CN113527379B - 一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，该方法采用50％低浓度乙醇，进行闪提‑‑超声提取，过滤分离，得到大极性组分提取液，再用D101大孔吸附树脂反复吸附解吸3次，经水及不同浓度的乙醇洗脱，收集七叶皂苷流分，将第三次纯化的浓缩液放入器皿中，冷冻干燥后，白絮状物黏在器皿上，糖类等黄色物杂质黏在器皿底部，收集白絮状物，得到的七叶皂苷纯度到达96.5％以上。该方法简化了提取纯化步骤，节约了生产成本；操作简单、易于重复，适于实现标准工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，属于医药技术领域。
背景技术
娑罗子(Aesculi)是《中国药典》收载的传统中药之一，中药娑罗子系指七叶树(Aesculus chinensis Bge.)、浙江七叶树(A esculus chinensis var.chekiangensisFang)和天师栗(A escul us wilsoniiRehd.)等的干燥成熟种子，此3种药用植物为我国特产。娑罗子性温、味甘，归肝、胃经，具有理气宽中和胃止痛之功效，主治胸腹胀闷、胃肮疼痛。
七叶皂苷是娑罗子提出物中重要的有效成分，七叶皂苷在抗炎、抗渗出、消肿胀等方面作用显著，能恢复毛细血管的正常通透性，增加静脉张力，改善微循环，对脑外伤和外周血管疾病有很高的治疗价值。目前，从娑罗子中提取七叶皂苷的技术还有待改进。
目前国内外七叶皂昔的现有提纯方法主要有：
(1)刘东锋等“一种超声波一微波协同萃取七叶皂苷的方法”，该方法通过脱脂、超声波一微波同时萃取、硅胶柱层析、丙酮洗涤、干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法的较为复杂，提取物纯度较低，只有88％左右，同时需要用到用石油醚、正丁醇、丙酮等有毒溶剂。
(2)刘东锋等“一种从婆罗子中提取纯化七叶皂苷的方法“该方法通过脱脂、超声波萃取、膜分离、大孔树脂吸附、重结晶、干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法得到七叶皂苷的纯度95％左右，但方法较为复杂，需要用到微滤膜，成本高，同时需要用到用***、丙酮等有毒溶剂。
(3)路强强等“一种从婆罗子浸膏中提取纯化七叶皂苷的方法”该方法通过低分子醇溶解婆罗子浸膏，丙酮沉淀脱脂；纯水溶解后，大孔树脂吸附，乙醇洗脱；丙酮洗涤再脱色，真空干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法的较为复杂，提取物纯度较低，只有85％左右，同时需要用到丙酮等有毒溶剂。
(4)石召华等“一种基于冷冻干燥从婆罗子中超高压提取七叶皂苷的方法”该方法通过先将婆罗子药材经粉碎、浸泡后进行冷冻干燥，然后再进行超高压提取。本发明通过将要罗子进行冷冻干燥处理，从而改变药材组织的内部构造，使细胞壁更容易破裂，婆罗子的成分更容易渗出。虽然婆罗子中七叶皂苷可以得到充分的提取，但提取物成分太过复杂，需要用到超高压提取装置，反复的升压、泄压，提高了七叶皂苷的提取成本，加大了七叶皂苷的纯化的难度。
发明内容
本发明提供一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，全程无需使用丙酮、***等有毒溶剂，只用到乙醇和乙醇水溶液，改善了操作环境，避免了环境污染；条件温和，不会破坏皂苷的结构，通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附，显著提高了七叶皂苷得率和纯度。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，包括以下步骤：
1)闪提--超声提取：
1.1)闪提提取：将婆罗子粉碎至40-200目，在室温条件下，加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子8～12ml，然后室温下依次进行正转提取和反转提取，正转提取为5000～15000r/min的正转下提取8～13min，反转提取为在5000～15000r/min的反转下提取8～13min，再静沉8～12min，移出上清液，得第一沉淀物和第一清液；
1.2)超声提取：包括第一超声提取和第二超声提取，第一超声提取为：向第一沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子5～7ml，超声提取25～35min，静沉8～12min，移出上清液，得第二沉淀物和第二清液；第二超声提取为：再向第二沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子3～5ml，超声提取25～35min，静沉沉8～12min，移出上清液，得第三沉淀物和第三清液；采用抽滤方法，滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中，再将第三沉淀物用无水乙醇洗2-3次，合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液，得七叶皂苷提取液；
2)提取液浓缩：将七叶皂苷提取液，减压浓缩至发泡，得七叶皂苷浓缩液；
3)大孔吸附树脂第一次吸附：将七叶皂苷浓缩液，加入到婆罗子质量5～7倍的大孔吸附树脂柱中吸附，用积浓度为25％的乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，并将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第一次纯化的浓缩液；
4)大孔吸附树脂第二次吸附：将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第一次纯化的浓缩液上柱吸附，用25％乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第二次纯化的浓缩液；
5)大孔吸附树脂第三次吸附：将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将第二次纯化的浓缩液上柱吸附，用35％乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第三次纯化的浓缩液；
6)冷冻干燥除色：将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中，冷冻干燥后，白絮状物黏在烧杯壁上，黄色物杂质黏在烧杯底部，收集白絮状物为七叶皂苷。
上述方法采用50％低浓度乙醇水溶液，进行闪提--超声提取，过滤分离，得到大极性组分提取液，再用D101大孔吸附树脂反复吸附解吸3次，经水及不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集七叶皂苷流分，将第三次纯化的浓缩液放入器皿中，冷冻干燥后，白絮状物黏在器皿上，糖类等黄色物杂质黏在器皿底部，收集白絮状物，得到的七叶皂苷纯度到达96％以上，提取回收率在88.00％左右。该方法简化了提取纯化步骤，节约了生产成本；操作简单、易于重复，适于实现标准工业化生产。
本申请涉及的乙醇水溶液的浓度的均为乙醇的体积浓度。
上述整个过程，只用到乙醇，无需石油醚、丙酮、***等溶剂，改善了操作环境，确保了操作人员的健康安全；条件温和，不会破坏皂苷的结构，通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附，显著提高了七叶皂苷得率和纯度，提高了提取效率。
为了进一步提高七叶皂苷的得率，步骤1)中，正转提取为：依次在4500～5500r/min下提取4～6min、在9500～10500r/min下提取2～4min、在14500～15500r/min下提取2～3min；反转提取为：依次在4500～5500r/min下提取4～6min、在9500～10500r/min下提取2～4min、在14500～15500r/min下提取2～3min。
为了进一步避免对七叶皂苷的破坏，同时提高七叶皂苷的得率，步骤1.2)中，第一超声提取和第二超声提取的超声频率均为53KHz，第一超声提取温度为38-44℃，第二超声提取温度为41-45℃。
为了提高得率，同时减少物料浪费，步骤1.2)中，每次洗涤第三沉淀物的无水乙醇的用量为每克婆罗子0.8～1.2ml。
为了提高操作效率，同时兼顾产品纯度，步骤2)中，将七叶皂苷提取液减压浓缩至原体积的30％-40％，得七叶皂苷浓缩液。
为了进一步避免对七叶皂苷的破坏，，步骤2)中，减压浓缩的压力为0.05～0.09MPa，温度为65～75℃。
为了兼顾产品得率和纯度，步骤3)中，大孔树脂为D101大孔树脂，七叶皂苷浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h；步骤4)中，第一次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h；步骤5)中，第二次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h。
上述步骤3)-5)中，均浓缩至原体积的30％-40％。原体积中浓缩前的体积。
优选，步骤6)中，冷冻干燥温度为-35～-45℃，压力为10-20Pa。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，全程无需使用丙酮、***等有毒溶剂，只用到乙醇，改善了操作环境，避免了环境污染；条件温和，不会破坏皂苷的结构；采用大孔树脂三次吸附洗脱，低醇上柱，不同浓度的乙醇洗脱，显著提高了除杂效果，且树脂可再生，降低了生产成本；通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附和冷冻干燥纯化，显著提高了七叶皂苷得率(＞4％)和纯度(＞96.5％)；操作简单，成本低廉，利于工业化生产。
附图说明
图1为七叶皂苷HPLC的标准曲线图；
图2为不同乙醇浓度提取七叶皂苷的HPLC图；
图3为本发明所得七叶皂苷的色谱图；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
称200g娑罗子(浙江七叶树)粉碎至40-200目加到闪提-超声仪中，然后加入体积浓度为50％的乙醇水溶液2L，闪提提取(室温25℃)：正转提取：在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min；反转提取：在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min；静沉10min，移出上清液，得第一沉淀物和第一清液；
再向第一沉淀物中加入到体积浓度为50％的乙醇水溶液1.2L，超声提取30min(38-44℃，53KHz)，静沉10min，移出上清液，得第二沉淀物和第二清液；再向第二沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液0.8L超声提取30min(41-45℃)，静沉10min，移出上清液，得第三沉淀物和第三清液；采用抽滤方法，滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中，再将第三沉淀物用无水乙醇洗涤2次，每次洗涤无水乙醇用量为200ml，合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液，得七叶皂苷提取液；从图2可看出，50％的乙醇浓度为最佳的。
减压浓缩(负压0.07Mpa，温度70℃)七叶皂苷提取液，浓缩至原体积的34％发泡，提取率24.759％(HPLC分析)；
大孔吸附树脂吸附：第一次吸附：将浓缩液，加入2400g D101大孔吸附树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用25％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，并将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第一次纯化的浓缩液；第二次吸附：将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第一次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用25％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，并将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第二次纯化的浓缩液；第三次吸附：将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第二次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用35％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，并将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第三次纯化的浓缩液；冷冻干燥除色：将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中，-40℃、15Pa下冷冻干燥后，白絮状物黏在烧杯壁上，黄色物杂质黏在烧杯底部，收集白絮状物共8.2612g，色谱图如图3所示。HPLC分析，纯度为97.5％。
实施例2
称0.5Kg娑罗子(浙江七叶树)粉碎至40-200目加到闪提-超声仪中，然后加入50％乙醇5L，闪提提取(室温25℃)：正转提取：在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min；反转提取：在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min；静沉10min，移出上清液，得第一沉淀物和第一清液；
再向第一沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液3L，超声提取30min(38-43℃，53KHz)，静沉10min，移出上清液，得第二沉淀物和第二清液；再向第二沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液2L超声提取30min(40-43℃，53KHz)，静沉10min，移出上清液，得第三沉淀物和第三清液；采用抽滤方法，滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中，再将第三沉淀物用无水乙醇洗涤2次，每次洗涤无水乙醇用量为500ml，合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液，得七叶皂苷提取液；
减压浓缩(负压0.07Mpa，温度70℃)七叶皂苷提取液，浓缩至原体积的36％发泡，提取率24.454％(HPLC分析)；
大孔吸附树脂吸附：第一次吸附：将浓缩液，加入到5000g D101大孔吸附树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用25％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第一次纯化的浓缩液；第二次吸附：将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第一次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用25％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第二次纯化的浓缩液；第三次吸附：将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第二次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h，吸附时流速为1.5mL/min，用35％乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，无水乙醇用量为4倍柱体积，流速为9BV/h，将无水乙醇洗脱液浓缩，即得第三次纯化的浓缩液；将第三次洗脱液浓缩至2080mL，放入烧杯中，-40℃、15Pa下冷冻干燥，收集白絮状物共20.4917g，取出少部分样品用HPLC分析，纯度为96.5％。
Claims (9)
1.一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：包括以下步骤:
1)闪提--超声提取：
1.1)闪提提取：将婆罗子粉碎至40-200目，在室温条件下，加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子8～12ml，然后室温下依次进行正转提取和反转提取，正转提取为5000～15000r/min的正转下提取8～13min，反转提取为在5000～15000r/min的反转下提取8～13min，再静沉8～12min，移出上清液，得第一沉淀物和第一清液；
1.2)超声提取：包括第一超声提取和第二超声提取，第一超声提取为：向第一沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子5～7ml，超声提取25～35min，静沉8～12min，移出上清液，得第二沉淀物和第二清液；第二超声提取为：再向第二沉淀物中加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的用量为每克婆罗子3～5ml，超声提取25～35min，静沉沉8～12min，移出上清液，得第三沉淀物和第三清液；采用抽滤方法，滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中，再将第三沉淀物用无水乙醇洗2-3次，合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液，得七叶皂苷提取液；
2)提取液浓缩：将七叶皂苷提取液，减压浓缩至发泡，得七叶皂苷浓缩液；
3)大孔吸附树脂第一次吸附：将七叶皂苷浓缩液，加入到婆罗子质量5～7倍的大孔吸附树脂柱中吸附，用积浓度为25％的乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，并将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第一次纯化的浓缩液；
4)大孔吸附树脂第二次吸附：将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将上述第一次纯化的浓缩液上柱吸附，用25％乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第二次纯化的浓缩液；
5)大孔吸附树脂第三次吸附：将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味，将第二次纯化的浓缩液上柱吸附，用35％乙醇水溶液洗脱至近无色，弃去，再用无水乙醇冲洗柱子，将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡，即得第三次纯化的浓缩液；
6)冷冻干燥除色：将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中，冷冻干燥后，白絮状物黏在烧杯壁上，黄色物杂质黏在烧杯底部，收集白絮状物为七叶皂苷。
2.如权利要求1所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤1)中，正转提取为：依次在4500～5500r/min下提取4～6min、在9500～10500r/min下提取2～4min、在14500～15500r/min下提取2～3min；反转提取为：依次在4500～5500r/min下提取4～6min、在9500～10500r/min下提取2～4min、在14500～15500r/min下提取2～3min。
3.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤1.2)中，第一超声提取和第二超声提取的超声频率均为53KHz，第一超声提取温度为38-44℃，第二超声提取温度为41-45℃。
4.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤1.2)中，每次洗涤第三沉淀物的无水乙醇的用量为每克婆罗子0.8～1.2ml。
5.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤2)中，将七叶皂苷提取液减压浓缩至原体积的30％-40％，得七叶皂苷浓缩液。
6.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤2)中，减压浓缩的压力为0.05～0.09MPa，温度为65～75℃。
7.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤3)中，大孔树脂为D101大孔树脂，七叶皂苷浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h；步骤4)中，第一次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h；步骤5)中，第二次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min，冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积，流速为8-10BV/h。
8.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤3)-5)中，浓缩至原体积的30％-40％。
9.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法，其特征在于：步骤6)中，冷冻干燥温度为-35～-45℃，压力为10-20Pa。
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| CN106554384A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-04-05 | 陕西省西安植物园 | 一种从娑罗子浸膏中纯化七叶皂苷的方法 |
| CN109096351A (zh) * | 2018-08-30 | 2018-12-28 | 佛山市欧若拉生物科技有限公司 | 一种娑罗子皂苷提取工艺 |
-
2021
- 2021-08-19 CN CN202110952983.9A patent/CN113527379B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (2)
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| 植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践;刘延泽;《中国天然药物》;20071101;第5卷(第6期);26-29页 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113527379A (zh) | 2021-10-22 |
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