EA018814B1 - Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья и способ обеспечения повышенной продукции этанола при его использовании - Google Patents
Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья и способ обеспечения повышенной продукции этанола при его использовании Download PDFInfo
- Publication number
- EA018814B1 EA018814B1 EA201070259A EA201070259A EA018814B1 EA 018814 B1 EA018814 B1 EA 018814B1 EA 201070259 A EA201070259 A EA 201070259A EA 201070259 A EA201070259 A EA 201070259A EA 018814 B1 EA018814 B1 EA 018814B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- gene
- microorganism
- microorganism according
- starch
- preceding paragraphs
- Prior art date
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 142
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 81
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 title claims abstract description 74
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 title claims abstract description 74
- 239000008107 starch Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 33
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 33
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 9
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 9
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 8
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N dihydrolipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC(S)CCS VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 claims 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 abstract 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 33
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 32
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 32
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010081577 aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 description 4
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 4
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 4
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108050006183 Pyruvate dehydrogenase E1 component Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000956243 Arabidopsis thaliana CSC1-like protein HYP1 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710115643 Cathelicidin-1 Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000855256 Homo sapiens Uncharacterized protein C16orf74 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710156644 Peptide deformylase 3 Proteins 0.000 description 1
- OTSMHWLYYJVJDL-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSS OTSMHWLYYJVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010063499 Sigma Factor Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 102100026591 Uncharacterized protein C16orf74 Human genes 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- OITSCMZDSGPTKD-BTVCFUMJSA-N ethyl acetate;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CCOC(C)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O OITSCMZDSGPTKD-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 101150073444 rd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к термофильному микроорганизму для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированному путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированному с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов Geobacillus.
Description
Данное изобретение касается получения микроорганизмов для производства этанола. В частности, изобретение касается модификации микроорганизмов для возможности утилизации крахмала в качестве субстрата для брожения.
Предшествующий уровень техники
Бактериальный метаболизм может протекать по различным механизмам, в зависимости от вида бактерий и от условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, к которым относятся все патогенные микроорганизмы, получают энергию за счет окисления органических соединений; как правило, в роли таких веществ выступают углеводы (особенно глюкоза), липиды и белки. Биологическое окисление этих органических соединений бактериями приводит к синтезу АТФ как источника химической энергии. Этот процесс допускает также продукцию более простых органических веществ (молекулпредшественников), которые требуются бактериальной клетке для биосинтетических реакций.
Крахмал представляет собой углевод, встречающийся в природе в большом количестве и являющийся основным депо глюкозы у растений. Молекулы крахмала состоят из двух полисахаридов, амилозы и амилопектина. Амилоза представляет собой линейный полимер, состоящий из 500-20000 остатков Ό-глюкозы, соединенных между собой через α-1,4 гликозидные связи и формирующих спиральную структуру. Появление дополнительных α-1,6 гликозидных связей приводит к образованию амилопектина, имеющего разветвленную структуру. Крахмал, как правило, состоит на 20-30% из амилозы и на 7080% из амилопектина. В клетках растений нерастворимый крахмал запасается в твердых гранулах, в которых амилопектин образует кластеры в виде кристаллических мицелл, а амилоза распределена по всему объему. Растворимость крахмала возрастает при нагревании; кристаллы амилопектина становятся желатинообразными и гранулы в итоге растворяются.
Амилаза представляет собой металлсодержащую кальцийзависимую гликозид-гидролазу. Существуют три формы амилазы (α, β и λ), различающиеся по типу гидролизуемых ими связей. Альфа-амилаза катализирует случайный гидролиз внутренних α-0-1,4 гликозидных связей с высвобождением простых сбраживаемых сахаров, включая глюкозу, мальтозу (дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы). Декстрины (короткие низкомолекулярные полимеры Ό-глюкозы, соединенные через а-1,4-связи) высвобождаются при гидролизе амилопектина, а мальтотриоза и мальтоза высвобождаются при гидролизе амилозы. Бета-амилаза действует с невосстанавливающего конца цепочки крахмала, катализируя гидролиз второй α-1,4 гликозидной связи с отщеплением двух остатков глюкозы (мальтозы). Гамма-амилаза способна расщеплять α-1,6 связи в амилопектине. Альфа-амилаза широко распространена в природе, поскольку переваривать крахмал могут многие микроорганизмы. В организме человека α-амилаза в наибольшем количестве встречается в слюне и секретах поджелудочной железы, α-амилазы микроорганизмов классифицируются как разжижающие (случайным образом расщепляют полисахариды с формированием более коротких цепочек) или осахаривающие (образуют моно-, ди- или трисахаридные остатки), в зависимости от точек, в которых происходит гидролиз полимерной цепочки глюкозы.
Основной процесс, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие субстраты, - это гликолиз, представляющий собой последовательность реакций, в результате которых глюкоза превращается в пируват с одновременным синтезом АТФ. Судьба пирувата в процессе выработки метаболической энергии может быть различной, в зависимости от микроорганизмов и условий окружающей среды. Четыре основные реакции с участием пирувата приведены на фиг. 1.
Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы вырабатывают энергию, используя цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетил-коэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой (ΡΏΗ).
Во-вторых, в анаэробных условиях определенные организмы, продуцирующие этанол, могут осуществлять спиртовое брожение путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, которое катализируется пируватдекарбоксилазой (РЭС). и последующего восстановления ацетальдегида до этанола с помощью НАДН, которое катализируется алкогольдегидрогеназой (ΑΟΗ).
Третья реакция, также протекающая в анаэробных условиях, представляет собой превращение пирувата в ацетил-коэнзим А, которое катализируется пируват-формиат-лиазой (РБЬ). Ацетил-коэнзим А затем конвертируется в ацетальдегид ферментом ацетальдегид дегидрогеназой (ΑοΌΗ), а этанол образуется при восстановлении ацетальдегида, катализируемом ΑΟΗ.
Четвертый процесс представляет собой превращение пирувата в лактат, осуществляемое при каталитическом действии лактатдегидрогеназы (БОИ).
Большой интерес представляет собой применение микроорганизмов для получения этанола с использованием как микроорганизмов, естественным образом способных осуществлять анаэробное брожение, так и рекомбинантных микроорганизмов, несущих гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Применение таких микроорганизмов, модифицированных с целью увеличения использования крахмала в качестве метаболического субстрата, позволит эффективно производить этанол из дешевого, широко распространенного неочищенного растительного материала.
- 1 018814
Для производства этанола было предложено использовать термофильные бактерии; их применение имеет то преимущество, что брожение можно проводить при повышенных температурах, что позволяет отгонять вырабатываемый этанол в виде пара при температурах свыше 50°С; это позволяет также проводить брожение при высоких концентрациях субстрата. Тем не менее, существует потребность в улучшенных микроорганизмах для производства этанола из культуральной среды на основе крахмала.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированный путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированный с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов СеойасШик.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ обеспечения повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, включающий культивирование микроорганизма по изобретению в культуральной среде, содержащей крахмал.
Также предложен корм для животных, включающий микроорганизмы по изобретению.
Краткое описание графических материалов
Настоящее изобретение описано со ссылками на сопроводительные графические материалы, где: фиг. 1 схематично изображает метаболический путь гликолиза;
фиг. 2 изображает вектор рСЕМ-Т Еаку®;
фиг. 3 изображает гипотетические участки промотора и генов комплекса ΡΌΗ;
фиг. 4 изображает применение рТМО111 для внедрения гена амилазы, ату8;
фиг. 5 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ату8;
фиг. 6 является графическим изображением, показывающим серию результатов брожения для штамма ТМ304 в культуре с 5% (вес./об.) раствором крахмала;
фиг. 7 является графическим изображением, показывающим серию результатов брожения для штамма ТМ333 в культуре с 5% (вес./об.) раствором крахмала.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма с целью повышения экспрессии гена амилазы.
Повышение экспрессии гена амилазы позволяет микроорганизмам гидролизовать крахмал на отдельные мономеры глюкозы, которые могут затем использоваться в качестве гликолитического субстрата для образования пирувата и затем этанола. Способы повышения экспрессии амилазы и активности фермента предпочтительно включают применение сильных расположенных выше промоторов для регуляции транскрипции гена и внедрения дополнительных генов амилазы, экспрессируемых с большей частотой по сравнению с нативными генами амилазы.
Термофильные микроорганизмы по изобретению могут быть далее модифицированы с целью блокировки экспрессии нативного гена лактатдегидрогеназы и активации гена ΡΌΗ.
Инактивация гена лактатдегидрогеназы позволяет предотвратить расщепление пирувата до лактата и потому способствует (при подходящих условиях) расщеплению пирувата до этанола с помощью пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, чтобы ген лакгатдегидрогеназы был блокирован путем делеции внутри или вне гена.
Активация гена рбй способствует превращению пирувата в ацетил-СоА, который далее при подходящих условиях может быть использован для образования ацетальдегида и, в конечном счете, этанола с помощью ацетальдегиддегидрогеназы. Еще одно преимущество активации ΡΌΗ заключается в том, что уровень пирувата, способного оказывать ингибирующий эффект на захват глюкозы и гликолиз, оказывается сниженным. Это еще больше активирует выработку этанола.
Термин сильный промотор здесь означает промотор, обеспечивающий уровень экспрессии соответствующего белка выше 0,5% от растворимого белка клетки.
Микроорганизм может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но предпочтительно, чтобы микроорганизм относился к видам ВасШик. Особенно желательно, чтобы это был микроорганизм дикого типа, принадлежащий к видам СеойасШик, а особенно СеойасШик Шеттод1исок16акшк.
В предпочтительном воплощении микроорганизмы, выбранные для модификации, называют микроорганизмами дикого типа, т.е. они не являются мутантами, полученными в лабораторных условиях. Микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, в которых предполагается присутствие термофилов. Выделенные микроорганизмы дикого типа могут иметь ограниченную амилазную активность, которая недостаточна для выработки этанола при культивировании в среде, содержащей крахмал в качестве основного источника углерода. Выделенные микроорганизмы дикого типа будут способны продуцировать этанол из пирувата, но в отсутствие модификации основным продуктом брожения, скорее всего, будет лактат.
Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению имел конкретные желаемые характеристики, которые позволили бы использовать его в процессе брожения. Микроорганизм желательно не должен иметь системы рестрикции, что устранило бы необходимость в метилировании ίη у1уо. Предпоч
- 2 018814 тительно, чтобы микроорганизм можно было трансформировать с высокой частотой. Более того, микроорганизм должен быть стабилен по меньшей мере в 3% этаноле (вес./об.), предпочтительно по меньшей мере в 5-10% этаноле (вес./об.). Микроорганизм должен иметь такую скорость роста в непрерывной культуре, чтобы обеспечивать скорости разбавления порядка 0,3 ч-1 и выше.
Микроорганизм должен являться термофилом и быть способным к росту в диапазоне температур 40-85°С. Предпочтительно, чтобы микроорганизм был способен к росту в температурном диапазоне 5070°С. Кроме того, желательно, чтобы микроорганизм мог расти при рН 7,2 и ниже, в частности рН 4,56,9.
Культуральная среда предпочтительно может содержать по меньшей мере 1% крахмала (вес./об.), предпочтительно по меньшей мере 10% крахмала (вес./об.) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20% крахмала (вес./об.). Крахмал может быть растворимым или нерастворимым (например, зерновой крахмал). Другие предпочтительные компоненты культуральной среды могут включать те, что приведены в табл. 1, но не ограничиваться ими.
Таблица 1
| Химическое вещество | Объем/л | Конечная концентрация |
| ЫаНгРО4х2Н2О | 10 мл | 20 ММОЛЬ |
| К28О4 | 20 мл | 10 ммоль |
| Лимонная кислота* Н2О | 8 мл | 8 ммоль |
| Мд8О4*7Н2О | 20 мл | 5 ммоль |
| СаС1г*2Н2О | 4 мл | 0,08 ммоль |
| Матричный раствор сульфатов элементов в следовых количествах | 5 мл | См. Таблицу 2 |
| Ыа2МоО4 *2Н2О | 0,1 мл | 1,65 мкмоль |
| (ΝΗ4)23Ο4 | 12,5 мл | 25 мкмоль |
| 1% Биотин* | 0,3 мл | 12 мкмоль |
| 40% Глюкоза** | 3x25 мл | 3% (вес/объем) |
| Пеногаситель | 2,5 мл |
*Приготовлено путем растворения 0,1 г биотина в 10 мл БМ8О.
“Конечная концентрация глюкозы предпочтительно между 1 и 4% (вес./об.).
Компоненты матричного раствора сульфатов элементов в следовых количествах показаны в табл. 2. Таблица 2
| Химическое вещество | ГЛ'1 (мл) | Конечная концентрация в |
| Конц. Н2ЗО4 | 5,000 | |
| Ζη ЗО4*7Н2О | 1,440 | 25 мкмоль |
| Ре ЗО4*7НгО | 5,560 | 100 мкмоль |
| Мп 8О4*Н2О | 1,690 | 50 мкмоль |
| Си ЗО4х5Н2О | 0,250 | 5 мкмоль |
| Со 5О4*7Н2О | 0,562 | 10 мкмоль |
| ΝΪ ЗО4*6Н2О | 0,886 | 16,85 мкмоль |
| Н3ВОз | 0,080 | |
| Деионизированная Н2О (конечный объем) | 1000 мл |
В предпочтительном воплощении гетерологичный ген амилазы кодирует α-амилазу (а-1,4-глюкан4-глюканогидролазу, в классификации ферментов ЕС 3.2.1.1). Предпочтительно, чтобы ген амилазы был получен из видов СеоЬасШиз, в частности СеоЬасШиз 81еагоШегторЫ1и8.
Кодирующая последовательность α-амилазы была расшифрована, и методики, позволяющие выделять и амплифицировать ген, хорошо известны специалистам. Предпочтительно, чтобы для обеспечения повышенной экспрессии амилазы у микроорганизма по изобретению по сравнению с диким типом ген амилазы был помещен под контроль сильного промотора, работающего в условиях низкой аэрации или анаэробных условиях, благоприятствующих продукции этанола термофильными микроорганизмами. Предпочтительно, чтобы промотором являлся промотор 1бй, который может быть аутологичным, но предпочтительно должен быть гетерологичным и наиболее предпочтительно полученным у тех же видов, что и ген амилазы. Подходящие промоторы включают, например, Р_1бй из С.81еаго1йегторЫ1и8 ЫСА 1503, Р_1еггА из С.81еато1йегторЫ1и8 Ό8Μ13240 и Р_рД из В.сетеиз АТСС 14579, но не ограничиваются ими.
В другом воплощении изобретения ряд различных сильных промоторов помещается выше гена амилазы с целью еще большего усиления экспрессии. Подходящие промоторы включают, например,
- 3 018814 промотор глицеральдегид-3-фосфата (Ρ_ΟΑΡΌΗ) и промотор амилазы из 6.81еаго1РегторЫ1и8 ИСА 1503, но не ограничиваются ими.
Нуклеотидная последовательность Ρ_161ι также известна, и методики клонирования и сборки последовательности промотора выше гена амилазы известны квалифицированным специалистам.
Последовательность промотора/амилазы может быть клонирована в подходящую плазмиду или вектор экспрессии, содержащие множественные сайты рестрикции. Существуют многочисленные коммерчески доступные векторы экспрессии, такие как вектор рСЕМ®-Т Еазу (фиг. 2). Рестрикционные ферменты могут применяться для вырезания конструкции Р_1бй/амилаза в виде отдельного фрагмента, который можно лигировать по соответствующим сайтам рестрикции в температурочувствительную плазмиду, например рИС19 (Иете Епд1апб Вю1аЬб). Предпочтительно использовать плазмиду с нокаутом пируват-формиат-лиазы. Конструкция плазмиды, содержащая ген амилазы/промотор 1611, может затем быть введена в микроорганизм по изобретению путем электропорации и пройти гомологичную рекомбинацию с геномной ДНК. Микроорганизмы с интеграцией плазмиды в хромосому могут быть селектированы на основании их устойчивости к антибактериальным агентам, таким как ампициллин или канамицин. Амилазная активность может быть также выявлена по видимым зонам просветления крахмала, например в тестах на пластинах.
Нуклеотидная последовательность для лактатдегидрогеназы теперь известна. Используя эту последовательность, квалифицированный специалист может направленно воздействовать на ген лактатдегидрогеназы для достижения инактивации гена через различные механизмы. Возможно инактивировать ген лактатдегидрогеназы путем вставки транспозона. Однако предпочтительно, чтобы ген лактатдегидрогеназы был инактивирован путем делеции последовательности гена или части последовательности гена. Делеция предпочтительнее, поскольку она позволяет избежать проблем с реактивацией последовательности гена, которая часто происходит при использовании инактивации с помощью транспозона. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируется путем интеграции температурочувствительной плазмиды (например, плазмиды ρϋΒ190-1άΡ, как описано в РСТ/СВ06/01586), что приводит к естественной гомологичной рекомбинации, или интеграции плазмиды в хромосому микроорганизма. Микроорганизмы с интеграцией плазмиды в хромосому могут быть селектированы на основании их устойчивости к антибактериальным агентам. Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может произойти в результате единичной кроссинговерной рекомбинации или двух (или более) кроссинговерных рекомбинаций.
В следующем предпочтительном воплощении микроорганизм модифицируют далее с целью активации ΡΌΗ. ΡΌΗ представляет собой большой ферментный комплекс, содержащий три единицы: Е1 пируват декарбоксилазу (ЕС 1.2.4.1, не ЕС 4.1.1.1), Е2 - дигидролипоамид-трансацетилазу и Е3 дигидролипоамид-дегидрогеназу. Для этого комплекса необходим ряд кофакторов, включая НАД, ФАД, коэнзим А, липоевую кислоту и тиаминпирофосфат (ТПФ). Этот комплекс кодируется четырьмя генами (поскольку единица Е1 является гетеродимером, состоящим из субъединиц α и β), которые часто обозначаются как ράΙιΑ, ράΙιΒ, рбйС и рбйЭ (Ε1α, Е1 β, Е2 и Е3 соответственно). Единица Е1 пируватдегидрогеназы требует наличия кофермента ТПФ по той же причине, что и пируватдекарбоксилаза (ЕС 4.1.1.1) требует наличия ТПФ и катализирует аналогичную реакцию декарбоксилирования, но в присутствии коэнзима А и липоевой кислоты, которые несут другие единицы фермента, а продуктом является ацетилСоА, а не ацетальдегид. Однако пируватдекарбоксилазная активность единицы Е1 была зафиксирована, когда последняя не была комплексирована с другими единицами ΡΌΗ (Ьевбатб & Ρе^йат; Тйе 1оигиа1 о£ В1о1од1са1 С’йетМгу; 1994, 269:14, 10378-10383; Тотаг е! а1.; Аррйеб МютоЬю1о§у апб Вю!есйпо1о§у; 2003, 62, 76-82; Ртапк е! а1.; 8с1епсе; 2004, 306: Ос!. 29, 872-876, 8ирр1етеп!ату ба!а). Соответственно, пируватдекарбоксилазная активность фермента ЕС 1.2.4.1 может быть повышена путем активации ΡΌΗ с тем, чтобы ацетальдегид продуцировался в большей степени, чем ацетил-СоА. Повышения пируватдегидрогеназной активности добиваются также с целью устранения лимитирующего звена производства, обусловленного пируватом, имеющего место у штаммов с инактивированной ΕΌΗ, чтобы обеспечить выработку большего количества этанола при меньшем количестве ацетата и формиата в качестве побочных продуктов.
С этой целью были выделены гены рбй и окружающей последовательности с помощью стандартного метода прогулки по хромосоме. Было выделено и секвенировано примерно 8,8 кб ДНК, в которой было обнаружено присутствие следующих генов, приведенных на фиг. 3 и в табл. 3.
- 4 018814
Таблица 3
| Ген | Позиция (п.н.) | Предполагаемая функция | Рамка (а.к. на 5’ и 3’) | Размер (а.к.) |
| рдГ2 | 746-192 | Пептиддеформилаза | -3 (ΜΙΤ - ΙΕΚ) | 184 |
| ог(2 | 868-1497 | Неизвестная — гипотетический белок | +1 (МОК - Ι1Λ/Κ) | 209 |
| рМА(а) | 1875-2984 | σ-субъединица пируватдегидрогеназы | +3 (МСА-Е8К) | 369 |
| рЫА@) | 3003-3965 | β-субъединица пируватдегидрогеназы | +3 (МЮ - ΙΝΓ) | 320 |
| рРЬВ | 4058-5368 | Дигидролипоамидтрансацетилаза | +2 (УАГ - МЕА) | 436 |
| 5373-6785 | Липоамиддегидрогеназа | +3 (МУУ - Ι3Κ) | 470 | |
| огП | 7432-6833 | Неизвестная — Гипотетический белок | -1 (ΜΝΚ-СТЕ) | 199 |
| огга | 7964-8647 | Транспозаза | +2 (МЫ. - 8РР) | 227 |
Гипотетические участки промотора показаны на фиг. 3 (стрелки) - один выше от начала рбИА и второй потенциальный промотор, расположенный перед рбИВ. Предыдущий пример вторичного промотора в кластере ΡΌΗ был описан для ВасШик 8иЬШ18 (Сао с1 а1.; 1оитиа1 оГ Вас1епо1оду, 2002, 184:10, 2780-2788), однако наиболее подробно описанные кластеры гена содержат только один промотор выше от кластера (№уе1тд с1 а1.; ВюсЫтюа Лс1а: 1998, 1385, 367-372). Активацию можно проводить с помощью методик, известных в данной области. В частности, активацию можно осуществлять путем введения подходящей промоторной или энхансерной последовательности выше комплекса ΡΌΗ.
Известно, что ферментный комплекс работает как в аэробных, так и в анаэробных условиях (Сатккои е1 а1/; 1пГес1юп апб 1ттиийу; 1985, 49:3, 674-678), но в целом считается, что это аэробный фермент (СИ. 15; Рг1ис1р1с5 оГ Вюсйет18)гу, Ьейи1идег, Иейоп & Сох; 2иб Еб, \Уог111 РиЬйкйегк, Ыете Уотк, 1993, р. 447), при этом пируват-формиат-лиаза (РРЬ) является его анаэробным аналогом. Оба фермента превращают пируват, образовавшийся в ходе гликолиза, в ацетил-СоА, чтобы направить его в цикл трикарбоновых кислот, но этот цикл работает полностью только в аэробных условиях. Тем не менее, поскольку желательно использовать анаэробные условия, в данном изобретении предпочтительно использовать промоторы, работающие в анаэробных условиях. Так, можно использовать промоторы для ферментов, которые, как полагают, работают в анаэробных условиях: примерами могут быть промотор ЬЭН (Р_1бИ из 6.81еаго1йегторЫ1и8 ИСА 1503), промоторы РРЬ (Р_рГ1 из В.сегеик АТСС 14579 и СдйегтоДисомбамщ ИС1МВ11955) и промоторы ферредоксина (Р_ГеггА из О. 81еаго)йегторЫ1и8 Ό8Μ13240) - согласно описанию в РСТ/6В2007/03699, включенному в описание во всей полноте путем ссылки.
В предпочтительном воплощении следующая модификация проводится с целью повышения активности РИС, таким образом способствуя превращению пирувата в ацетальдегид. Это может быть осуществлено путем инактивации Е2; дигидролипоамид-трансацетилазы (ЕС 2.3.1.12). Инактивацию можно проводить таким же образом, как и инактивацию ЬЭН, но в данном случае мишенью для блокировки выступает ген Е2.
В следующем воплощении микроорганизм по изобретению имеет модификацию, которая инактивирует ген пируват-формиат-лиазы и, таким образом, предотвращает/уменьшает превращение пирувата в ацетил-СоА и формиат. Пируват-формиат-лиаза (РРЬ) является анаэробным аналогом пируватдегидрогеназы (РЭН) и превращает пируват в ацетил-СоА и формиат (см. фиг. 1). Ацетил-СоА может быть превращен в этанол с помощью ацетальдегиддегидрогеназы (АсНЭ), в то время как формиат представляет собой нежелательный побочный продукт, способный ингибировать рост этанологенных организмов.
РРЬ была выбрана как мишень для нокаута с целью направления метаболического потока в сторону выработки этанола и улучшения окислительно-восстановительного баланса остального пути синтеза этанола. Дополнительным преимуществом такой обработки является выключение образования формиата. Активность РРЬ можно ингибировать с помощью вставки транспозона, делеции гена или делеции части гена с получением мутанта, который не требует селекции с помощью антибиотика для поддержания измененного фенотипа. В данном воплощении предпочтительно, чтобы микроорганизм претерпел как инактивирование лактатдегидрогеназы, так и активирование пируватдегидрогеназы, с тем чтобы при
- 5 018814 анаэробных условиях получить повышенную продукцию этанола.
В следующем предпочтительном воплощении микроорганизм также содержит гетерологичные гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Экспрессия таких гетерологичных генов приводит к синтезу ферментов, которые переключают метаболизм таким образом, чтобы этанол был основным продуктом брожения. Эти гены могут быть получены у микроорганизмов, обычно осуществляющих анаэробное брожение, включая виды Ζνιηοιηοπαδ. в том числе Ζνιηοιηοπαδ шоЫШ
Способы получения и внедрения гена в микроорганизмы известны, например, в 1пдгат с1 а1., ΒίοΙοοΙι. & ВюЕпд., 1998; 58 (2+3): 204-214 и И8 5916787, содержание которых включено в описание во всей полноте путем ссылки. Ген может быть введен в плазмиду или встроен в хромосому, по усмотрению квалифицированного специалиста.
Микроорганизмы по изобретению культивируют с применением растворимого крахмала в качестве составной части исходного сырья. Температура, рН и другие условия роста могут быть выбраны исходя из известных требований культуры.
Теперь будет дано описание воплощения настоящего изобретения, со ссылками на сопроводительные иллюстрации, в следующем примере. Ниже описаны в общих чертах два подхода для внедрения гена α-амилазы Ο.δΐθατοίΗθ^ορΗίΙυδ Ό8Μ22 в геном Ο.11ιοπηοβ1ιιοο5ίά;·ΐ5ίιΐ5 ЫС1МВ 11955. Способы осуществления настоящего изобретения, приведенные в качестве примеров, не являются лимитирующими.
Пример.
Внедрение гена амилазы.
Подход 1. Быстрая стратегия с применением фрагмента Νοίΐ из существующего клона рСЕМ-ЬЛ.
С помощью методик, известных в данной области техники, последовательность α-амилазы (ату8) была получена в ходе ПЦР и присоединена к промотору 1611 (Р_161) из 11955. Данная конструкция была клонирована в коммерчески доступный вектор экспрессии рСЕМ-Т Еаку® и обозначена рСЕМ-ЬЛ. Как показано на фиг. 2, сайт лигирования в векторе рСЕМ-Т Еаку фланкирован полилинкером. Благодаря этому возможно вырезать встроенные последовательности Р_161/амилаза в составе фрагмента Νοΐΐ/Νοίΐ.
Фрагмент Νοίΐ из рСЕМ-ЬЛ был лигирован по сайту Νοί1 плазмидной конструкции рТМО111 с нокаутом рД для получения двух дочерних плазмидных конструкций, рТМО139 и рТМО140. Они были введены путем электропорации в ТМ242, стабильный РЕЬ-негативный штамм 11955. Микроорганизмы, предположительно интегрировавшие плазмиду (интегранты), были селектированы при 68°С.
Первичные трансформанты (автономные плазмиды) и первичные интегранты были протестированы на продукцию амилазы при культивировании колоний на чашках со средой ТСР с 0,4% растворимым крахмалом в течение 3 дней при 60°С с последующей окраской йодным раствором по Граму. Вокруг этих штаммов были видны большие зоны просветления (гидролиза крахмала), сравнимые с контролем Э8М22. ТМ242 в этом тесте обнаружил следы активности, значительно меньшей, чем у Э8М22, обладающего некоторой фоновой активностью. Субкультивирование первичных интегрантов в отсутствие канамицина с последующей репликацией колоний в среде ТСР с канамицином использовали для выявления потенциальных мутантов с двойным кроссинговером (ЭСОк). Всего на амилазную активность было протестировано 32 канамицин-чувствительные колонии в среде ТСР с 0,4% растворимым крахмалом (3 мл на лунку 12-луночных плашек ^δίπτ, в течение 3 дней при 60°С). Ни одна не вызвала образования больших зон, за исключением положительного контроля Э8М22. У большинства штаммов имелись следы просветления, сравнимые с контролем ТМ242, а у 5 обнаружились небольшие, но значимые зоны просветеления. ПЦР-анализ был проведен на образцах генома двух из этих штаммов, ТМ319 и ТМ320, с применением вырожденных праймеров Ьаттбба и Ьатт72, которые были созданы на основании гомологии в последовательности между известными последовательностями РЕЬ ВасШик. У обоих штаммов был получен единственный ПЦР-продукт размером приблизительно 3,1 кб, при разрезании которого с помощью Νοίΐ образовывалась двойная полоса размером приблизительно 0,6 кб и полоса размером приблизительно 2,0 кб. Это согласовывалось с предполагаемой заменой/вставкой гена. В контролях были получены ожидаемые результаты, продукт размером приблизительно 1,7 кб из 11955 (дикий тип), который не разрезался при помощи Νοίΐ, и продукт размером приблизительно 1,3 кб из ТМ242, при расщеплении которого при помощи Νοίΐ образовывалась двойная полоса размером приблизительно 0,6 кб. Таким образом, было обнаружено, что в данных штаммах (ТМ319 и ТМ320) произошла интеграция конструкции амилазы по локусу рД.
Подход 2. Получение конструкций амилазы с промотором Р_161 (ЛСЛ).
Стратегия, использованная для помещения кодирующей последовательности амилазы из Э8М22 под контроль Р_161 (ЛСЛ), показана на фиг. 4. рТМО31 представляет собой плазмидный вектор, содержащий фрагмент ЕСОК1/8паВ1 рИВ110, вставленный в полилинкер (или ти1Нр1е οΐοηίπβ вбе, тск) рИС19 (ЫЕВ).
Кодирующую последовательность амилазы амплифицировали в ходе ПЦР в виде фрагмента Н6е1/№1к с использованием в качестве матрицы конструкции рСЕМ-ЬЛ. Р_161 (ЛСЛ) амплифицировали в виде фрагмента Н6е1/№11 с использованием рТМО49 (полученным при клонировали Р_161 (ИСЛ 1503) в рТМО23) в качестве матрицы, продукты были клонированы и собраны в рТМО23 (рИС19 с удаленным
- 6 018814 сайтом Νάβΐ) для получения конструкций с инсерцией (заменой гена) рТМО146 и рТМО147 (дочерние плазмиды). В табл. 4 подробно представлены компоненты ПЦР для получения конструкций Р_1бй (Νί.Ά)/αιην8 для вставки в 11955.
Таблица 4
| Фрагмент ПЦР | Матрица | Праймеры | Размер (п.н.) |
| Ату8 сбз ΝΰθΙ/ΝοΙΙ | рСЕМ-ίΑ | Ватг87 Ватг88 | 1657+праймеры |
| Ρ_Ιάή(ΝΟΑ) Νοί Ι/ΝόβΙ | ρΤΜΟ49 | Ватг89 Ватг38 | 180+праймеры |
Секвенирование клонов амилазы.
Клонированные продукты ПЦР кодирующей последовательности амилазы, полученные с помощью олигонуклеотидов Ьатт87 и Ьатт88 (см. табл. 4), секвенировали для проверки их целостности. Секвенировали два отдельных клона. В каждом обнаружили различные точечные мутации, предположительно возникшие в ходе ПЦР. Для дальнейшей работы был выбран клон рТМО135 (продукт ПЦР, лигированный по тупым концам по сайту 8ша1 в рТМО23). Мутация, возникшая у данного клона в ходе ПЦР, представляет собой молчащую мутацию, кодирующую ту же аминокислоту, с одинаковой частотой встречаемости кодона согласно опубликованным частотам встречаемости кодонов С.каи81орЫ1и8. Кодирующая последовательность амилазы из рТМО135 (за исключением стартового кодона) показана на фиг. 5. Нуклеотиды, отличающиеся в данной последовательности от опубликованной последовательности Э8М22 ату§ (номер доступа М57457), подчеркнуты. Существует 9 отличий между последовательностью рТМО135 (охватывающей 15 пн) и опубликованной последовательностью Э8М22 ату§ (М57457). Несовпадение в позиции 1449 представляет собой мутацию, возникшую в рТМО135 в ходе ПЦР.
Секвенирование вставки амилазы в рТМО139, имеющей фрагмент Νοΐΐ из рСЕМ-ЬА, показало идеальное совпадение с рТМО135 (за исключением мутации 1449 пн). Кодирующая последовательность амилазы затем была амплифицирована в ПЦР непосредственно с геномной ДНК С.81еаго1йегторЫ1и8 Э8М22 (штамм был получен из коллекции Э8М2). Полученный ПЦР-продукт (с помощью олигонуклеотидов Ьатг87 и Ьатг88, как ранее) клонировали в рТМО23 (для получения рТМО145) и секвенировали. Последовательность была идентичной рТМО135 (за исключением мутации 1449) и рТМО139, за исключением 904 пн. Как в рТМО135, так и в рТМО139 нуклеотидом в положении 904 является А, а в рТМО145 - С. Эта мутация приводит к замене в этом положении аспарагиновой кислоты на аспарагин. Данный кодон (САС для аспарагиновой кислоты) оказался консервативным во всех протестированных последовательностях амилазы СеоЬаеШик, так что, вероятно, эта мутация возникла в ходе ПЦР при клонировании последовательности амилазы из Э8М22. Другие отличия в последовательности предположительно являются ошибками в опубликованной последовательности; сравнение с другими последовательностями амилазы СеоЬаеШик указывает на то, что последовательность (например, в рТМО135 и рТМО145) гораздо ближе к консенсусной, чем опубликованная последовательность (М57457).
Эксперименты были продолжены с конструкциями рТМО145 и рТМО146, несмотря на мутацию 904, поскольку было очевидно, что клонированный фрагмент №11 из рСЕМ-ЬА обусловливал существенную амилазную активность на крахмальных пластинах.
Получение и характеризование мутантов с двойным кроссинговером для рТМО145 и рТМО146 (Р_1611 (№'.’А)/ату8).
рТМО145 и рТМО146 были введены в ТМ242 путем электропорации и предполагаемые мутанты с двойным кроссинговером (ОСО) были отобраны согласно предыдущему описанию. Всего на амилазную активность в тестах на пластинах было протестировано 48 предполагаемых мутантов с ЭСО (канамицинчувствительных). У 18 была обнаружена очень высокая амилазная активность (другие оказались сравнимы с контролем ТМ242). При посеве колоний на большие плашки у них образовывались зоны просветления, по меньшей мере, такого же размера, как в контроле Э8М22. Четыре из этих штаммов, ТМ304, ТМ305, ТМ311 и ТМ315, были выбраны для дальнейшей работы. Геномная ДНК была получена и использована в ПЦР-анализе. Для всех четырех полученные результаты указывали на инсерцию гена ату§ по локусу рД. Два штамма мутантов амилазы, ТМ304 и ТМ305, были протестированы на продукцию этанола в среде А8УЕ (0,5%) вначале с глюкозой в качестве источника углерода, а затем с растворимым крахмалом. Тестирование проводили в условиях низкой и высокой аэрации. Результаты показаны в табл. 5. ТМ304 и ТМ305 продуцировали приблизительно столько же этанола из растворимого крахмала, как и из глюкозы, как в условиях высокой, так и низкой аэрации. ТМ242 продуцирует значительно более низкие количества этанола из крахмала по сравнению с глюкозой, но этот эффект значительно менее выражен в в условиях более высокой аэрации. ТМ304 и ТМ305 продуцируют количество этанола, сравнимое с ТМ242 при культивировании с глюкозой, однако при инкубации этих трех штаммов в присутствии крахмала очевидно, что более высокая активность амилазы у ТМ304 и ТМ305 позволяет микроорганизмам конвертировать практически весь крахмал в этанол. В условиях низкой аэрации это осуществляется практически на том же уровне, как с глюкозой, тогда как способность ТМ242 продуцировать этанол из крахмала составляет приблизительно треть от его способности конвертировать глюкозу в этанол.
- 7 018814
Таблица 5
| Штамм | Источник углерода | Ог | Глюкоза | Этанол | Ацетат | Крахмал* |
| ТМ304 | 2% глюкоза | Низкий | 15,9 | 144,6 | 3,1 | |
| ТМ305 | 2% глюкоза | Низкий | 14,3 | 141,8 | 3,4 | |
| ТМ242 | 2% глюкоза | Низкий | 8,7 | 142,7 | 3,8 | |
| ТМ304 | 2% растворимый крахмал | Низкий | 3,8 | 138,4 | 4,1 | |
| ТМ305 | 2% растворимый крахмал | Низкий | 4,6 | 135,9 | 3,8 | |
| ТМ242 | 2% растворимый крахмал | Низкий | 0,0 | 52,5 | 7,6 | да |
| ТМ304 | 2% глюкоза | Высокий | 18,2 | 113,4 | 19,7 | |
| ТМ305 | 2% глюкоза | Высокий | 10,4 | 119,8 | 20,8 | |
| ТМ242 | 2% глюкоза | Высокий | 7,9 | 127,8 | 17,3 | |
| ТМ304 | 2% растворимый крахмал | Высокий | 16,8 | 98,9 | 20,7 | |
| ТМ305 | 2% растворимый крахмал | Высокий | 6,7 | 117,9 | 25,2 | |
| ТМ242 | 2% растворимый крахмал | Высокий | 6,5 | 78,0 | 23,5 | да |
*Тест на остаточный крахмал; 0,5 мл культуры плюс 0,2 мл иодного раствора для окраски по Граму; отрицательный во всех случаях, за исключением отмеченных. Инокулят: 100 мкл замороженной исходной культуры.
Посев: 10 мл 2ΤΥ в 50 мл конической колбе, 52°С в течение ночи, 250 об/мин, пересадка 1 мл (10%).
Выращивание: 10 мл Ά8ΥΕ (0,5%) плюс источник углерода в 15 или 50 мл пробирке типа 1а1соп, 60°С, 250 об/мин, 24 ч.
Результаты серии ферментаций для штамма ΤΜ304, культивируемого в 5% (вес./об.) растворимом крахмале, показаны на фиг. 6. Простой тест с иодным раствором для окраски по Граму показал, что в отличие от ТМ242, мутанты ОСО гидролизовали весь крахмал. Результаты четко подтверждали эффективность встраивания гетерологичной амилазы под контролем промотора Ρ_1ά1ι (ЫСЛ) для утилизации крахмала в условиях низкой аэрации.
Получение и характеризована мутантов ОСО для рТМО150 и рТМО151 (Р_1бД (КСЛ)/ашу8 - отсутствие мутации).
Новый ПЦР-продукт ашу§ из геномной ДНК Ό8Μ22 использовали для получения чистых конструкций ОСО, обозначенных рТМО150 и рТМО151. Эти две плазмиды имеют вставку Р_1бД (ЫСЛ) в гене рД в противоположных ориентациях. рТМО150 находится в том же направлении транскрипции, как рД. рТМО151 находится в противоположном направлении, как Р_1бД (ЫСЛ) в рТМО146 и рТМО147. Мутанты ЭСО были получены из обеих плазмид, и по два мутанта из каждой были верифицированы при помощи ПЦР (ТМ328 и 329 из рТМО150 и ТМ333 и 335 из рТМО151). Были протестированы два мутантных штамма с амилазой, ТМ304 и ТМ305. Все четыре мутантных штамма, наряду с ТМ304, ТМ305 и ТМ242, протестировали на продукцию этанола в условиях низкой аэрации в среде Ά8ΥΕ (0,5%), вначале с 2% (вес./об.) глюкозой в качестве источника углерода, а затем с 2% (вес./об.) растворимым крахмалом и, наконец, с 3% (вес./об.) растворимым крахмалом.
Результаты, приведенные в табл. 6, показывают, что все мутантные штаммы одинаково хорошо себя продемонстрировали в 2% (вес./об.) растворимом крахмале, продуцируя в два раза больше этанола по сравнению с исходным штаммом ТМ242. В 3% (вес./об.) растворе крахмала ТМ333 продуцирует больше этанола и образует большую зону просветления на крахмальных пластинах, чем другие мутанты, что указывает на то, что ТМ333 может быть лучшим продуцентом этанола по сравнению с ТМ304.
- 8 018814
Таблица 6
| Штамм | Источник углерода | Глюкоза (ммоль) | Этанол (ммоль) | Зона просветления крахмала |
| ТМ328 | 2% глюкоза | 25,1 | 128,6 | 852 |
| ТМ329 | 2% глюкоза | 26,7 | 121,3 | 871 |
| ТМЗЗЗ | 2% глюкоза | 12,7 | 135,4 | 871 |
| ТМ335 | 2% глюкоза | 37,5 | 102,8 | 860 |
| ТМ304 | 2% глюкоза | 3,9 | 149,8 | 882 |
| ТМ305 | 2% глюкоза | 9,5 | 151,5 | 886 |
| ТМ242 | 2% глюкоза | 20,4 | 130,8 | 879 |
| ТМ328 | 2% крахмал | 5,0 | 127,5 | 1817 |
| ТМ329 | 2% крахмал | 4,8 | 132,2 | 1816 |
| ТМЗЗЗ | 2% крахмал | 4,8 | 133,3 | 1626 |
| ТМ335 | 2% крахмал | 12,0 | 124,8 | 1836 |
| ТМ304 | 2% крахмал | 6,7 | 135,0 | 1727 |
| ТМ305 | 2% крахмал | 6,6 | 136,1 | 1716 |
| ТМ242 | 2% крахмал | 0,0 | 62,2 | 3803 |
| ТМ328 | 3% крахмал | 13,9 | 139,3 | 2817 |
| ТМ329 | 3% крахмал | 14,1 | 137,4 | 2824 |
| ТМЗЗЗ | 3% крахмал | 30,6 | 151,3 | 2333 |
| ТМ335 | 3% крахмал | 16,9 | 121,4 | 2991 |
| ТМ304 | 3% крахмал | 31,0 | 141,2 | 2440 |
| ТМ305 | 3% крахмал | 30,0 | 140,1 | 2510 |
| ТМ242 | 3% крахмал | 0,0 | 75,6 | 6306 |
Данные результаты подтверждаются результатами серии ферментаций ТМ333 (проведенных в тех же условиях, что и ферментация штамма ТМ304 (фиг. 6)), которые отображены на фиг. 7 и позволяют предположить, что ТМ333 способен утилизировать всю глюкозу, полученную из крахмала.
Для гарантии того, что мутантные штаммы ТМ304 и ТМ333 ведут себя аналогичным образом с исходным штаммом ТМ242 и не несут каких-либо не предполагаемых мутаций, было проведено их сравнительное тестирование. Результаты приведены в табл. 7 А и 7Б.
Таблица 7А
| Штамм I | Переключение аэрации | Часов до полного потребления | сахара | Оптич. плотность | Оставшаяся | глюкоза /ммоль | Пируват/ммоль I | *- £ £ 2 51 |
| ТМ304 | Зч/О05,9 | 6,2 | 10,1 | 0 | 1 | 8 |
| ТМЗЗЗ | 34/005,5 | 7,4 | 9,1 | 0 | 1 | 10 |
| ТМ242 | 2,54/005,6 | 7,5 | 9,8 | 0 | 1 | 10 ... ..... |
Таблица 7Б
| Штамм | Формиат /ммоль | Ацетат /ммоль | Этанол /ммоль | Выход этанола после анаэробного переклюнения, г/г | Общий выход этанола: максимум этанола |
| ТМ304 | 0 | 12 | 336 | 0,41 | 0,40 |
| ТМЗЗЗ | 0 | 16 | 293 | 0,44 | 0,38 |
| ТМ242 | 0 | 13 | 314 | 0,44 | 0,42 |
- 9 018814
Перечень последовательностей
| <11О> | ТМО РЕНЬЮАБЛЗ ЛИМИТЕД |
| <120> | Термофильные микроорганизмы для продуцирования этанола |
| <130> | σν)σοΐ37θΗθ |
| <140> <141> | 0715751.4 2007-08-13 |
| <160> | 1 |
| <170> | РаСепЁ.1п ν©Γ3ίοη 3.3 |
| <210> <211> <212> <213> | 1 1654 ΌΝΑ ОеоЬасШиз зСеагоСИегторЬИиз |
| <400> 1 сСаасдЁЁСс | ассдсадсаЁ | Ссдаааадда | СддаЬдЪЪсс | СдсСсдсдСЪ | СЁСдсСсасС | 60 |
| дссССдсЁдС | СсСдсссаас | сддасадссе | дссааддсСд | ссдсассдСЪ | Саасддсасс | 120 |
| аСдаСдсадС | аССССдааСд | дСасССдссд | даСдаСддса | сдССаСддас | сааадСддсс | 180 |
| ааЁдаадсса | асаасЁСаСс | садссССддс | аЁсассдсСС | СССддсСдсс | дсссдсЬСас | 240 |
| аааддааоаа | дссдсадсда | сд^здддСас | ддадСаСасд | асССдСаСда | ссСсддСдаа | 300 |
| ССсааСсааа | ааддддссде | ссдсасаааа | Сасддаасаа | аадсбсааСа | СсСЁоаадсс | 360 |
| аСЁсаадссд | сссасдссдс | СддааСдсаа | дсдсасдссд | асдссдбдсс | сдассаСааа | 420 |
| ддсддсдссд | асддсасдда | аСдддСддас | дссдСсдаад | СсааСссдСс | сдассдсаас | 480 |
| саадаааЁсС | сдддсассЁа | СсаааЪссаа | дсаСддасда | ааСССдаССС | Ссссдддсдд | 540 |
| ддсаасассС | асСссадсСС | Ьаадбддсдс | СддСассаСС | ССдаСддсдС | СдаССдддас | 600 |
| дааадссдаа | аассдадасд | сасссасааа | ССссдсддса | Ьсддсааадс | 9^999а^^99 | 660 |
| даадСадаса | сддаааасдд | ааасСаЁ:дас | СасССааСдС | аДдссдассЬ | ЪдаСаСддаЪ | 720 |
| саСсссдаад | СсдСдасСда | дсСдаааадс | СдддддаааС | ддСаСдСсаа | сасаасдаас | 780 |
| аССдаЁдддЪ | СссддсЁСда | СдссдСсаад | саСаССаадЪ | СсадСССССЬ | СссСдаССдд | 840 |
| ЁСдСсдЁаСд | едсдссссса | дасСддсаад | ссдсСаСССа | ссдССдддда | аСаССддадс | 900 |
| СаСаасаЁса | асаадССдса | сааССасасд | асдаааасаа | асддаасдае | дСсСССдССС | 960 |
| даСдссссдС | Сасасаасаа | аССССаСасс | дсССссаааС | садддддсас | асссдасасд | 1020 |
| СдсасдЁСаа | Сдассааьас | ДсЁсаСдааа | даСсаассаа | сассддссдЁ | сассССсдСЁ | 1080 |
| даЁааСсаСд | асассдаасс | сддссаадсд | сСдсадСсаС | дддСсдассс | аСддССсааа | 1140 |
| ссдССддсСс | ас дс с сё. с ас | СсСаасСсдд | саддааддаС | асссдСдсдС | сССССаСддС | 1200 |
| дасЪаЪЪаЪд | дсаССссаса | аСаРаасабД | сссхсдсСда | ааадсааааг | сдаСссдсео | 1260 |
| сСсаСсдсдс | дсадддабеа | сдсССасдда | асдсааса^д | аЁЪаЪс’ЬЁда | РсасЁссдас | 1320 |
| ассаЪсдддй | ддасааддда | ^ддддгсасс | дааааассад | даСссддасС | ддссдсаССд | 1380 |
| ассассдаед | ддссдддадд | аадсаааедд | аДдСасдССд | дсааасааса | сдссддаааа | 1440 |
| дСдСЪсЪасд | ассЬСассдд | саассддадЪ | дасассдСса | ссаЁсаасад | СдаСддаСдд | 1500 |
| ддддааСГса | аадГсааСдд | сддСбсддЬС | ссддссъддд | ЁСссЪадааа | аасдассдЁс | 1560 |
| ссеасеаосд | съеддесдаг | сасаасссда | ссдсддасРд | аРдааЪЁсдЁ | ссдЁЁддасс | 1620 |
| даассасддС | сддСддсаСд | дссССдаЬдс | седс | 1654 |
Claims (34)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированный путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированный с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов СеоЬасШик.
- 2. Микроорганизм по п.1, в котором промотор работает в условиях низкой аэрации или в анаэробных условиях.
- 3. Микроорганизм по п.2, в котором промотором является 1бй промотор.
- 4. Микроорганизм по п.3, в котором 1бй промотор является аутологичным.
- 5. Микроорганизм по п.3, в котором 1бй промотор является гетерологичным.
- 6. Микроорганизм по п.5, в котором 1бй промотор получен из СеоЬасШик 8!еаго!йегторЫ1и8.
- 7. Микроорганизм по п.1, в котором ген амилазы находится под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы или промотора амилазы.
- 8. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором произведена делеция гена лактатдегидрогеназы или его части.
- 9. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором микроорганизм не содержит инсерционного элемента в гене лактатдегидрогеназы.
- 10. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, где дальнейшая модификация инактивирует нативный ген пируват-формиат-лиазы.
- 11. Микроорганизм по п.10, в котором произведена делеция гена пируват-формиат-лиазы или его части.
- 12. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, также включающий модификацию, активирующую ген пируватдегидрогеназы.
- 13. Микроорганизм по п.12, в котором перед геном пируватдегидрогеназы вставлен промотор, работающий в анаэробных условиях.
- 14. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, также включающий модификацию, повышающую активность пируватдекарбоксилазы.
- 15. Микроорганизм по п.14, в котором модификация инактивирует нативный ген дигидролипоамидтрансацетилазы (ЕС 2.3.1.12).
- 16. Микроорганизм по п.15, в котором произведена делеция гена дигидролипоамид-трансацетилазы или его части.
- 17. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором ген амилазы получен из СеоЬасШик 8!еаго!йегторЫ1и8.
- 18. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором ген амилазы кодирует α-амилазу (ЕС 3.2.1.1).
- 19. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который относится к роду СеоЬасШик.
- 20. Микроорганизм по п.19, который представляет собой СеоЬасШик ФегтоДисомбамщ.
- 21. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который содержит гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы.
- 22. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы.
- 23. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который не содержит системы рестрикции.
- 24. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который является стабильным в культуральной среде, содержащей до 10% (вес./об.) этанола.
- 25. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который способен трансформироваться с высокой частотой.
- 26. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который растет при температуре 4085°С, предпочтительно 50-70°С.
- 27. Способ обеспечения повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, включающий культивирование микроорганизма по любому из предшествующих пунктов в культуральной среде, содержащей крахмал.
- 28. Способ по п.27, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 1% (вес./об.) крахмала.
- 29. Способ по п.27 или 28, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 10% (вес./об.) крахмала.
- 30. Способ по любому из пп.27-29, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 20% (вес./об.) крахмала.
- 31. Способ по любому из пп.27-30, который осуществляют при температуре 40-70°С.
- 32. Способ по п.31, в котором температура составляет 52-65°С.
- 33. Способ по любому из пп.27-32, в котором рН культуральной среды составляет 4,0-7,5.- 11 018814
- 34. Корм для животных, включающий микроорганизмы по любому из пп.1-26.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0715751.4A GB0715751D0 (en) | 2007-08-13 | 2007-08-13 | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
| PCT/GB2008/002782 WO2009022158A1 (en) | 2007-08-13 | 2008-08-12 | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201070259A1 EA201070259A1 (ru) | 2010-10-29 |
| EA018814B1 true EA018814B1 (ru) | 2013-10-30 |
Family
ID=38543482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201070259A EA018814B1 (ru) | 2007-08-13 | 2008-08-12 | Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья и способ обеспечения повышенной продукции этанола при его использовании |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8021865B2 (ru) |
| EP (2) | EP2185697A1 (ru) |
| JP (1) | JP2010536334A (ru) |
| KR (1) | KR20100061460A (ru) |
| CN (1) | CN101802178A (ru) |
| AU (1) | AU2008288285B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0814261A2 (ru) |
| CA (1) | CA2696277A1 (ru) |
| EA (1) | EA018814B1 (ru) |
| GB (2) | GB0715751D0 (ru) |
| MX (1) | MX2010001655A (ru) |
| NZ (1) | NZ583216A (ru) |
| WO (1) | WO2009022158A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201000969B (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006243052B2 (en) * | 2005-05-04 | 2010-07-08 | Tmo Renewables Limited | Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (LDH) for ethanol production |
| GB0511602D0 (en) | 2005-06-07 | 2005-07-13 | Tmo Biotec Ltd | Microorganisms |
| EA017548B1 (ru) | 2006-09-28 | 2013-01-30 | Тмо Реньюаблз Лимитед | Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, и способ получения этанола при его использовании |
| GB0715751D0 (en) | 2007-08-13 | 2007-09-19 | Tmo Renewables Ltd | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
| GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
| BR112012018694A2 (pt) | 2010-01-26 | 2015-09-15 | Scale Biofuel Aps | "métodos para a produção e a colheita de etanol e aparelho para a produção e a colheita do mesmo." |
| AU2012297228A1 (en) | 2011-05-18 | 2013-10-31 | Scale Biofuel, ApS | Solar-assisted volatile fermentation products production processes |
| WO2014033759A1 (en) * | 2012-08-30 | 2014-03-06 | Department Of Biotechnology Ministry Of Science & Technology | Modified bacteria for the production of bioalcohol |
| CN111154705B (zh) * | 2020-01-07 | 2021-06-29 | 中国科学院微生物研究所 | 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用 |
| BR112023003643A2 (pt) | 2020-08-28 | 2023-03-28 | Codexis Inc | Amilase recombinante, composição, sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma amilase recombinante e para tratar e/ou prevenir os sintomas de insuficiência pancreática, composição farmacêutica para o tratamento de insuficiência pancreática, e, uso |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0124076A2 (en) * | 1983-04-25 | 1984-11-07 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase |
| GB2171703A (en) * | 1985-01-18 | 1986-09-03 | Agency Ind Science Techn | Expression-secretion vector |
| EP0351717A2 (de) * | 1988-07-21 | 1990-01-24 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Plasmide zur Erzeugung von alpha-Amylase in Bacillus |
| US5238833A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-24 | Gist-Brocades, Nv | Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species |
| WO2006117536A1 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Tmo Renewables Limited | Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production |
| WO2006131734A1 (en) * | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Tmo Renewables Limited | Modified microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene |
| WO2008038019A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Tmo Renewables Limited | Thermophilic microorganisms for ethanol production |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1174191A (en) | 1980-03-05 | 1984-09-11 | Peter L. Rogers | Ethanol production |
| ES8608579A1 (es) * | 1983-07-06 | 1986-06-16 | Gist Brocades Nv | Procedimiento para introducir dna en un anfitrion de cepa de microorganismo unicelular |
| JPS61166400A (ja) * | 1985-01-18 | 1986-07-28 | Agency Of Ind Science & Technol | 蛋白生産の方法 |
| DK122686D0 (da) * | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| GB8712410D0 (en) | 1987-05-27 | 1987-07-01 | Elsworth Biotech Ltd | Thermophilic ethanol production |
| US5482846A (en) | 1988-08-31 | 1996-01-09 | University Of Florida | Ethanol production in Gram-positive microbes |
| JP2995770B2 (ja) * | 1989-12-15 | 1999-12-27 | 吉富製薬株式会社 | 異種蛋白質の製造方法 |
| CA2128862C (en) | 1992-02-11 | 2008-05-20 | Jonathan G. Seidman | Homogenotization of gene-targeting events |
| US5602004A (en) * | 1994-07-20 | 1997-02-11 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Thermophilic fungal expression system |
| EP0973882A1 (en) | 1997-04-07 | 2000-01-26 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | DEVELOPMENT OF HIGH-ETHANOL RESISTANT $i(ESCHERICHIA COLI) |
| EP0937774A1 (en) | 1998-02-20 | 1999-08-25 | Chr. Hansen A/S | Lactic acid bacteria having a reduced pyruvate dehydrogenase activity and use thereof |
| GB0000185D0 (en) | 2000-01-06 | 2000-03-01 | Agrol Limited | Ethanol production |
| US7374939B1 (en) | 2000-05-01 | 2008-05-20 | Midwest Research Institute | Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis |
| GB0011186D0 (en) | 2000-05-09 | 2000-06-28 | Agrol Limited | Modification of bacteria |
| CA2424890C (en) * | 2000-10-06 | 2014-06-03 | Elsworth Biotechnology Limited | Ethanol production in gram-positive bacteria with a stabilized mutation in lactate dehydrogenase |
| JP4192239B2 (ja) * | 2003-11-27 | 2008-12-10 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 出芽酵母アピラーゼの結晶および該結晶の製造方法 |
| JP2005261239A (ja) | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Japan Steel Works Ltd:The | 低級アルコールの製造法 |
| GB0520344D0 (en) | 2005-10-06 | 2005-11-16 | Tmo Biotec Ltd | Microoganisms |
| MY149506A (en) * | 2006-05-22 | 2013-09-13 | Biogasol Ipr Aps | Thermoanaerobacter mathranii strain bg1 |
| GB0715751D0 (en) * | 2007-08-13 | 2007-09-19 | Tmo Renewables Ltd | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
| GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
-
2007
- 2007-08-13 GB GBGB0715751.4A patent/GB0715751D0/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-08-12 NZ NZ583216A patent/NZ583216A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-08-12 KR KR1020107004804A patent/KR20100061460A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-08-12 JP JP2010520629A patent/JP2010536334A/ja active Pending
- 2008-08-12 US US12/673,399 patent/US8021865B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-12 CA CA2696277A patent/CA2696277A1/en not_active Abandoned
- 2008-08-12 BR BRPI0814261-0A2A patent/BRPI0814261A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-08-12 CN CN200880106938A patent/CN101802178A/zh active Pending
- 2008-08-12 EP EP08788350A patent/EP2185697A1/en not_active Withdrawn
- 2008-08-12 EA EA201070259A patent/EA018814B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-08-12 EP EP12190048A patent/EP2568039A1/en not_active Ceased
- 2008-08-12 AU AU2008288285A patent/AU2008288285B2/en not_active Ceased
- 2008-08-12 GB GB1002452A patent/GB2464248B/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-12 MX MX2010001655A patent/MX2010001655A/es active IP Right Grant
- 2008-08-12 WO PCT/GB2008/002782 patent/WO2009022158A1/en active Application Filing
-
2010
- 2010-02-10 ZA ZA201000969A patent/ZA201000969B/en unknown
-
2011
- 2011-07-26 US US13/191,056 patent/US8143038B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-01-25 US US13/357,788 patent/US8852906B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0124076A2 (en) * | 1983-04-25 | 1984-11-07 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase |
| US5238833A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-24 | Gist-Brocades, Nv | Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species |
| GB2171703A (en) * | 1985-01-18 | 1986-09-03 | Agency Ind Science Techn | Expression-secretion vector |
| EP0351717A2 (de) * | 1988-07-21 | 1990-01-24 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Plasmide zur Erzeugung von alpha-Amylase in Bacillus |
| WO2006117536A1 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Tmo Renewables Limited | Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production |
| WO2006131734A1 (en) * | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Tmo Renewables Limited | Modified microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene |
| WO2008038019A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Tmo Renewables Limited | Thermophilic microorganisms for ethanol production |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2185697A1 (en) | 2010-05-19 |
| US8852906B2 (en) | 2014-10-07 |
| GB201002452D0 (en) | 2010-03-31 |
| GB2464248A (en) | 2010-04-14 |
| ZA201000969B (en) | 2010-10-27 |
| EP2568039A1 (en) | 2013-03-13 |
| CN101802178A (zh) | 2010-08-11 |
| US20110318802A1 (en) | 2011-12-29 |
| EA201070259A1 (ru) | 2010-10-29 |
| WO2009022158A1 (en) | 2009-02-19 |
| US20130059355A1 (en) | 2013-03-07 |
| GB0715751D0 (en) | 2007-09-19 |
| CA2696277A1 (en) | 2009-02-19 |
| WO2009022158A8 (en) | 2009-07-16 |
| GB2464248B (en) | 2011-03-02 |
| MX2010001655A (es) | 2010-07-28 |
| US8143038B2 (en) | 2012-03-27 |
| KR20100061460A (ko) | 2010-06-07 |
| JP2010536334A (ja) | 2010-12-02 |
| NZ583216A (en) | 2011-12-22 |
| BRPI0814261A2 (pt) | 2014-10-21 |
| US20110201074A1 (en) | 2011-08-18 |
| AU2008288285A1 (en) | 2009-02-19 |
| US8021865B2 (en) | 2011-09-20 |
| AU2008288285B2 (en) | 2011-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA018814B1 (ru) | Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья и способ обеспечения повышенной продукции этанола при его использовании | |
| US9469858B2 (en) | Sporulation-deficient thermophilic microorganisms for the production of ethanol | |
| CN103649321B (zh) | 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法 | |
| CN105121637B (zh) | 酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径 | |
| CN102159702B (zh) | 生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法 | |
| KR101576186B1 (ko) | 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도 | |
| CA2681380A1 (en) | Enhancement of microbial ethanol production | |
| CN106574279A (zh) | 自糖质原料制造共聚合聚羟基链烷酸的方法 | |
| CN108064269A (zh) | 改善木糖利用的铁-硫簇蛋白中的突变 | |
| Wang et al. | Identification of archaeon-producing hyperthermophilic α-amylase and characterization of the α-amylase | |
| TWI500767B (zh) | 高產量之異丙醇生產細菌 | |
| JP2015502168A (ja) | 再構成された転写ユニットを有する細菌及びその使用 | |
| CN106795508A (zh) | 具有木糖异构酶活性的嵌合多肽 | |
| WO2022162428A1 (en) | Genetic stabilizer and growth selector for genetic transformation of the chloroplast genome of microalgae | |
| KR102312806B1 (ko) | 비피도박테리움 속 유래인 저항전분 분해 활성을 나타내는 아밀라아제들 및 이의 용도 | |
| TWI509072B (zh) | 生產異丙醇的大腸菌及生產異丙醇的方法 | |
| CN102994391A (zh) | 一种利用光能生产乙醇的微生物 | |
| KR101736485B1 (ko) | 포름산염으로부터 수소생산능이 증가된 써모코코스 돌연변이체 및 이를 이용한 수소생산방법 | |
| CN102994390A (zh) | 一种利用点突变进行构建的基因工程能源微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |