EA015794B1 - Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола - Google Patents
Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола Download PDFInfo
- Publication number
- EA015794B1 EA015794B1 EA200702153A EA200702153A EA015794B1 EA 015794 B1 EA015794 B1 EA 015794B1 EA 200702153 A EA200702153 A EA 200702153A EA 200702153 A EA200702153 A EA 200702153A EA 015794 B1 EA015794 B1 EA 015794B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- microorganism
- gene
- ethanol
- lactate dehydrogenase
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Получен мутированный термофильный микроорганизм с модификацией, инактивирующей ген лактатдегидрогеназы микроорганизма дикого типа. Этот мутированный микроорганизм применяют при продуцировании этанола, используя С, Сили Ссахара в качестве субстрата.
Description
Данное изобретение относится к продуцированию этанола как продукта бактериальной ферментации. В частности, изобретение относится к продуцированию этанола термофильными бактериями.
Предшествующий уровень техники
Бактериальный метаболизм может осуществляться посредством ряда различных механизмов в зависимости от вида бактерий и условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, которые включают все патогены, получают энергию от окисления органических соединений, причем самыми распространенными окисляемыми соединениями являются углеводы (в частности, глюкоза), липиды и белок. Результатом биологического окисления этих органических соединений бактериями является синтез АТФ как химического источника энергии. Этот процесс также дает возможность образования более простых органических соединений (молекул-предшественников), которые требуются бактериальной клетке для реакций биосинтеза. Общим процессом, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие субстраты, является гликолиз, который представляет собой последовательность реакций, превращающих глюкозу в пируват с образованием АТФ. Судьба пирувата при генерировании метаболической энергии зависит от микроорганизма и условий окружающей среды. Существует три основных реакции пирувата.
Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы будут генерировать энергию, используя цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетилкоэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой (ΡΌΗ).
Во-вторых, в анаэробных условиях некоторые образующие этанол микроорганизмы могут осуществлять спиртовую ферментацию путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, катализируемого пируватдекарбоксилазой (ΓΌΟ), и последующего восстановления ацетальдегида до этанола посредством НАДФ (никотинамиддинуклеотидфосфата), катализируемого алкогольдегидрогеназой (ΆΌΗ).
Третьим процессом является превращение пирувата в лактат, которое происходит посредством катализа лактатдегидрогеназой (ΓΌΗ).
Существует большой интерес в использовании микроорганизмов для продуцирования этанола либо с использованием микроорганизмов, которые претерпевают анаэробную ферментацию естественным путем, либо посредством использования рекомбинантных микроорганизмов, которые включают гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Хотя достигнут некоторый успех в продуцировании этанола путем использования этих микроорганизмов, ферментация часто подвергается риску за счет повышенной концентрации этанола, в частности, когда микроорганизм обладает низким уровнем толерантности к этанолу.
Для продуцирования этанола предложены термофильные бактерии, их применение обладает тем преимуществом, что ферментацию можно проводить при повышенных температурах, которые дают возможность удаления продуцированного этанола в виде пара при температурах выше 50°С; это также дает возможность проведения ферментации с использованием высоких концентраций сахара. Однако поиск подходящих термофильных бактерий, которые могут эффективно продуцировать этанол, проблематичен.
В \УО 01/49865 раскрыта грамположительная бактерия, которая трансформирована гетерологичным геном, кодирующим пируватдекарбоксилазу, и которая обладает нативной функцией алкогольдегидрогеназы, для продуцирования этанола. Эта бактерия представляет собой термофильную Вас111ик, и эта бактерия может быть модифицирована инактивацией гена лактатдегидрогеназы с использованием вставки транспозона. Все бактерии, раскрытые в \УО 01/49865, имеют происхождение от штамма ВаеШик БЕО-Я штамма с дефицитом споруляции, который возник спонтанно из культуры и в котором ген 1бЬ инактивирован спонтанной мутацией или химическим мутагенезом. Штаммы Б-Ν и ΤΝ раскрыты в качестве улучшенных производных штамма ЬГО-К.. Однако все штаммы содержат рестрикционные системы типа Нае III, что затрудняет плазмидную трансформацию и, следовательно, предотвращает трансформацию неметилированной ДНК.
В \УО 01/85966 раскрыты микроорганизмы, которые получают путем метилирования ίη νίνο, чтобы преодолеть проблемы рестрикции. Это требует трансформации метилтрансферазы Нае III из НаешорНПик аедурБик в штаммы ΓΓΌ-Κ, ΌΝ и ΤΝ. Однако штаммы ЬГО-К, ΌΝ и ΤΝ являются нестабильными мутантами и спонтанно ревертируют к продуцирующим лактат штаммам дикого типа, в частности, при низком рН и при высоких концентрациях сахара.
Результатом этого являются изменения продукта ферментации с этанола на лактат, что делает эти штаммы непригодными для продуцирования этанола.
В \УО 02/29030 раскрыто, что штамм ЬГО-К. и его производные включают встречающийся в природе инсерционный элемент (БЕ) в кодирующей области гена ИН. Транскрипция этого элемента внутри гена ИН (и вне его) и последующая инактивация гена является нестабильной, приводя к реверсии. В качестве решения была предложена интеграция плазмидной ДНК в последовательность ГЕ.
Таким образом, на уровне техники получение микроорганизмов для продуцирования этанола основано на модификации полученных в лаборатории мутированных химическим путем микроорганизмов ВаеШик, их обработке ίη νίνο с помощью методик метилирования и последующей модификации этих микроорганизмов интеграцией плазмидной ДНК в последовательность БЕ. Эта процедура сложна, ненадежна, а также существуют спорные предписания по использованию этих штаммов.
- 1 015794
Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных микроорганизмах для продуцирования этанола.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм модифицирован таким образом, чтобы дать возможность повышенного продуцирования этанола, где эта модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения этот микроорганизм депонирован как Νί'ΊΜΒ. номер по каталогу 41275.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения способ продуцирования этанола включает культивирование микроорганизма в соответствии с приведенным выше определением в пригодных условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахара.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения плазмида является такой, как определено здесь как рИВ190-Ий (депонирована как Νί'ΊΜΒ. номер по каталогу 41276).
Согласно пятому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм содержит плазмиду, определенную здесь как рИВ190 (фиг. 4).
Описание графических материалов
Настоящее изобретение описано со ссылкой на сопроводительные графические материалы, где фиг. 1 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по изобретению (Ий 35) с различными субстратами;
фиг. 2 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по изобретению (Ий 58) с различными субстратами;
фиг. 3 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола нокаут-мутантом по 1.11Н 11955;
фиг. 4 и 5 представляют собой схематические изображения плазмид рИВ, используемых в изобретении; фиг. 4 представляет собой мутант Ий согласно изобретению;
фиг. 6 представляет собой график, показывающий стабильность нокаут-мутанта ЙЭН в различных условиях культивирования.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма дикого типа, прерывающей экспрессию гена лактатдегидрогеназы.
Инактивация гена лактатдегидрогеназы способствует предотвращению расщепления пирувата до лактата и, следовательно, стимулирует (в подходящих условиях) расщепление пирувата до этанола с использованием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы прерывают путем делеции внутри гена или всего гена.
Микроорганизм дикого типа может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но предпочтительно, если этот микроорганизм представляет собой ВасШик крр. В частности, предпочтительно, если этот микроорганизм принадлежит к виду ОеойасШик, в частности ОеойасШик (йсгтодйюокИакищ.
Микроорганизмы, выбранные для модификации, указаны как микроорганизмы дикого типа, т.е. они не являются мутантами, полученными в лаборатории. Эти микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, которые, как ожидают, содержат термофилы. Изолированные микроорганизмы дикого типа будут обладать способностью к продуцированию этанола, но, если они не модифицированы, лактат, вероятно, является основным продуктом ферментации. Изоляты также отбирают на их способность к росту на сахарах гексозах и/или пентозах и их олигомерах при термофильных температурах.
Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению обладал некоторыми желательными характеристиками, которые дают возможность использования этого микроорганизма в процессе ферментации. Предпочтительно этот микроорганизм не должен иметь систему рестрикции, посредством чего избегают необходимости в метилировании ίη у1уо. Кроме того, микроорганизм должен быть стабильным по меньшей мере к 3% этанолу и должен обладать способностью к утилизации С3, С5 и С6 сахаров (или их олигомеров) в качестве субстрата, включая целлобиозу и крахмал. Предпочтительно, если этот микроорганизм является трансформируемым при высокой частоте. Кроме того, этот микроорганизм должен иметь скорость роста в непрерывной культуре для поддержания степеней разбавления 0,3 ч-1 и выше (типично 0,3 ОП500).
Микроорганизм является термофилом и растет в температурном диапазоне 40-85°С. Предпочтительно этот микроорганизм растет в температурном диапазоне 50-70°С. Кроме того, желательно, чтобы этот микроорганизм рос в условиях рН 7,2 или ниже, в частности рН 6,9-4,5.
Микроорганизм может быть спорообразующим либо может не спорулировать. Успех процесса ферментации не обязательно зависит от способности микроорганизма к споруляции, хотя при некоторых обстоятельствах может быть предпочтительно иметь спорообразующий микроорганизм, когда желательно использовать микроорганизмы в качестве корма для животных по окончании процесса ферментации. Это является следствием способности спорообразующих микроорганизмов к обеспечению хорошей им
- 2 015794 муностимуляции при использовании в качестве корма для животных. Спорообразующие микроорганизмы также обладают способностью к осаждению во время ферментации, и, следовательно, их можно выделить без необходимости в центрифугировании. Соответственно эти микроорганизмы можно использовать в корме для животных без необходимости в сложных или дорогостоящих методиках выделения.
Последовательность нуклеиновой кислоты для лактатдегидрогеназы сейчас известна. Используя эту последовательность, специалист в данной области техники имеет возможность использовать ген лактатдегидрогеназы в качестве мишени для достижения инактивации этого гена посредством различных механизмов. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы инактивируют либо путем инсерции транспозона, либо предпочтительно путем делеции последовательности этого гена или участка последовательности этого гена. Делеция является предпочтительной, поскольку позволяет избежать трудностей повторной активации последовательности гена, которая часто происходит при использовании транспозонной инактивации. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируют путем интеграции термочувствительной плазмиды (плазмиды рИВ190-1бй), которая достигается естественной гомологичной рекомбинацией или интеграцией между плазмидой и хромосомой микроорганизма. Хромосомные интегранты можно отобрать на основании их устойчивости к антибактериальному агенту (например к канамицину). Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может происходить посредством события рекомбинации по типу одиночного кроссинговера или посредством события рекомбинации по типу двойного (или более чем двойного) кроссинговера.
В предпочтительном воплощении микроорганизм содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы и гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы. Результатом экспрессии этих гетерологичных генов является продуцирование ферментов, которые меняют направление метаболизма таким образом, что этанол является основным продуктом ферментации. Эти гены могут быть получены из микроорганизмов, которые типично претерпевают анаэробную ферментацию, включая виды Ζν то шопах, включая Ζνηιοιηοηαχ тоЬШк.
Способы получения и включения этих генов в микроорганизмы известны, например, в 1пдтат с1 а1., Вю1есй & ВюЕпд, 1998; 58 (2+3): 204-214 и И8 5916787, где содержание каждой публикации включено здесь путем ссылки. Эти гены могут быть введены на плазмиде или интегрированы в хромосому, как должно быть известно специалистам в данной области техники.
Микроорганизмы по изобретению можно культивировать в общепринятых условиях культивирования в зависимости от выбранного термофильного микроорганизма. Выбор субстратов, температуры, рН и других условий роста можно произвести на основании известных требований к культивированию, например, см. XVО 01/49865 и ХУО 01/85966, где содержание каждой публикации включено здесь путем ссылки.
Теперь настоящее изобретение будет описано только путем примера со ссылкой на сопроводительные графические материалы в приведенных ниже примерах.
Инактивация гена ЬИН.
Пример 1. Мутация в результате одиночного кроссинговера.
Разработка нокаут-вектора ЬИН.
Частичный фрагмент гена Ий примерно 800 п.о. субклонировали в термочувствительном векторе доставки риВ190 (8ЕО ΙΌ N0: 1), используя ΗίηάΙΙΙ и ХЬа1, с получением в результате плазмиды 7,7 кб рИВ190-Ий (фиг. 4 и 8ЕО ΙΌ N0: 2). Плазмида рИВ190 депонирована в ΝΟΜΒ, как указано ниже. Десять предполагаемых трансформантов Е.еой 1Μ109 (рИВ190-Ий) проверяли с помощью рестрикционного анализа, и две культуры использовали для получения плазмидной ДНК для целей трансформации. В результате переваривания рИВ 190-Ий рестриктазами ΗίηάΙΙΙ и ХЬаГ высвобождается ожидаемый фрагмент Ий.
Трансформация СсоЬаеШих ИеттодИсокИакшк 11955 плазмидой рИВ190-Ий.
Трансформанты были получены со всеми тремя плазмидами, протестированы после 24-48 ч при 54°С селекцией канамицином. Трансформанты Ий очищали из СеоЬасШик ИеттодИсокИакшк (Οί) 11955 и проверяли с помощью рестрикционного анализа, используя ΗίηάΙΙΙ и ХЬаЕ
Нокаут гена ЬИН.
Нокаут гена осуществляли посредством интеграции термочувствительной плазмиды в ген Ий на хромосоме.
Плазмида рИВ 190-Ий реплицируется при 54°С в СП 1955, но не реплицируется при 65°С. Селекцию поддерживали канамицином (кап) (12 мкг/мл). Затем температуру роста повышали до 65°С (плазмида больше не является репликативной). Естественная рекомбинация или интеграция происходит между плазмидой и хромосомой. Хромосомные интегранты отбирали по их устойчивости к канамицину. Интеграция была направлена в сторону гена Ий, поскольку на плазмиде находится гомологичная последовательность. Направленная интеграция в ген Ий происходила посредством процесса, известного как рекомбинация по типу одиночного кроссинговера. Плазмида становится встроенной в ген Щй, результатом чего является неактивный ген Ий. Тандемные повторы могут встречаться, если интегрирует несколько копий плазмиды.
- 3 015794
Методология и результаты.
Для интеграции предпринимали два различных метода.
Метод 1. 4x50 мл культур ТОР (кап) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл ТОР. Эту суспензию высевали на чашки (5x200 мл) ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С. Интегранты собирали и высевали на 50-квадратную решетку на свежих чашках ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С.
Метод 2. 1x50 мл культуры ТОР (кап) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. 1 мл этой культуры использовали для инокуляции 50 мл свежих культур ТОР (кап), которые выращивали при 68°С в течение 12-18 ч. Эту культуру субкультивировали на следующие сутки в 50 мл свежих культур ТОР (кап) и выращивали при 68°С еще в течение 12-18 ч. Эту культуру высевали на чашки ТОР (кап) и инкубировали при 68°С в течение ночи. На чашках был получен конфлюентный рост. Отдельные колонии высевали на 50-квадратную решетку на свежие чашки ТОР (кап) и инкубировали в течение ночи при 68°С.
Скрининг.
Предполагаемые интегранты подвергали скринингу на нокаут гена Ий, используя приведенное ниже.
1) Скрининг на чашках.
Несколько сотен интегрантов перепечатывали на чашки 8ЛМ2 (с кап) при 68°С. Отрицательные по лактату клетки продуцируют меньше кислоты и могут обладать ростовым преимуществом по сравнению с диким типом на ферментационных средах без буферов.
2) Скрининг с помощью ПЦР.
ПЦР колоний использовали для определения того, интегрировали ли плазмида в ген Ий. Путем подбора праймеров, которые фланкируют сайт интеграции, возможно определить, произошла ли интеграция гена Ий (для вставок фрагмент ПЦР не амплифицируется).
3) Анализ на лактат.
Данный анализ определяет, продуцируют ли интегранты лактат при росте в течение ночи на 8АМ2 (кап) при 68°С. Надосадочную жидкость культуры тестировали на концентрацию лактата реагентом на лактат фирмы 81дша для определения лактата. Отрицательные по лактату интегранты дополнительно характеризовали с помощью ПЦР и оценивали в ферментере на стабильность.
Протокол электропорации для ОеойасШиз ИегтоцИсобИабШб Ν0ΙΜΒ 11955.
Замороженную исходную культуру ΝΟΙΜΒ 11955 получали путем выращивания ночной культуры в среде ТОР (250 об/мин при 55°С, объем 50 мл в конической колбе на 250 мл, ОП600), добавления равного объема 20% глицерина и деления на аликвоты по 1 мл и хранения в пробирках для криоконсервации при -80°С. 1 мл этой исходной культуры использовали для инокуляции 50 мл ТОР в конической колбе на 250 мл, инкубация при 55°С, 250 об/мин, до достижения культурой ОП600 1,4.
Колбу охлаждали на льду в течение 10 мин, затем культуру центрифугировали в течение 20 мин при 4000 об/мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 50 мл охлажденной во льду среды для электропорации и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Проводили три дополнительных отмывки, 1x25мл и 2x10 мл, а затем осадок ресуспендировали в 1,5 мл охлажденной во льду среды для электропорации и делили на аликвоты по 60 мкл.
Для электропорации 1-2 мкл ДНК добавляли к 60 мкл электрокомпетентных клеток в пробирке типа Эппендорф, которую держали на льду, и мягко перемешивали. Эту суспензию переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации (щель 1 мм) и проводили электропорацию при 2500 В, емкости 10 мФ и сопротивлении 600 Ом.
Сразу после импульса добавляли 1 мл ТОР, перемешивали и суспензию переносили в пробирку с завинчивающейся крышкой, инкубировали при 52°С в течение 1 ч в водяной бане с качалкой. После инкубации суспензию либо высевали непосредственно (например, 2x0,5 мл), либо центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендировали в 200-500 мкл ТОР и высевали на агар ТОР, содержащий соответствующий антибиотик.
Среда для электропорации
Среда Т6Р
0,5 М сорбит
0,5 М маннит
10% глицерин
Триптон 17 г/л Соевый пептон 3 г/л
КсНРО, 2,5 г/л
МаС1 5 г/л рН до 7,3
Добавки после автоклавирования:
Пируват натрия 4 г/л Глицерин 4 мл/л
Инактивация гена ЬЭН.
Мутация в результате двойного кроссинговера.
Праймеры разрабатывали на основе доступной последовательности 11955 ЬЭН. Нокаут-стратегия была основана на создании внутренних делеций внутри гена ЬЭН путем двух подходов.
При стратегии 1 два существующих уникальных сайта рестрикции вблизи середины кодирующей последовательности ЬЭН использовали для образования делеций. Из геномной ДНК получали один
- 4 015794 большой продукт ПЦР, покрывающий большую часть доступной последовательности ЬБИ, и клонировали в сайте 8ша1 во множественном сайте клонирования в рИС19, Затем клон рИС19 последовательно переваривали ΒδΐΕΙΙ и ΒδτΘΙ и повторно лигировали после переваривания фрагментом Кленова с образованием внутренней делеций в гене ΕΌΗ между ΒδΐΕΙΙ и ΒδτΘΙ.
При стратегии 2 (см. пример 2) ген ΕΌΗ клонировали в виде 2 продуктов ПЦР, вводя сайты ΝοΐΙ на олигопраймерах, чтобы образовать 2 продукта ПЦР для совместного лигирования в рИС19 с образованием делеций в середине последовательности ΕΌΗ. Два гена ΕΌΗ с внутренними делециями субклонировали в трех потенциальных системах доставки для ОеоЬасШиз.
Плазмида | Подробное описание |
рси1 | 4,94 кб, челночный вектор на основе рС194, несет са! и Ыа |
рВТ2 | 6,97 кб, челночный вектор, полученный из термочувствительного мутанта рЕ194, несет са! и Ыа |
рТУОтсз | 4,392 кб, получен из рЕ1941з, несет са( (без грамотрицательного репликона). |
Векторы доставки трансформировали в 11955 путем электропорации.
Информация по генетической стратегии: разработка систем доставки для гомологичной рекомбинации.
Для создания нокаутов необходима эффективная система для доставки мутированного гена в организм-мишень и отбора на интеграцию в геном в результате гомологичной рекомбинации с геноммишенью дикого типа. В принципе, это может быть достигнуто путем введения ДНК на векторе Е.со11 без грамположительного репликона, но который несет грамположительный селективный маркер. Для этого необходима высокая эффективность трансформации. Метод электропорации, разработанный для ОеоЬасШиз 11955, создает 3х104 трансформантов на 1 мкг ДНК с ρΝ^33Ν. Грамположительный репликон выделен из рВС1 по каталогу ВО8С и из рТНТ15 по базе данных последовательностей.
Ген са! на ρΝ^33Ν используют для селекции как в Е.со11, так и в ОеоЬасШиз. Термочувствительные мутанты ρΝ^33Ν были получены с помощью пассажей плазмиды через штамм-мутатор ВКДадепе ХЬ1г еб.
Пример 2. Получение мутанта ΕΌΗ путем замещения гена.
Для получения стабильной мутации гена ΕΌΗ в ОеоЬасШиз Шегшо§1исо81ба8Ш8 ΝίΊΜΒ 11955 была разработана дополнительная стратегия путем замещения гена. В эту стратегию вовлечено создание делеции 42 п.о. вблизи середины кодирующей последовательности и инсерции 7 п.о. в данном положении, вводящей новый сайт рестрикции ^ΐΙ. Эта последовательность вставки была предназначена для того, чтобы вызвать мутацию сдвига рамки считывания правее. В данную стратегию вовлечено создание делеции с использованием 2 фрагментов ПЦР, используя олигопраймеры, вводящие сайт рестрикции ^ΐΙ. Праймеры были разработаны на основании частичной последовательности кодирующей области ΕΌΗ из 11955. Последовательность использованных праймеров показана ниже.
Фрагмент 1:
Праймер 1 (прямой): ССАМТСССТТАТСААССААССААТАССА Ц) ]уо: 3· затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ЕсоВЦ.
Праймер 2 (обратный): ССС(ЭССССАССС6СТСТТТС6СТААСССССТ ш ΝΟ; 4_ затененная после_ довательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ^П).
Фрагмент 2:
Праймер 3 (прямой): ли (§Ер ΙΌ ΝΟ: 5; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ^П).
Праймер 4 (обратный): СТОСАСССТСААТТССАТСАСТТСАСбА ^Е(^ ш Νθ. 6_ затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта ΡδΐΙ).
Получение препарата геномной ДНК.
Препарат геномной ДНК, который служит матрицей для ПЦР, получали из 11955. Клетки из 20 мл ночной культуры 11955, выращенной в среде ΤΘΡ при 52°С, собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл буфера 8ΤΕ 0,3 М сахароза, 25 мМ Трис 11С1 и 25 мМ ЭДТА, доведенного до рН 8,0, содержащего 2,5 мг лизоцима и 50 мкл 1 мг/мл рибонуклеазы А. Эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 30°С, затем добавляли 5 мл протеиназы К и 50 мкл 10% ДСН с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. Затем лизированную культуру последовательно экстрагировали равными объемами фенола/хлороформа, а затем хлороформом, после чего осаждали изопропанолом. После отмывки дважды охлажденным во льду 70% этанолом осадок ДНК снова растворяли в 0,5 мл буфера ТЭ.
- 5 015794
Создание конструкции с делецией БЭН.
ПЦР проводили, используя ВоЬосус1ет СтаФеп! 96 (8!та!адепе), и условия реакции были следующими: цикл 1: денатурация при 95°С в течение 5 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин, элонгация при 72°С в течение 2 мин; циклы 2-30: денатурация при 95°С в течение 1 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин, элонгация при 72°С в течение 2 мин, последующая инкубация при 72°С в течение 5 мин. Используемые ферменты представляли собой равную смесь полимеразы РГи (Рготеда) и полимеразы Тад (Иете Епд1аиб Вю1аЬ§, ΝΕΒ). Используемые буфер, состав и концентрация 6ΝΤΡ были такими, как рекомендовано для РГи поставщиками. Продукты ПЦР, полученные с использованием геномной ДНК из Νί'ΊΜΒ 11955 в качестве матрицы, очищали путем электрофореза в агарозном геле и элюировали из агарозного геля с использованием набора О1Ас.|шск Се1 ЕхйасДоп Κίΐ (01адеп). Очищенные продукты ПЦР лигировали с риС19 (Νονν ЕпДапб Вю1аЬ§), предварительно переваренной 8та1, и лигазную смесь использовали для трансформации ЕксйепсЫа сой ΌΗ10Β Цпуйтодеп). Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом и устанавливали ориентацию вставок.
Плазмиду (рТМ002) с фрагментом 2, встроенным в рИС19 (с новым сайтом РШ, введенным на праймере 4 ближе всего к сайту РбН в сайте поликлонирования (тс§) рИС19), переваривали №ΐΙ и РШ. Полученный в результате фрагмент (примерно 0,4 кб) лигировали в плазмиду рИС19 (рТМ001), несущую фрагмент 1 (с новым сайтом ЕсоШ, введенным на праймере 1 ближе всего к сайту ЕсоР1 в тс§ рИС19), переваренную и РШ для линеаризации плазмиды. Лигазную смесь использовали для трансформации
Е.сой ΌΗ10Β. Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ003) с ожидаемым паттерном рестрикции для желаемой конструкции (кодирующая область ЬОН, несущая делецию и введенный сайт идентифицировали и проверяли секвенированием, используя прямой и обратный праймеры М13тр18.
Мутированный ген ЬОН вырезали из рТМ003 путем переваривания ΗίηάΙΙΙ и ЕсоР1 и очищали путем электрофореза в агарозном геле с последующей элюцией из агарозного геля с использованием набора р^цшск Се1 Ех1тасйоп Κίΐ (в виде фрагмента примерно 0,8 кб). Этот фрагмент обрабатывали полимеразой Кленова ЩЕВ, согласно инструкциям изготовителей) с образованием тупых концов и вводили в вектор риВ190. Это было достигнуто путем лигирования по тупым концам с рИВ190, линеаризованной перевариванием ХЬа!, а затем обработанной фрагментом Кленова с последующей очисткой из геля, как описано выше. Лигазную смесь использовали для трансформации Е.сой 8С8110 (81та!адепе). Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ014) с ожидаемым паттерном рестрикции для желаемой конструкции идентифицировали и использовали для трансформации NСIМΒ 11955 путем электропорации, используя протокол электропорации, как описано в примере 1.
Получение и характеристика мутанта ЬОН с замещением гена посредством двойного кроссинговера.
Предполагаемый первичный интегрант рТМ014, полученный таким способом (штамм ТМ15), использовали для получения двойных рекомбинантов (замещения гена). Это было достигнуто с помощью серийной субкультуры ТМ15 в среде ТСР без канамицина. Использовали пять последовательных культур при качании, чередуя 8 ч при 54°С и 16 ч при 52С°, используя 5 мл ТСР в пробирках на 50 мл (Еа1соп) при 250 об/мин, 1% пересев на каждой стадии. После этих 5 пассажей полученную в результате культуру серийно разводили в ТСР и высевали пробы по 100 мкл на чашки с агаром ТСР для инкубации при 54°С. Перепечатку полученных в результате колоний на агар ТСР, содержащий 12 мкг/мл канамицина, использовали для идентификации колоний, чувствительных к канамицину. После рассева истощающим штрихом на агаре до отдельных колоний для очистки эти производные, чувствительные к канамицину, тестировали на продуцирование лактата, и, как ожидали, оказалось, что они представляют собой смесь БЭН' и БЭН-. Одно производное ЬОН-, ТМ89, было дополнительно охарактеризовано с помощью ПЦР и Саузерн-блоттингов.
Геномную ДНК получали из ТМ15 (первичный интегрант) и ТМ89 (предполагаемый двойной рекомбинант ЬОН-) и использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием праймеров 1 и 4 и условий, описанных выше. Геномную ДНК из 11955 использовали в качестве контроля. Продукты ПЦР (полосы примерно 0,8 кб получены для всех 3 матриц) очищали электрофорезом в агарозном геле и элюировали из агарозного геля, используя набор р1Адшск Се1 Ех!тас1юп Κίΐ. Образцы переваривали №П и разгоняли на 0,7% агарозном геле для визуализации продуктов. Продукт ПЦР 11955 не показал данных рестрикции №1Е как ожидали, тогда как продукт ПЦР ТМ89 дал 2 полосы примерно по 0,4 кб, что указывает на замещение гена дикого типа мутированным аллелем. Переваривание продукта ПЦР ТМ15, первичного интегранта, дало преимущественно 2 полосы, наблюдаемые для ТМ89, со следом нерестрицированной (0,8 кб) полосы. Это можно объяснить результатом, полученным Саузерн-блоттингом геномной ДНК ТМ15.
Геномную ДНК 11955, ТМ15 и ТМ89 переваривали №ΐΙ, Рб!! и №11 и НшбШ и №11 и подвергали электрофорезу в агарозном геле. ДНК переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Восйе) и гибридизовали с меченым Э1С зондом, полученным с помощью ПЦР гена БЭН 11955, исполь
- 6 015794 зуя праймеры 1 и 4, с мечеными ИЮ 6ΝΤΡ, следуя инструкциям поставщиков (Коейе Мо1еси1аг ВюсйепйсаЕ ИЮ аррйсайоп тапиа1). Гибридизовавшиеся полосы визуализировали, используя поставляемый набор для обнаружения (Косйе). Данные Саузерн-блоттинга показали наличие множественно амплифицированной полосы примерно 7,5 кб в переваре №Й ТМ15 с так же амплифицированными полосами примерно 7 и 0,4 кб в переварах Нтй111/№11 и РШ/ШЙ ТМ15, что указывает на интеграцию множественных тандемных копий рТМ014, интегрированных при локусе ЬИН в данном первичном интегранте. Со всеми 3 рестрикционными переварами ТМ89 показала наличие другого паттерна рестрикции, показывающего дополнительную полосу гибридизации по сравнению с11955, соответствующую замещению гена. ТМ89 депонирована в NСIМΒ под номером по каталогу 41275, как указано ниже.
Пример 3. Продуцирование этанола термофилом дикого типа.
Воспроизводимый рост и образование продукта было достигнуто в культурах с подпиткой и непрерывных культурах для термофила дикого типа. В табл. 1, 2 и 3 показаны условия, используемые для процесса ферментации.
Таблица 1
Хи м и чес кие веще ства | об/л | Конечная концентрация |
МаН2РО4.2Н2О | 25 мМ | |
К2ЗО4 | 10 мМ | |
Лимонная кислота.Н;О | 2мМ | |
МдЗО47Н2О | 1,25 мМ | |
СаС122Н2О | 0,02 мМ | |
Сульфатный раствор микроэлементов | 5 мл | См. ниже |
№2МоО4.2Н2О | 1,65 мкМ | |
Дрожжевой экстракт | 10 г | |
Пеногаситель | 0,5 мл | |
Добавки после автоклавирования: | ||
4 М мочевина | 25 мл | 100 мМ |
1% биотин | 300 мкл | 12 мкМ |
20% глюкоза2 | 50 мл | 1% |
Таблица 2
Сульфатный концентрированный раствор микроэлементов
Химические вещества | гл1 (мл) | Концентрация в среде |
Конц. Н25О4 | 5 мл | |
ΖηδΟ4.7Η2Ο | 1,44 | 25 мкМ |
Ее5О4.7Н2О | 5,56 | 100 МКМ |
МпЗО4.Н20 | 1,69 | 50 мкМ |
Си5О4.5Н2О | 0,25 | 5 мкМ |
Со5О4.7Н2О | 0,562 | 10 мкМ |
Νί3Ο4.6Η2Ο | 0,886 | 16,85 мкМ |
Н3ВО3 | 0,08 | |
Деионизованная Н2О (конечный об.) | 1000 мл |
Таблица 3
Условия ферментера
Инокулят | 10% об/об |
Объем | 1000 мл |
Температура | 60°С |
РН | 7,0 регулируется Ν3ΟΗ |
Аэрация | 0,4 обг/мин |
Ν, скорость потока | 0,05 л/мин |
Перемешивание | 400 об/мин |
Среда | Мочевина сульфаты для ферментеров |
Подача сахара | 100 мл 50% глюкозы |
- 7 015794
Таблица 4
Суммирование улучшений р в пеоиодическс | эста Вас Й КУЛЬТ' | |||119 дикого типа /ое | |||||
Среда | Суммарный добавленный сахар, мМ | ОП600 | мМ | ||||
пир | пакт | форм | ацет | этанол | |||
Ксилоза | 603 | 8,5 | 9 | 187 | 5 | 75 | 22 |
Глюкоза 1 | 504 | 4 | 2 | 295 | 36 | 28 | 39 |
Глюкоза 2 | 504 | 3,7 | 19 | 322 | 111 | 55 | 123 |
Пример 4. Повышение продуцирования этанола термофилами.
С целью достижения целевых выходов этанола и производительности термофила продуцирование молочной кислоты было минимизировано посредством нокаута активности Ь-лактатдегидрогеназы (БЭН) путем инактивации гена 1Й11. Имело место два подхода, предпринятых для инактивации гена Ιάΐι: рекомбинация ДНК-маркера по типу одиночного кроссинговера в области 1Й11 хромосомы, предотвращающая ее транскрипцию, или рекомбинация по типу двойного кроссинговера гомологичных областей ДНК в гене 1Й11 с образованием мутации внутри области этого гена, делающая его нефункциональным.
В результате метода одиночного кроссинговера были быстро получены ЬИН-отрицательные мутанты, которые проявляли повышение продуцирования этанола по сравнению со штаммом дикого типа (ΝΟΙΜΒ 11955).
Улучшения продуцирования этанола мутантами БЭН.
ЬИН-отрицательные мутанты выращивали в культурах с подпиткой в разработанной минимальной среде для изверения повышения продуцирования этанола в результате нокаута активности БЭН. Изменения профиля метаболитов мутантов БЭН показано в табл. 5 в сравнении с оптимальным продуцированием этанола из штамма дикого типа. Профили продуцирования метаболитов двух мутантов БЭН показаны на фиг. 1 и 2. В табл. 6 показано повышение продуцирования этанола, вызванное нокаутом активности БЭН.
Таблица 5
Суммирование повышения продуцирования этанола, достигнутого мутантами по лактату
Организм | Источник углерода | Суммарный сахар | опвоо | мМ | ||||
пир | пакт | форм | ацет | этанол | ||||
Дикий тип | Глюкоза | 603 | 3,7 | 19 | 322 | 111 | 55 | 123 |
1сНп35 | Глюкоза | 336 | 4,7 | 82 | 22 | 128 | 37 | 220 |
Ι8Π 58 | Глюкоза | 336 | 5,2 | 57 | 3 | 40 | 23 | 215 |
Таблица 6
Повышенное продуцирование этанола мутантами 1_ОН в культуре с подпиткой | ||||||||||
Организм | Источник углерода | ОП600 | Глюкоза в подпитке, г | Остаточная глюкоза, г | Лактат, г | Лактат, г/г клеток | Лактат, г/г глюкозы | Этанол, г | Этанол, г/г клеток | Этанол, г/г глюкоз ы |
Дикий | Глюкоза | 3.7 | 60.48 | 1.62 | 37.89 | 48.89 | 0.64 | 4.05 | 5.22 | 0.07 |
1с!Ь35 | Глюкоза | 4.7 | 60.48 | 17.80 | 1.98 | 1.36 | 0.05 | 10.12 | 6.95 | 0.24 |
ИН 58 | Глюкоза | 5.2 | 60,48 | 28,26 | 0,27 | 0,17 | 0.01 | 9,89 | 6,14 | 0,31 |
Мутанты БЭН продуцировали значительно более высокие выходы этанола, чем термофил дикого типа, демонстрируя успешное переключение пути метаболизма этих термофилов. Дополнительная оптимизация условий культивирования и состава сред для мутантных штаммов ЬИН будет приводить к повышенным выходам этанола.
Продуцирование этанола мутантами ЬИН в непрерывной культуре.
Наиболее стабильный из мутантов по лактату в результате одиночного кроссинговера выращивали в непрерывной культуре, чтобы оценить его долговременную стабильность в качестве продуцента этанола. Этот штамм культивировали в минимальной среде с глюкозой в качестве источника углерода. Стабильное состояние культуры наблюдали в течение примерно 290 ч до появления реверсии к продуцированию лактата.
Пример 5.
Мутант ТМ89, представляющий собой двойной кроссовер (пример 2), оценивали на продуцирование этанола, как изложено в примере 4. Результаты представлены в табл. 8, и они показывают, что этот мутант достигал значительных уровней продуцирования этанола (выше чем 200 мМ). Этот мутант также оценивали на продуцирование этанола с утилизацией глюкозы или ксилозы в качестве источника углерода. Результаты представлены в табл. 7.
- 8 015794
Таблица 7
Организм | Источник углерода | Суммарный сахар/мМ | Остаток сахара/ мМ | ОПеоо | Концентра ция/мМ | ||||
этанол | лактат | пируват | ацетат | формиат | |||||
ДТ | Глюкоза | 794 | 130 | 5,3 | 46 | 279 | 7 | 69 | 9 |
ДТ | Ксилоза | 953 | 122 | 8,5 | 22 | 187 | 9 | 75 | 5 |
ТМ89 | Глюкоза | 862 | 53 | 6,5 | 214 | 5 | 109 | 10 | 88 |
ТМ89 | Ксилоза | 1045 | 142 | 4,9 | 130 | 14* | 24 | 36 | 39 |
Было показано, что глюкоза является лучшим источником углерода, но результаты четко показывают, что организмы способны к ферментации ксилозы без дополнительной модификации.
Стабильность мутанта, отрицательного по лактатдегидрогеназе, также тестировали при ряде условий в непрерывной культуре в течение периода 1500 ч. Результаты показаны на фиг. 6 и демонстрируют, что отрицательный фенотип по лактатдегидрогеназе остается стабильным, несмотря на значительное заражение культуры, и не основан на сохранении отбора по антибиотику. В процессе непрерывного культивирования степень разведения варьировала между 0,1 и 0,5 ч-1, и культуру переключали с кислородных условий (подача воздуха) на бескислородные (подача Ν2) условия без изменений в концентрации лактата. Более значимо варьировал рН культуры и падал до рН 4,4, что находится вне нормального интервала рН для роста организма дикого типа. Однако культура быстро восстанавливалась без изменения фенотипа, а именно концентрация лактата не менялась.
Микроорганизм, определенный здесь как ТМ89, и плазмида рИВ 190-Ий депонированы под номером по каталогу ΝΟΙΜΒ 41275 и 41276 соответственно. Хранилище представляет собой ΝΟΙΜΒ ЬИ, Регщ.15оп ВшИшд, СгаИйоие Е§1а1е, ВисккЬиш, АЬеИееи, АВ21 9ΥΑ, Ипйеб Кшдбош.
Таблица 8
Организм | Непрерывная | Воздух | Сахар | Биомасса | Использованный сахар | г/л | г/г сахара | г/г биомассы | г/л/ч | |||||
Скорость подачи | тем | г/л | г/л | пакт | этанол | биомасса | лакт | этанол | лакт | этанол | лакт | этанол | ||
Дикий тип | Ц=0,04 | 0,06 | глюк 2% | 0,68 | 20,00 | 11,25 | 1,56 | 0,03 | 0,56 | 0,08 | 16,50 | 2,29 | 0.45 | 0,06 |
Дикий тип | Ц=0,09 | 0,06 | глюк 2% | 1,02 | 20,00 | 7,29 | 1,79 | 0,05 | 0,36 | 0,09 | 7.13 | 1,75 | 0,66 | 0,16 |
1.6(1-21 | Б=0,1 | 0,02 | глюк 2% | 0,51 | 10,00 | 0 | 3,15 | 0,05 | 0,00 | 0,32 | 0,00 | 6,18 | 0,00 | 0,32 |
- 9 015794
Перечень последовательностей <110> тмо ВтоТес йппГед <120? тНегторЫ 1Ή с μι сгоогдапт 5ΙΊ5 Тог ЕТКапо1 ргойцсттоп <130> 1Μ01150ΝΟ <150> 6В0511603.3 <151? 2005-06-07 <150> СВ0509068.3 <151> 2005-05-04 <160> 6 <170> ратептш νβΓ5ΐοη 3.3 <210> 1 <211> 6744 <212> ДНК <213> 6еоЬасП1и5 ТНегтодТисоБтОазтиь <400> 1
даа£Ссд£аа | СсаТддТсаТ | адсхдхххсс | гдХдХдаааг | ТдигаТссдс | ТсасааТТсс | 60 |
асасаасаТа | сдадссддаа | дсаХааадгд | хааадссгдд | ддгдссТаас | дадТдадсТа | 120 |
асТсасасга | аТгдсдТТдс | дсХсасхдсс | сдсхХХссад | гсдддааасс | ТдТсдгдсса | 180 |
дсТдсабТаа | СдааТсддсс | аасдсдсддд | дададдсддт | ндсдгаТТд | ддсдсгсТТс | 240 |
сдсЬТссссд | стсастдаст | сдсТдсдсгс | ддхсдххсдд | стдсддсдад | сддсатсадс | 300 |
тсасгсааад | дсддтаатас | ддххахссас | адаахсаддд | датаасдсад | дааадаасат | 360 |
дтдадсаааа | ддссадсааа | аддссаддаа | ссдхааааад | дссдсдггдс | тддсдтстгг | 420 |
ссатаддстс | сдсссссстд | асдадсахса | сааааахсда | сдсТсаадбс | ададдТддсд | 480 |
ааасссдаса | ддасТаТааа | даХассаддс | дхххсссссх | ддаадстссс | £сд£дсдс£с | 540 |
ТссТдстссд | асссТдссдс | ххассддаха | ссХдХссдсс | 1«с1ссс« | сдддаадсдТ | 600 |
ддсдсс-стст | саТадсТсас | дсхдхаддха | хсхсадххсд | дТдГаддтсд | сссдсгссаа | 660 |
дстдддсгдт | дТдсасдаас | сссссдтхса | дсссдассдс | тдсдсспат | ссдд(:аас1:а | 720 |
гсдссстдад | гссаасссдд | хаадасасда | схгахсдсса | стддсадсад | ссассддтаа | 780 |
саддатсадс | ададсдаддг | ахдхаддсдд | Хдехасадад | СТсТТдаадГ | ддгддссТаа | 840 |
сТасддсТас | асТадаадда | садхахххдд | хахсхдсдсх | сТдсТдаадс | садТгассТТ | 900 |
сддааааада | дтгддтадст | схгдагссдд | сааасааасс | ассдсгддта | дсддгддгхт | 960 |
ггггдгггдс | аадсадсада | ХХасдсдсад | ааааааадда | ТсТсаадаад | атссмгдат | 1020 |
сТТТТсгасд | дддТсТдасд | схсадхддаа | сдаааасХса | сдгтааддда | ££££дд£са£ | 1080 |
дадатгатса | ааааддаТсТ | ХсассХадаХ | ссххххааах | ТаааааТдаа | дТТТгаааТс | 1140 |
аа£с1ааадт | а£ата£дадт | ааасххддхс | хдасадххас | сааТдсТТаа | ТсадТдаддс | 1200 |
ассТабссса | дсдасстдсс | хагххсдххс | аХссаХадХХ | дссТдасГсс | ссдГсдТдТа | 1260 |
- 10 015794
дахаасхасд | ахасдддадд | дсххассахс | хддссссадх | дсхдсаахда | Хассдсдада | 1320 |
сссасдсЕса | ссддсЕссад | аЕЕЕаЕсадс | ааХааассад | ссадссддаа | дддссдадсд | 1380 |
садаадхддх | ссЕдсаасЕЕ | ЕаЕссдссЕс | сахссадхсх | аххааххдхх | дссдддаадс | 1440 |
ХададХаадХ | адЕЕсдссад | ЕЕааЕадЕЕЕ | дсдсаасдхх | дхгдссаХЕд | сХасаддсаХ | 1500 |
сдгддхдхса | сдсЕсдЕсдЕ | ХХддХаХддс | ХХсаХХсадс | ХссддХХссс | аасдахсаад | 1560 |
дсдадгхаса | ЕдаЕссссса | хдххдхдсаа | аааадсддхх | адсхссххсд | дхссхссдах | 1620 |
сдххдхсада | адхаадххдд | ссдсадхдхх | ахсасхсахд | дххахддсад | сасхдсахаа | 1680 |
ХХсХсХХасХ | дХсаЕдссаЕ | ссдхаадахд | схгххсхдхд | асХддХдадХ | асХсаассаа | 1740 |
дХсаЕХсХда | дааЕадЕдЕа | Хдсддсдасс | дадххдсхсх | ХдсссддсдХ | сааХасддда | 1800 |
хаахассдсд | ссасаЕадса | даасХХХааа | адХдсХсаХс | аХХддаааас | дХХсХХсддд | 1860 |
дсдаааасЕс | ЕсааддаЕсЕ | хассдсхдхг | дадаХссадЕ | хсдахдхаас | ссасЕсдхдс | 1920 |
асссаасЕда | ЕсЕЕсадсаЕ | сххххасххх | сассадсдХХ | хсгдддхдад | сааааасадд | 1980 |
ааддсааааЕ | дссдсааааа | адддаахаад | ддсдасасдд | ааахдххдаа | хасхсахасх | 2040 |
СХХССХХХХХ | саахаххахх | даадсаххха | хсадддххах | хдхсхсахда | дсддахасах | 2100 |
ахххдаахдх | аЕЕЕадаааа | ахааасааах | аддддххссд | сдсасаХХХс | сссдаааадх | 2160 |
дссассЕдас | дЕсЕаадааа | ссаххаххах | саЕдасахха | ассХаХаааа | аХаддсдХаХ | 2220 |
сасдаддссс | ХХХсдХсХсд | сдсдХХЕсдд | ЕдасдасддХ | даааассХсХ | дасасаХдса | 2280 |
дсЕсссддад | асддЕсасад | сххдхсхдха | адсддахдсс | дддадсадас | аадсссдхса | 2340 |
дддсдсдхса | дсдддХдХХд | дсдддХдХсд | дддсХддсХХ | аасХаХдсдд | саХсададса | 2400 |
даххдхасхд | ададЕдсасс | аХаХдсддХд | ХдаааХассд | сасадахдсд | Хааддадааа | 2460 |
аХассдсагс | аддсдссаЕЕ | сдссаХХсад | дсхдсдсаас | ХдХХдддаад | ддсдахсддх | 2520 |
дсдддссХсХ | ХсдсХаХХас | дссадсХддс | даааддддда | ХдХдсХдсаа | ддсдаХХаад | 2580 |
ххдддгаасд | ссадддЕЕЕЕ | сссадХсасд | асдххдхааа | асдасддсса | дЕдссаадсх | 2640 |
ХдсаХдссЕд | саддЕсдасЕ | схадаааахс | аахсхсххгх | хссааадххх | дххххххааа | 2700 |
ХЕЕадсхдхс | ЕсааЕаЕдЕЕ | ХасддХсада | дссасдХХса | ссасдсХХса | асХсаааасс | 2760 |
СЕдХЕХХХХС | аЕаЕдсЕсдд | ддаахххахс | ХХдХадссаХ | аасадххсхх | дасдаххааа | 2820 |
сасаЕЕЕЕЕЕ | ссЕЕдсадЕЕ | ХЕссаЕсасд | сахаддсаса | асассхааах | дсахдхдадд | 2880 |
ддЕЕЕдсЕса | хсаххахдаа | схдххдсаха | адсаахаххх | ХдсХХдссаХ | ахсдххсдда | 2940 |
аааЕааЕЕЕа | ЕаасЕЕЕссЕ | сааааааХсд | ЕЕХХЕдХХСХ | ссхддахсса | дххдсхсааа | 3000 |
ааааЕстсдд | хсадахдхха | схадсаасхс | ахххасаада | асадсахсхс | Ессхсдхххх | 3060 |
ЕсЕЕдЕассЕ | дЕЕЕЕЕЕдЕд | аХХсааХааХ | ХЕсХХХдаса | сдЕЕсдХХдХ | аахсаахахх | 3120 |
ЕЕЕаЕсаЕЕЕ | ХХсаааХсаХ | ааХХХЕсасд | хдххсдсхса | ХддХсааХаЕ | сахсаххсдх | 3180 |
ХсХасХХХХХ | сдсХсХсХХХ | даххахдааа | ххдсахдссх | хххадхссад | схдахххсас | 3240 |
- 11 015794
бббббдсабб | сбасааасгд | сабаасбсаб | абдбааабсд | сбссббббба | ддбддсасаа | 3300 |
абдбдаддса | ббббсдсбсб | ббссддсаас | сасббссаад | бааадбабаа | сасасбабас | 3360 |
бббабаббса | бааадбдбдб | дсбсбдсдад | дсбдбсддса | дбдссдасса | ааассабааа | 3420 |
ассбббаада | ссбббсбббб | ббббасдада | ааааадааас | ааааааассб | дсссбсбдсс | 3480 |
ассбсадсаа | аддддддббб | бдсбсбсдбд | сбсдбббааа | аабсадсаад | ддасаддбад | 3540 |
баббббббда | даадабсасб | саааааагсг | ссассбббаа | асссббдсса | абббббаббб | 3600 |
бдбссдбббб | дбсбадсбба | ссдааадсса | дасбсадсаа | даабаааабб | бббаббдбсб | 3660 |
ббсддббббс | бадбдбаасд | дасаааасса | сбсаааабаа | аааадабаса | адададдбсб | 3720 |
сбсдбабсбб | ббаббсадса | агсдсдсссд | аббдсбдаас | адаббаабаа | бадаббббад | 3780 |
сбббббаббб | дббдаааааа | дсбаабсааа | ббдббдбсдд | дабсааббас | бдсааадбсб | 3840 |
сдббсабссс | ассасбдабс | ббббаабдаб | дбапддддб | дсаааабдсс | саааддсбба | 3900 |
абабдббдаб | абааббсабс | ааббсссбсб | асббсаабдс | ддсаасбадс | адбассадса | 3960 |
абааасдасб | ссдсассбдб | асааассддб | даабсаббас | басдададсд | ссадссббса | 4020 |
бсасббдссб | сссабадабд | аабссдаасс | бсаббасаса | ббадаасбдс | даабссабсб | 4080 |
бсабддбдаа | ссааадбдаа | ассбадббба | бсдсаабааа | аассбабасб | сбббббааба | 4140 |
бссссдасбд | дсаабдссдд | дагадасбдб | аасаббсбса | сдсабааааб | ссссбббсаб | 4200 |
бббсбаабдб | ааабсбабба | ссббаббабб | ааббсааббс | дсбсабаабб | ΗΗΐεεΐΐΐΐΐ | 4260 |
сббаббасдс | аааабддссс | дабббаадса | сасссбббаб | бссдббаабд | сдссабдаса | 4320 |
дссабдабаа | ббасбаабас | баддадаадб | баабааагас | дбаассааса | гдаббаасаа | 4380 |
ббаббададд | бсабсдббса | ааабддбабд | сдббббдаса | сабссасбаб | абабссдбдб | 4440 |
сдббсбдбсс | асбссбдааб | сссаббссад | аааббсбсба | дсдаббссад | аадбббсбса | 4500 |
дадбсддааа | дббдассада | саббасдаас | бддсасадат | ддбсабаасс | бдааддаада | 4560 |
бсбдаббдсб | баасбдсббс | адббаадасе | даадсдсбсд | бсдбабааса | дабдсдабда | 4620 |
бдсадассаа | бсаасабддс | ассбдссабб | дсбассбдба | садбсаадда | бддбадаааб | 4680 |
дггдгсддбс | сббдсасасд | аабаббасдс | сабббдссбд | сабаббсааа | садсбсббст | 4740 |
асдабааддд | сасааабсдс | абсдбддаас | дбббдддсбб | сбассдаббб | адсадбббда | 4800 |
гасасбббсх | сбаадгагсс | ассгдаабса | гааагсддса | ааагададаа | аааббдасса | 4860 |
бдбдбаадсд | дссаабсбда | ббссассбда | дабдсабааб | сбадбадааб | сбсббсдсба | 4920 |
бсааааббса | сббссассбб | ссасбсассд | дббдбссабб | сабддсбдаа | сбсбдсббсс | 4980 |
бсбдббдаса | бдасасасаб | сабсбсааба | бссдаабадд | дсссабсадб | сбдасдасса | 5040 |
адададссаб | ааасассааб | адссббааса | бсабссссаб | абббахссаа | баббсдбЕсс | 5100 |
ббаабббсаб | даасаабсбб | саббсбббсб | бсбсбадбса | ббаббаббдд | бссаббсасб | 5160 |
аббсбсаббс | ссббббсада | бааббббада | бббдсббббс | бааабаадаа | бабггддада | 5220 |
- 12 015794
дсассдНсб | 1а£±садс£а | ХГааТаасСс | дтстгсскаа | дсагссггса | агсстнгаа | 5280 |
1аасаа11а1 | адсабсгаа! | сНсаасааа | с1ддсссд« | 1д££даасса | стстааг.а | 5340 |
ааа£ааГ1:Г£ | 1ссд1гссса | анссасан | дсаа1аа!ад | аааагссабс | Нсагсддсг | 5400 |
ГТТГсдГсаГ | сагс1д£агд | аа£сааа£сд | ссНсНсТд | ТдГсаГсаад | дИТГааНП | 5460 |
пагдганг | с66£1аасаа | ассассаГад | даданаасс | «ггасддгд | гааасстгсс | 5520 |
тссааагсад | асааасдттг | салаг 1. с г τι: | гснсатсаг | сддссасааа | атссдтаксс | 5580 |
ГНасаддаГ | а£££1дсад£ | «сдгсаан | дссдагтдба | гагссда£1г | агаггкатгг | 5640 |
иссддбсдаа | гсантдаас | шгасаииг | дда£са1:адг | стаангсаг | гдссппгс | 5700 |
сааааНдаа | гссандш | ггдаГГсасд | гадтлнггд | та1..1с1.1.ааа | атааднддс | 5760 |
СссасасаГа | ссааГасаСд | са£д£дс£да | тгагаадаа! | та-ссгиап | а££1аНд£с | 5820 |
аснссдггд | сасдсаГааа | ассаасаада | ггкггагсаа | £Г«1МаГа | НдсатсаГГ | 5880 |
сддсдааагс | с£Гдадсса£ | аТсГдасааа | «сИаШа | аГ1:с1:1.сдсс | аТсаГаааса | 5940 |
тггаасгд | Т1аа£д£дад | ааасаассаа | сдаасСдПд | дсННдШ | аа£аас£1са | 6000 |
дсаасаассГ | ГГГдГдасГд | аа£дсса1дг | г (.саПдстс | 1сс1.ссадгг | дсасандда | 6060 |
сааадсс£дд | агггасаааа | ссасасГсда | гасааснгс | гсгсдссгд! | КГсасдагн | 6120 |
тдгггатасг | стаанагггс | адсасаа1с1: | ггга.сг.сгтг | садссИИ! | ааансаада | 6180 |
абагдсадаа | дггсааадга | агсаасана | дсдаННСГ | гтгсгстсса | Еддтстсас!: | 6240 |
ШссасШ | игдисндгс | сасГаааасс | сггд,н ι.ττι | сатс£даа£а | аа£дсгас!а | 6300 |
1гаддасаса | баагаггааа | адааассссс | аГсХаНТад | Г1а1«дг£1 | адГсасСГаГ | 6360 |
аастмааса | дагддддГгг | ггсгдгдсаа | ссааНзНаа | дддГТНхаа | 1асб«аааа | 6420 |
сасагасага | ссаасасггс | аасдсассИТ | ТсадсаасТа | аааТаааааГ | дасдмант | 6480 |
сиа1а£д£а£ | саадатаада | аадаасаадх | Гсаааасса! | сааааааада | сассггггса | 6540 |
ддгдсМГИ | иг а. г. г. Нага | аасгсаггсс | ссдагсгсда | с£1сдг£с££ | £11г1асс£с | 6600 |
£сдд£6а£да | дМадгксаа | аг1сдггс1£ | Г£Тадд£ГС£ | аааТсдгдгг | ГНсГГддаа | 6660 |
Нд£дс£дН | ИаПсШа | ссНд-ЕсЬас | ааассссгга | аааасдШб | 1аааддсГ1Г | 6720 |
£аадссд£сг | д£асдГ£сс£ | Саад | 6744 |
<210> 2 <211> 7673 <212> ДНК <213> СеоЬаст11и5 1Негтод1исо514а51и5 дааМсдбаа <400>
гааадсссдд
бсаиддтса!
асасаасаТа
дс£сас£дсс
1д££а£ссдс тсасааНсс
120 асГсасаШа
ГдааГсддсс сдсгггссад
180
1ГдсдСаГ£д ддсдсиспс дсСдса££аа аасдсдсддд дададдсддб
240
- 13 015794
сдсххссхсд | сХсасХдасХ | сдсхдсдсхс | ддГсдгссдд | схдсддсдад | сддХаХсадс | 300 |
хсасхсааад | дсддхаахас | ддххахссас | адааюаддд | дахаасдсад | дааадаасах | 360 |
дхдадсаааа | ддссадсааа | аддссаддаа | ссдХааааад | дссдсдХХдс | хддедххххх | 420 |
ссаХаддсХс | сдссссссХд | асдадсаХса | сааааагсда | сдсХсаадХс | ададдХддсд | 480 |
ааасссдаса | ддасхахааа | даХассаддс | дГГХсссссГ | ддаадсХссс | ХсдХдсдсХс | 540 |
ХссХдХХссд | асссхдссдс | ХХассддаха | ссгдхссдсс | ХХХСХСССХХ | едддаадедх | 600 |
ддсдсхххсх | саХадсХсас | деХдХаддХа | Ис1:сад1:1сд | дхдхаддхсд | ххсдсхссаа | 660 |
дсхдддсхдх | дХдсасдаас | сссссдххса | дсссдассдс | хдсдссххах | ссддхаасха | 720 |
ХсдХсХХдад | Хссаасссдд | хаадасасда | сгхатхдсса | схддсадсад | ссасхддхаа | 780 |
саддаххадс | ададсдаддх | ахдхаддедд | тдсгасадад | ххеххдаадх | ддхддссхаа | 840 |
схасддсхас | асхадаадда | садХаХХХдд | ГаГсгдсдс! | сХдсХдаадс | садХХассХХ | 900 |
сддааааада | дххддхадсх | сХХдаХссдд | сааасааасс | ассдсХддХа | деддХддХХХ | 960 |
ххххдхххдс | аадсадсада | ХХасдсдсад | ааааааадда | ХсХсаадаад | аХссХХХдаХ | 1020 |
сХХХХсХасд | дддХсХдасд | сХсадХддаа | сдаааасгса | едХХааддда | ххххддхсах | 1080 |
дадаХХаХса | ааааддаХсХ | ХсассХадах | ссг^ааах | хааааахдаа | дххххааахс | 1140 |
аахсхааадх | аХаХаХдадХ | аааеХХддХе | тдасад^гас | сааХдсХХаа | хсадхдаддс | 1200 |
НСС иЗ и С иСа | деда ис ид и с | хахххедххе | а иССЗиад и и | дссидасисс | ссдисд ид иа | 1 1 ел и νν |
даГаасГасд | аХаедддадд | дсХХассаХс | хддссссадх | дсТдсааТда | Хассдсдада | 1320 |
сссасдсТса | ссддсХссад | аХХХаХсадс | ааХааассад | ссадссддаа | дддссдадсд | 1380 |
садаадГддГ | ссХдсаасХХ | ХаХссдссХс | сахссадхсх | атгааггдгг | дссдддаадс | 1440 |
•СададГаадГ | адХХсдссад | ххаахадххх | дсдсаасдхх | дгидссаегд | схасаддсах | 1500 |
сдгддхд^са | сдсХсдХсдХ | ХХддХаХддс | ХХсаХХсадс | тссддгиссс | аасдаХсаад | 1560 |
дсдадТТаса | ХдаХссссса | хдххдхдсаа | аааадеддхх | адсгссггсд | дхссхссдах | 1620 |
сдътдгсада | адХаадХХдд | ссдсадхдхх | аХсасХсаХд | дТГаГддсад | сасхдсахаа | 1680 |
ГГстситасХ | дХсаХдссаХ | ссдХаадаХд | еХХХХеХдХд | аехддгдадг | асХсаассаа | 1740 |
д1сагхсхда | даахадхдха | хдсддсдасс | дадххдехех | гдсссддсдг | саахасддда | 1800 |
Гаа1:ассдсд | ссасахадса | дааеХХХааа | адХдсХсаХс | аххддаааас | дХХеХХеддд | 1860 |
дсдаааасТс | ХсааддаХсХ | хассдсхдхх | дадахссадх | ТсдаТдЕаас | ссасхсдхдс | 1920 |
асссаасЕда | хсххсадсах | еххххаеххх | сассадсдХХ | гегдддгдад | сааааасадд | 1980 |
ааддсааааг | дссдсааааа | адддаахаад | ддсдасасдд | ааа1дТ:Г:даа | хасхсахасх | 2040 |
σιχαζΐΐΐΐΐ | саахаххахх | даадсаххха | ХсадддХХаХ | гдгсгсагда | дсддаХасаХ | 2100 |
аШдааГдГ | ахххадаааа | аХааасаааХ | аддддТзИссд | сдсасатс | сссдаааадх | 2160 |
дссасс1:дас | дхсхаадааа | ссаххаххах | сагдасахга | ассгаиаааа | ахаддедхах | 2220 |
- 14 015794
сасдаддссс | хххсдхсхсд | сдсдхххсдд | хдахдасддх | даааассхсх | дасасахдса | 2280 |
дсХсссддад | асддхсасад | сххдхсхдха | адсддахдсс | дддадсадас | аадсссдхса | 2340 |
дддсдсдхса | дсдддхдххд | дсдддхдхсд | дддсхддсхх | аасХаХдсдд | саХсададса | 2400 |
даххдхасхд | ададХдсасс | ахахдсддхд | хдаааХассд | сасадаХдсд | Хааддадааа | 2460 |
ахассдсахс | аддсдссахх | сдссаххсад | дсхдсдсаас | хдххдддаад | ддсдахсддх | 2520 |
дсдддссХсХ | ХсдсХаНас | дссадсхддс | даааддддда | ХдгдсХдсаа | ддсдаХХаад | 2580 |
ххдддхаасд | ссадддхххх | сссадхсасд | асдххдхааа | асдасддсса | дхдссаадсх | 2640 |
ХддХассдад | схсасхадхс | асддссдсса | дХдХдсХдда | аххсдсссхх | ддахссхххд | 2700 |
сссххахдаа | ссааддааха | дсадаХдад! | хадхаххдах | хдахдхааах | аадаахаадд | 2760 |
сададддсда | хдхдахддах | ХХаааХсасд | даааадХаХХ | сдсдссдаад | ссдахдааха | 2820 |
хххддсххдд | адаххахсаа | дандссаад | асдссдаххх | ддхддТдаХХ | хдтдсадддд | 2880 |
схаассаааа | дссдддадаа | асаадасхдд | ахсххдххда | сааааахахх | аахахсххса | 2940 |
ааасдаХХдХ | сдаХХсХдХд | аХдаааХссд | даХХХдаХдд | сдхххххсхх | дХддсаасда | 3000 |
асссадХдда | хаххххаасд | ХаХдсХасХХ | ддаааТГГад | сдддххассд | ааададсддд | 3060 |
хаахсддсхс | аддаасдахх | сххдахасад | саадаххссд | сххсххдсха | адхдаахахх | 3120 |
ххсаадхддс | хссдассаах | дхасахдсдх | аХаХХаХХдд | сдадсахддд | дахасададс | 3180 |
ХдссхдХХХд | дадссахдсд | даааххддаа | дсаХХссадХ | хдадсаааха | ХХдахдсааа | 3240 |
асдахаасха | хадаааадад | дахххадаса | аХаХсХХХдХ | хаахдххсдх | дахдсддсах | 3300 |
ахсааахсах | хдадаааааа | ддддсаасдх | аххасддсах | хдсаахддда | ххадхссдха | 3360 |
ХсасХсдХдс | ХаХХХХдсас | ааХдааааХд | ссаХсХХаас | сдхххсхдсх | сахххддасд | 3420 |
дссааХаХдд | сдаасдааах | дхххахаххд | дсдхдссхдс | саХХаХсаас | сдааасддха | 3480 |
ХХсдХдаадХ | даХддааХХд | асдсХаааХд | ааасадааса | адддсдаахх | сХдсадаХаХ | 3540 |
ссахсасасх | ддсддссдсх | сдадсаХдса | дсахдссхдс | аддХсдасХс | ХадааааХса | 3600 |
ахсхсххххх | ссааадХХХд | ХХХХХХаааХ | ХХадсХдХсХ | сааХаХдХХХ | асддХсадад | 3660 |
ссасдххсас | сасдсххсаа | сХсаааассс | ХдХХНХХСа | хахдсхсддд | даахххатсх | 3720 |
ХдХадссаХа | асадххсххд | асдаХХааас | асаххххххс | сххдсадххх | Хссахсасдс | 3780 |
аХаддсасаа | сассХаааХд | саХдХдаддд | дхххдсхсах | саХХаХдаас | хдххдсахаа | 3840 |
дсаахахххх | дсххдссаха | ХсдХХсддаа | ааХааХХХаХ | аасхххссхс | ааааааХсдХ | 3900 |
1Хххд1Лс.х<. | схддахссад | ххдсхсаааа | ааахсхсддх | садахдххас | хадсаасхса | 3960 |
хххасаадаа | садсаХсХХХ | ссхсдхххгх | с1Лдтасс1:д | ХХХХХХдХда | «саахаахх | 4020 |
ХсХХХдасас | дххсдххдха | ахсаахаххх | ххахсахххх | хсааахсаха | аХХХХсасдХ | 4080 |
дХХсдсХса! | ддХсааХаХс | аХсаХХсдХХ | схасхххххс | дсХсХсХХХд | аххахдааах | 4140 |
ХдсаХдссСХ | ХХадХссадс | ХдаХХХсасХ | ХХХХдсаХХс | ХасааасХдс | аХаасХсаХа | 4200 |
- 15 015794
ЕдЕаааЕсдс | гссгш.тад | дЕддсасааа | ЕдЕдаддсаЕ | ЕЕЕСдсЕСЕЕ | Ессддсаасс | 4260 |
асЕЕссаадЕ | ааадЕаЕаас | асасЕаЕасЕ | ЕЕаЕаЕЕсаЕ | ааадЕдЕдЕд | СЕсЕдсдадд | 4320 |
сЕдЕсддсад | Едссдассаа | аассагаааа | ссЕЕЕаадас | СЕЕЕСЕЕЕЕЕ | ЕЕЕасдадаа | 4380 |
аааадаааса | аааааассЕд | сссЕсЕдсса | ссЕсадсааа | ддддддич | дсЕсЕсдЕдс | 4440 |
ЕсдЕЕЕаааа | аЕсадсаадд | дасаддЕадЕ | аЕЕЕЕЕЕдад | аадагсасЕс | ааааааЕсЕс | 4500 |
сассЕЕЕааа | сссЕЕдссаа | ЕЕЕСЕаЕЕЕЕ | дЕссдЕЕЕЕд | ЕсЕадсЕЕас | сдааадссад | 4560 |
асЕсадсаад | ааЕааааЕЕЕ | ЕЕаЕЕдЕсЕЕ | ЕсддЕЕЕЕсЕ | адЕдЕаасдд | асаааассас | 4620 |
ЕсааааЕааа | ааадаЕасаа | дададдЕсЕс | ЕсдЕаЕсЕЕЕ | ЕаЕЕсадсаа | Есдсдсссда | 4680 |
ЕЕдсЕдааса | даЕЕааЕааЕ | адаЕЕЕЕадс | ЕЕЕЕЕЭЕЕЕд | ЕЕдаааааад | сЕааЕсаааЕ | 4740 |
ЕдЕЕдЕсддд | аЕсааЕЕасЕ | дсааадЕсЕс | дЕЕсаЕссса | ссасЕдаЕсЕ | ЕЕЕааЕдаЕд | 4800 |
ЕаЕЕддддЕд | сааааЕдссс | аааддсЕЕаа | ЕаЕдЕгдаЕа | ЕааЕЕсаЕса | аЕЕсссЕсЕа | 4860 |
сЕЕсааЕдсд | дсаасЕадса | дЕассадсаа | ЕааасдасЕс | сдсассЕдЕа | сааассддЕд | 4920 |
ааЕсаЕЕасЕ | асдададсдс | садссЕЕсаЕ | сасЕЕдссЕс | ссаЕадаЕда | аЕссдаассЕ | 4980 |
саЕЕасаса! | ЕадаасЕдсд | ааЕссаЕсЕЕ | саЕддЕдаас | сааадЕдааа | ссЕадЕЕЕаЕ | 5040 |
сдсааЕаааа | ассЕаЕасЕс | ЕЕСЕЕааЕаЕ | ссссдасЕдд | сааЕдссддд | аЕадасЕдЕа | 5100 |
асаЕЕСЕсас | дсаЕааааЕс | сссЕЕЕсаЕЕ | ЕЕсЕааЕдЕа | ааЕсЕаЕЕас | сЕЕаЕЕаЕЕа | 5160 |
4-4-4--. -4-4-4-4. | гээл | |||||
агЕсааЕЕсд | СΐΟαΐααιΐα | ЗЕССЕЕЕЕЕС | ЕЕЗЕЕасдса | ЗаасууСССу | а***аауСаС | Л. 4,ν |
асссЕЕЕаЕЕ | ссдЕЕааЕдс | дссаЕдасад | ссаЕдаЕааЕ | ЕасЕааЕасЕ | аддадаадЕЕ | 5280 |
ааЕаааеасд | ЕаассаасаЕ | даггаасааг | ЕаЕЕададдЕ | саЕсдЕЕсаа | ааЕддЕаЕдс | 5340 |
дЕЕЕЕдасас | аСссасЕаЕа | ЕаЕссдЕдЕс | дЕЕсЕдЕсса | сЕссЕдааЕс | ссаЕЕссада | 5400 |
ааЕЕсЕсЕад | сдаеЕссада | адЕЕЕсЕсад | адЕсддааад | ЕЕдассадас | аЕЕасдаасЕ | 5460 |
ддсасадагд | дЕсаЕаассЕ | дааддаадаЕ | сЕдаЕЕдсЕЕ | аасЕдсЕЕса | дЕЕаадассд | 5520 |
аадсдсЕсдЕ | сдЕаЕаасад | аЕдсдаЕдаЕ | дсадассааЕ | саасаЕддса | ссЕдссаЕЕд | 5580 |
сгассЕдЕас | адгсааддаЕ | ддЕадаааЕд | ЕЕдЕсддгсс | ЕЕдсасасда | аЕаЕЕасдсс | 5640 |
аЕЕЕдссЕдс | аЕаЕЕсааас | адсЕСЕЕсЕа | сдаЕаадддс | асаааЕсдса | ЕсдЕддаасд | 5700 |
ЕЕЕдддсЕЕс | ЕассдаЕЕЕа | дсадЕЕЕдаЕ | асасЕЕЕсЕс | ЕаадЕаЕсса | ссЕдааЕсаЕ | 5760 |
аааЕсддсаа | ааЕададааа | ааЕЕдассаЕ | дЕдЕаадсдд | ссааЕсЕдаЕ | ЕссассЕдад | 5820 |
аЕдсаЕааЕс | ЕадЕадааЕс | ЕсЕЕсдсЕаЕ | сааааЕЕсас | ЕЕССЭССЕЕС | сасЕсассдд | 5880 |
ЕЕдЕссаЕЕс | аЕддсЕдаас | ЕсЕдсЕЕссЕ | сЕдЕЕдасаЕ | дасасасаЕс | аЕсЕсааЕаЕ | 5940 |
ссдаатаддд | сссатсадЕс | Едасдассаа | дададссага | аасассааЕа | дссЕЕаасаЕ | 6000 |
саЕссссаЕа | ЕЕЕаЕссааЕ | аЕЕсдЕЕссЕ | ЕааЕЕЕсаЕд | аасааЕСЕЕС | ЭЕЕсЕЕЕСЕЕ | 6060 |
сЕсЕадЕсаЕ | ЕаЕЕаЕЕддЕ | ссаЕЕсасЕа | ЕЕсЕсаЕЕсс | сЕЕЕЕсадаЕ | ааЕЕЕЕадаЕ | 6120 |
ЕЕдсЕЕЕЕсЕ | аааЕаадааЕ | аЕЕЕддадад | сассдЕЕсЕЕ | аЕЕсадсЕаЕ | ЕааЕаасЕсд | 6180 |
- 16 015794
1сисс1аад | сагссисаа | Гсстл-ссаа! | аасааНата | дса1с1аа1с | Исаасааас | 6240 |
гддсссдш | дХТдаасгас | гсХ11аа1аа | аагааТТИТ | ссдИсссаа | ПссасаГТд | 6300 |
саатаагада | ааатссагст | ТсаГсддсИ | 111:сд1са1с | а1с1д1атда | аисааатсдс | 6360 |
сгтсггсгдг | дгсагсаадд | ΐΐΐββΐϊΐΐΐ | татдтатггс | гтгтаасааа | ссасса1адд | 6420 |
адаттаасст | ггтасддтдт | ааассТТссТ | ссаааГсада | сааасдТТТс | аааггснт | 6480 |
сС1:са1са1с | ддгсагаааа | Гссд1а1:сс1 | ттасаддата | гтидсадн | Ьсдтсааттд | 6540 |
ссдагтдта! | аГссдаПГа | ΓθϊΙΐαΐΐΐΐ | 1сдд1сдааг | саИтдаасг | £гтаса1£тд | 6600 |
датсатадгс | таатсатт | дссСГТГТсс | ааааТГдаа! | ссамдгш | ГдаТГСасдГ | 6660 |
адтггтсгдг | аТ1сГ1аааа | гаадГ£дд1:1 | ссасаса!ас | сааТасабдс | аГдТдсЕдаГ | 6720 |
1а1аадаа11: | акхпана | Шатгдюа | сттссддтдс | асдсатаааа | ссаасаада! | 6780 |
ттттахгаат | «инатат | т.дсатсаТ1с | ддсдаааГсс | ТТдадссаГа | 1с£дасааас | 6840 |
Гс11аГ11аа | Пстгсдсса | ссагаааса! | ииаасгд! | 1аа1д1дада | аасаассаас | 6900 |
даастдттдд | сттттдттта | а1аас61сад | саасаасс« | ттдтдастда | агдссагдгг | 6960 |
1са11дс1с1 | сс!ссадГ1д | сасаИддас | ааадсстдда | Шасаааас | сасасгсдат | 7020 |
асаасТГГсГ | гтсдсстдтг | гсасдаг«т | дГ.СГаГасГс | г.аагагггса | дсасаатси | 7080 |
гтасгстттс | адссттттта | ааггсаадаа | гатдсадаад | (ГсааадГаа | гсаасаттад | 7140 |
сдаттттстт | ГтсСсгссат | ддгстсастт | ттссасгстг | тдтсхсдгсс | асгаааассс | 7200 |
гтдапггтс | атс£даа1аа | атдстастат | 1аддасаса1 | аатахтаааа | дааассссса | 7260 |
тсгагсгадг | гашдгиа | дтсасгтата | асШаасад | а£ддддг«1 | Тс’ЬдГдсаас | 7320 |
сааттттаад | ддттттсаат | астттаааас | аса!асатас | саасасттса | асдсассттг | 7380 |
садсаас!аа | ааТаааааТд | асдггаиггс | 1а1а1д1:а1с | аадатаадаа | адаасаадтт | 7440 |
саааассагс | ааааааадас | ассттттсад | д1дст1«« | 1ат11га1аа | астсаттссс | 7500 |
1да1сСсдас | 11сдГ1с(« | 1Шасс1ст | сддтгатдад | 1тадттсааа | Т1сд11с1г1 | 7560 |
ттаддггеса | аатсдсдгт! | Г1ст1ддаат | гдгдстдиг | татссттгас | стгдгс±аса | 7620 |
аасссссгаа | ааасдштг | аааддсгт | аадссдгсгд | гасдтгссиг | аад | 7673 |
<210> 3 <211> 29 <212> ДНК <213? искусственная <220?
<223> олигонуклеотидный лраймер <400>3 ддааггссст гагдаассаа ддаа£адса <2104 <211>31 <212> ДНК <213> искусственная <22О>
<223? олигонуклеотидный праймер <400>4 дсддссдсас ссдсисгтгс ддгаасссдс ΐ <210>5 <211>31 <212> ДНК <213> искусственная <220>
<223> олигонуклеотидный праймер <400> 5
дсддссдс!Т дс!аад£даа 1а£тсаад т | 31 |
<210 6 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная <220> <223> олигонуклеотидный праймер <400 6 сгдсадсд1с ааП.ссаТса сИсасда | 28 |
- 17 015794
Claims (17)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Термофильный микроорганизм, модифицированный для возможности повышенного продуцирования этанола, где модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа, где нативный ген лактатдегидрогеназы или его участок делетирован и где этот микроорганизм представляет собой вид ОеоЬасШик.
- 2. Микроорганизм по п.1, где этот микроорганизм не содержит систему рестрикции.
- 3. Микроорганизм по любому из пп.1, 2, где этот микроорганизм представляет собой ОеоЬасШик 1йегтод1исо81ба8Ш8.
- 4. Микроорганизм по любому из пп.1-3, где этот микроорганизм представляет собой спорообразующий микроорганизм.
- 5. Микроорганизм по любому из пп.1-4, где этот микроорганизм способен к метаболизму целлобиозы, и/или крахмала, или их олигомера.
- 6. Микроорганизм по любому из пп.1-5, где этот микроорганизм растет при температуре 40-85°С, предпочтительно 50-70°С.
- 7. Микроорганизм по любому из пп.1-6, где этот микроорганизм содержит ненативный ген пируватдекарбоксилазы.
- 8. Микроорганизм по любому из пп.1-7, где этот микроорганизм содержит ненативный ген алкогольдегидрогеназы.
- 9. Микроорганизм по любому из пп.1-8, где этот микроорганизм не содержит интегративный элемент в гене лактатдегидрогеназы.
- 10. ОеоЬасШш 1йегтод1исо81ба8Ш8, обеспечивающий повышенное продуцирование этанола, депонированный в ΝΟΙΜΒ под номером 41275.
- 11. Способ продуцирования этанола, при котором культивируют микроорганизм по любому из пп.1-10 в подходящих условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахара или его олигомера.
- 12. Способ по п.11, где этот способ осуществляют при температуре между 40 и 70°С.
- 13. Способ по п.11, где температура составляет от 52 до 65°С.
- 14. Способ по любому из пп.11-13, где микроорганизм поддерживают в культуре при рН между 4 и 7,5.
- 15. Плазмида для делетирования нативного гена лактатдегидрогеназы, определенная здесь как 8ЕО ΙΌ N0: 2.
- 16. Термофильный микроорганизм, содержащий плазмиду по п.15.
- 17. Корм для животных, содержащий микроорганизм по любому из пп.1-10.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0509068.3A GB0509068D0 (en) | 2005-05-04 | 2005-05-04 | Ethanol production |
GB0511603A GB0511603D0 (en) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | Ethanol production |
PCT/GB2006/001586 WO2006117536A1 (en) | 2005-05-04 | 2006-05-03 | Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200702153A1 EA200702153A1 (ru) | 2008-06-30 |
EA015794B1 true EA015794B1 (ru) | 2011-12-30 |
Family
ID=36637070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200702153A EA015794B1 (ru) | 2005-05-04 | 2006-05-03 | Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090042265A1 (ru) |
EP (1) | EP1880004A1 (ru) |
JP (2) | JP2008539710A (ru) |
KR (1) | KR20080012934A (ru) |
AU (1) | AU2006243052B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0610988A2 (ru) |
CA (1) | CA2607052A1 (ru) |
EA (1) | EA015794B1 (ru) |
MX (1) | MX2007013673A (ru) |
NO (1) | NO20076123L (ru) |
NZ (1) | NZ563043A (ru) |
WO (1) | WO2006117536A1 (ru) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0511602D0 (en) | 2005-06-07 | 2005-07-13 | Tmo Biotec Ltd | Microorganisms |
GB0605889D0 (en) * | 2006-03-24 | 2006-05-03 | Bioconversion Technologies Ltd | Regulation Of Thermophile Ethanol Fermentation |
MY149506A (en) | 2006-05-22 | 2013-09-13 | Biogasol Ipr Aps | Thermoanaerobacter mathranii strain bg1 |
EA017548B1 (ru) * | 2006-09-28 | 2013-01-30 | Тмо Реньюаблз Лимитед | Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, и способ получения этанола при его использовании |
JP2010508013A (ja) | 2006-10-31 | 2010-03-18 | メタボリック エクスプローラー | グリセロールから1,3−プロパンジオールを高収量で生物学的に製造する方法 |
US8227220B2 (en) | 2007-03-30 | 2012-07-24 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the preparation of ethanol from starch |
RU2541785C2 (ru) | 2007-05-09 | 2015-02-20 | ЛАЛЛЕМАНД ХАНГЕРИ ЛИКВИДИТИ МЕНЕДЖМЕНТ ЭлЭлСи | ВЕКТОР ДЛЯ НОКАУТА ГЕНА АЦЕТАТКИНАЗЫ В Clostridium thermocellum, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МИКРООРГАНИЗМ Clostridium thermocellum, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКОГО МИКРООРГАНИЗМА И СПОСОБ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ В ЭТАНОЛ. |
GB0715751D0 (en) * | 2007-08-13 | 2007-09-19 | Tmo Renewables Ltd | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
GB2461495A (en) * | 2008-02-13 | 2010-01-06 | Bioconversion Technologies Ltd | Ethanol production by lactate dehydrogenase-deleted thermophilic microorganisms |
GB2457820B (en) | 2008-02-28 | 2010-09-08 | Green Biologics Ltd | Production process |
GB0806093D0 (en) * | 2008-04-03 | 2008-05-14 | Green Biologics Ltd | Production of butanol |
CA2731256A1 (en) * | 2008-07-24 | 2010-01-28 | Biogasol Ipr Aps | Increased ethanol production in recombinant bacteria |
GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
BR112012018694A2 (pt) | 2010-01-26 | 2015-09-15 | Scale Biofuel Aps | "métodos para a produção e a colheita de etanol e aparelho para a produção e a colheita do mesmo." |
GB2489967A (en) | 2011-04-13 | 2012-10-17 | Ensus Ltd | Method of producing an animal feed by hydrolysis and fermentation |
AU2012297228A1 (en) | 2011-05-18 | 2013-10-31 | Scale Biofuel, ApS | Solar-assisted volatile fermentation products production processes |
KR101871464B1 (ko) * | 2011-09-02 | 2018-06-26 | 한국생명공학연구원 | 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법 |
KR102533454B1 (ko) * | 2014-01-30 | 2023-05-17 | 란자테크 엔지, 인크. | 재조합 미생물 및 이들의 사용 방법 |
EP2977471A1 (en) | 2014-07-23 | 2016-01-27 | PURAC Biochem BV | Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001083784A2 (en) * | 2000-05-01 | 2001-11-08 | Midwest Research Institute | Method of site-specific insertion in zymomonas mobilis |
WO2002029030A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Elsworth Biotechnology Limited | Ethanol production |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5238833A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-24 | Gist-Brocades, Nv | Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species |
US5482846A (en) * | 1988-08-31 | 1996-01-09 | University Of Florida | Ethanol production in Gram-positive microbes |
CA2128862C (en) * | 1992-02-11 | 2008-05-20 | Jonathan G. Seidman | Homogenotization of gene-targeting events |
FR2722210B1 (fr) * | 1994-07-08 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
US6280986B1 (en) * | 1997-12-01 | 2001-08-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Stabilization of pet operon plasmids and ethanol production in bacterial strains lacking lactate dehydrogenase and pyruvate formate lyase activities |
GB0000185D0 (en) * | 2000-01-06 | 2000-03-01 | Agrol Limited | Ethanol production |
GB0011186D0 (en) * | 2000-05-09 | 2000-06-28 | Agrol Limited | Modification of bacteria |
GB0024554D0 (en) * | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Agrol Ltd | Ethanol production |
WO2003016536A2 (en) * | 2001-08-13 | 2003-02-27 | Dtu, Technical University Of Denmark | Plasmids from anaerocellum thermophilum and uses thereof |
CA2498381C (en) * | 2002-09-27 | 2013-04-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Acc gene |
DE60320812D1 (en) * | 2002-09-27 | 2008-06-19 | Dsm Ip Assets Bv | Squalene synthase (sqs) gen |
GB0511602D0 (en) * | 2005-06-07 | 2005-07-13 | Tmo Biotec Ltd | Microorganisms |
GB0520344D0 (en) * | 2005-10-06 | 2005-11-16 | Tmo Biotec Ltd | Microoganisms |
EA017548B1 (ru) * | 2006-09-28 | 2013-01-30 | Тмо Реньюаблз Лимитед | Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, и способ получения этанола при его использовании |
GB0715751D0 (en) * | 2007-08-13 | 2007-09-19 | Tmo Renewables Ltd | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
GB0820262D0 (en) * | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
-
2006
- 2006-05-03 AU AU2006243052A patent/AU2006243052B2/en not_active Ceased
- 2006-05-03 JP JP2008509498A patent/JP2008539710A/ja not_active Withdrawn
- 2006-05-03 MX MX2007013673A patent/MX2007013673A/es active IP Right Grant
- 2006-05-03 CA CA002607052A patent/CA2607052A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-03 EP EP06726966A patent/EP1880004A1/en not_active Withdrawn
- 2006-05-03 US US11/913,480 patent/US20090042265A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-03 BR BRPI0610988-8A patent/BRPI0610988A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-05-03 EA EA200702153A patent/EA015794B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-05-03 NZ NZ563043A patent/NZ563043A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-05-03 WO PCT/GB2006/001586 patent/WO2006117536A1/en active Search and Examination
- 2006-05-03 KR KR1020077028208A patent/KR20080012934A/ko not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-11-27 NO NO20076123A patent/NO20076123L/no not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-10-21 JP JP2011231828A patent/JP2012040016A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001083784A2 (en) * | 2000-05-01 | 2001-11-08 | Midwest Research Institute | Method of site-specific insertion in zymomonas mobilis |
WO2002029030A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Elsworth Biotechnology Limited | Ethanol production |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BISWAS I. ET AL.: "HIGH-EFFICIENCY GENE INACTIVATION AND REPLACEMENT SYSTEM FOR GRAM-POSITIVE BACTERIA", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 175, no. 11, 1 June 1993 (1993-06-01), pages 3628-3635, XP000563688, ISSN: 0021-9193, the whole document * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2607052A1 (en) | 2006-11-09 |
AU2006243052A1 (en) | 2006-11-09 |
NO20076123L (no) | 2007-11-27 |
EP1880004A1 (en) | 2008-01-23 |
KR20080012934A (ko) | 2008-02-12 |
AU2006243052B2 (en) | 2010-07-08 |
EA200702153A1 (ru) | 2008-06-30 |
MX2007013673A (es) | 2008-03-10 |
JP2008539710A (ja) | 2008-11-20 |
US20090042265A1 (en) | 2009-02-12 |
WO2006117536A1 (en) | 2006-11-09 |
NZ563043A (en) | 2010-04-30 |
BRPI0610988A2 (pt) | 2010-08-10 |
JP2012040016A (ja) | 2012-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA015794B1 (ru) | Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола | |
JP4801151B2 (ja) | 不活性化された乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する改変微生物 | |
US8900835B2 (en) | Engineering of thermotolerant Bacillus coagulans for production of D(−)-lactic acid | |
US9469858B2 (en) | Sporulation-deficient thermophilic microorganisms for the production of ethanol | |
Tian et al. | Metabolic engineering coupled with adaptive evolution strategies for the efficient production of high-quality L-lactic acid by Lactobacillus paracasei | |
KR20100061460A (ko) | 에탄올 생산을 위한 호열성 미생물 | |
JP2010504747A (ja) | エタノール生成のための好熱性微生物 | |
CN111154705B (zh) | 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用 | |
CN101775363B (zh) | 乙醇生产 | |
CN102925398A (zh) | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸营养缺陷型大肠杆菌的构建及其应用 | |
CN101522889A (zh) | 用于乙醇生产的嗜热微生物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |