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管100μl，得到制备好的E.coli MG5感受态。向E.coli MG5感受态中加入pGRC质粒和外源供体DNA片段，混匀后加入电击杯中，使用电穿孔仪在1.8KV条件下电击约4.5ms,电击后迅速加入800μl LB液体培养基，在30℃、220rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在装有终浓度为100μg/mL奇霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养至长出单菌落。挑取单菌落PCR验证质粒是否导入，得到正确的突变菌株，之后借助gRNA质粒消除***消除gRNA质粒。正确的克隆在含有4％***糖的LB液体培养基中培养10h后在含有100μg/mL奇霉素LB平板上划线，培养后长出的菌落对点在含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，不具有氨苄青霉素抗性的菌株说明其gRNA质粒消除，将其在LB培养基中37℃条件下培养，消除温度敏感型质粒pTKRedCas9。最终，得到经测序后的仅含有目的突变的重构菌株，引入突变基因crp(V140W)的菌株命名为E.coli MG6。

Golden Gate克隆反应体系为：10X T4DNAligase缓冲液1μl、Thermo FastdigestBsaI 0.5μl、Cut Smart 1μl、T4DNA连接酶0.5μl、DNA模板2.5μl、加双蒸水补齐至总体积为10μl。

Fast Pfu DNA聚合酶扩增体系为:5X TransStart Fast Pfu DNAPolymerase缓冲液10μl、dNTP 5μl、DNA模板2-10μl、引物各2μl、TransStart Fast Pfu DNA聚合酶1μl、加双蒸水补齐至总体积为50μl。

实施例5

工程菌株E.coli MG6对于不同抗生素的耐药性验证

(1)工程菌株E.coli MG6对庆大霉素耐药性验证的操作流程如下：

分别将菌株E.coli MG1655和E.coli MG6接入装有终浓度为30μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，250mL锥形瓶装液量为50mL，在37℃、220rpm培养12h。

耐药性验证结果见图1。从耐药性验证结果可以看出，相对于野生型E.coliMG1655，包含有大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌(E.coli MG6)显著提高了菌株对庆大霉素的耐药性。

(2)工程菌株E.coli MG6对甲砜霉素耐药性的验证操作流程如下：

分别将菌株E.coli MG1655和E.coli MG6接入装有终浓度为100μg/mL甲砜霉素的LB液体培养基中，250mL锥形瓶装液量为50mL，在37℃、220rpm培养12h。

耐药性验证结果见图2。从耐药性验证结果可以看出，相对于野生型E.coliMG1655，包含有大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp(V140W)的工程菌(E.coli MG6)显著提高了菌株对甲砜霉素的耐药性。

接种方式为：LB平板活化菌株，37℃过夜培养，挑取单菌落接种5mL LB液体培养基的试管，培养12h后，以初始OD₆₀₀为0.1的接种量接种到LB液体培养基。

实施例6

大肠杆菌全局调控因子突变基因crp(V140W)引入后细胞的转录调控变化

(1)总RNA的提取采用全式金生物公司的Easy Pure RNAKit。具体操作步骤如下：

将菌株E.coli MG1655和E.coli MG6在37℃、220rpm条件下培养长至对数中期。将离心机预冷至4℃，收集1.5ml菌体，13000rpm离心2min。离心后，用枪头去除全部培养基上清，再用100μl含有溶菌酶的TE缓冲液彻底重悬菌体。之后加入350μl BB4(用前需加入β-巯基乙醇)，漩涡震荡混匀，室温孵育5分钟。用无RNA酶的针管反复吹吸几次，使溶液均质化，室温条件下12000rpm离心2min，吸上清于RNase-free的离心管中，向上清液中加入250μl无水乙醇，混匀后转移至离心柱中，12000rpm离心30s，弃掉流出液。之后向离心柱中加入500μl CB4，室温12000rpm离心30s，弃掉流出液。再加入500μl WB4，室温12000rpm离心30s，弃掉流出液，并重复一次。之后室温12000rpm离心2min，为了去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱，然后将离心柱转移至一个新的1.5mLRNase-free离心管中，向离心柱中央加入30-100μLRNase-free Water，室温静置1min，室温12000rpm离心2min，洗脱RNA，置于-80℃保存。

(2)cDNA的合成采取全式金生物公司的One-step gDNAremoval and cDNASynthesis试剂盒。具体操作步骤如下：

将已提取的RNA及试剂Random Primer、2×TS Reaction Mix、RNase-free Water置于冰上。在PCR管中加入10μl 2×TS Reaction Mix，1μl RNA样品，1μl gDNAremover，1μlRandomPrimer，6μl RNase-free Water，1μl Enzyme Mix，混匀后，25℃孵育10min，50℃孵育15min，之后在85℃加热5s失活酶活性，最后将所得的cDNA于-80℃保存。

(3)实时荧光定量PCR采取全式金生物公司的Top Green qPCR试剂盒。具体操作步骤如下：

qPCR的体系与反应条件见表3。体系在冰上配制完成后，封好封口膜，在1000×g，4℃离心1min，置于实时荧光定量PCR仪中(Cycler 480，Roche)，反应程序设置见表4。RT-PCR所用引物见表2。

表3RT-PCR反应体系

表4RT-PCR反应程序

大肠杆菌全局调控因子突变基因crp(V140W)对所调控的庆大霉素耐药性相关基因表达水平的影响见表5，表中将对照菌株E.coli MG1655的表达水平看作1。结果表明，大肠杆菌全局调控因子突变基因crp(V140W)在一定程度上改写了细胞的代谢网络，调控多个基因表达水平的改变，如大肠杆菌外排泵的相关调控基因mdtE、mdtF和tolC的转录水平分别上调1.28、2.51和4.8倍，说明crp基因的突变可能加快了外排泵的作用，将更多抗生素运送出胞外，从而带来大肠杆菌对庆大霉素的耐药性增加。毒素-抗毒素***相关调控基因mazE和mazF的转录水平分别上调1.51和2.43倍，说明crp基因的突变使毒素-抗毒素***作用增强，处于低生长状态的细菌代谢速率变慢，靶标合成速度慢，从而对抗生素的敏感性降低，导致大肠杆菌对庆大霉素的耐药性增加。同样地，ompN这一膜蛋白基因转录水平上调，有利于大肠杆菌将抗生素排出细胞外，从而提高菌体对庆大霉素的耐药性。

表5RT-PCR分析突变基因crp(V140W)对所调控基因表达水平的影响

参考文献：

1.Chen B,Liang X,Huang X,et al.Differentiating anthropogenic impactson ARGs in the Pearl River Estuary by using suitable gene indicators[J].WaterResearch,2013,47(8):2811-2820.

2.Ruiz C,Levy S B.Many Chromosomal Genes Modulate MarA-MediatedMultidrug Resistance in Escherichia coli[J].Antimicrobial Agents andChemotherapy,2010,54(5):2125-2134.

3.Uppal S,Jawali N.The cyclic AMP receptor protein(CRP)regulatesmqsRA,coding for the bacterial toxin-antitoxin gene pair,in Escherichia coli[J].Research in Microbiology,2016,167(1):58-62.

4.Garst A D,Bassalo M C,Pines G,et al.Genome-wide mapping ofmutations at single-nucleotide resolution for protein,metabolic and genomeengineering[J].Nature Biotechnology,2016,35(1):48-55.

5.Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering ofEscherichia coliusing CRISPR-Cas9meditated genome editing[J].Metabolic Engineering,2015,31:13-21.

6.Lin Z,Xu Z,Li Y,et al.Metabolic engineering of Escherichia coliforthe production of riboflavin[J].Microbial Cell Factories,2014,13(1).

序列表

<110> 天津大学

<120> 大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcacgctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgaccgg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Thr Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaccaggt ctcagcgttc ctcgacgtga gttttagagc tagaaatagc aagttaa 57

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacaccaggt ctcaacgcca gactagtatt atacctagga ctgagc 46

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catttatcag ggttattgtc tc 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtattaccg cctttgag 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtgctttat cgcctgagtt 20

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcaatgcg gccggtccaa tcgaggaacg ccaggttgcc cactttctc 49

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcgattgga ccggccgcat tgcacagact ctgctgaatc tggcaaaaca 50

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catgtatccc gccaaactga 20

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caatctgcaa tacgcgaatg tcacct 26

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cattttccag attgagctgt act 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtatttgt ggcaatgagc ct 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgtgcgcagg aacagcaccg ccat 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggtgcggat cccggctacg tt 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagacttcct tatctttcgg ctct 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtagcgagc aagctggaca tcgt 24

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtaattcctc tggggcaact gttcct 26

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cacagccggt taacgcgctg ct 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccatattgc tatcgtcata ct 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caatggcgtc gcgacttatc gtaat 25

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cattggtgcg gtcagaagag gtgtat 26

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgaactcacc atgattcacg gcgt 24

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgatgatgcg gcgtctgata t 21

Claims

1.大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp，其特征是所述突变基因的核苷酸序列是SEQID No.1所示。

2.权利要求1所述的大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp所编码的蛋白质，其特征是所述蛋白质的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示。

3.包含权利要求1所述的大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp的工程菌。

4.权利要求3所述的工程菌在细菌耐药性机制研究的应用。