CN113504377A - 双模态检测crp的试纸条、制备方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双模态检测CRP的试纸条、制备方法及检测方法，属于生物技术领域。该方法在硝酸纤维素膜上包被CRP单克隆抗体I和羊抗兔IgG分别作为检测线和质控线，以金纳米棒标记CRP单克隆抗体II，采用免疫层析技术和双抗体夹心法制备用于CRP双模态检测的免疫层析试纸条。检测样品时，抗原与抗体结合，产生肉眼可见的检测线。由于金纳米棒具有独特的光学和光热性质，可以通过扫描灰度和光热成像获取检测的灰度和光热信号，实现对CRP的定量。本方法具有成本低，简单快速，样品消耗量少，无需专业人员的优点。利用该方法能检测到CRP的最低浓度为1ng/mL，标准曲线范围为50‑2000ng/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双模态检测CRP的试纸条、制备方法及检测方法。
背景技术
CRP是一种众所周知的急性期生物标志物，它常被用于诊断炎性、感染性疾病及心血管疾病等。通常，血液中CRP浓度不高于5μg mL-1，在炎症及细菌感染时，其含量迅速升高至大于50μg mL-1；但当浓度大于3μg mL-1时提示心血管疾病的危险性增加。因此，检测血液中CRP水平对临床疾病和疗效诊断具有很高的价值。目前，常规的CRP检查主要利用酶联免疫法，化学发光法和免疫比浊法。但这些方法需要昂贵的仪器，操作过程复杂，耗时且需要专业人员，不适用于即时检验。
胶体金免疫层析技术具有检测速度快，操作简便，成本低的优点，已被广泛用于食品，环境和临床诊断领域的即时检测。但常用的金纳米粒子通常获取比色信号实现定性或半定量分析。与之相比，金纳米棒具有较强的表面等离子体效应，和较高的光热转换效率，可使其同时被用作比色和光热探针，实现高灵敏的定量分析。但目前，使用基于金纳米棒的免疫层析技术用于CRP定量分析的研究还存在空缺。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有检测CRP方法价格昂贵、操作复杂、耗时长及难以实现定量的缺点，而提供一种双模态检测CRP的试纸条、制备方法及检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明首先提供一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，该方法包括：
步骤1：将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG分别与抗体稀释液混合，包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线；
步骤2：沿层析方向依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在底板上，制备初级试纸条；
步骤3：制备CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物，将其加于所述初级试纸条的结合垫上，得到双模态检测CRP的试纸条。
进一步的，所述步骤1中，所述CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG的浓度均为0.5～2mg mL-1。
进一步的，所述步骤1中，所述抗体的包被具体过程为：使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG喷涂于所述硝酸纤维素膜上，划线量为1μg mL-1，然后置于37℃真空烘箱中过夜，烘干。
进一步的，所述步骤1中，所述抗体稀释液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述步骤2中样品垫预先浸泡于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液中(pH＝8.0，含0.1％吐温20，0.5％PVP)，置于37℃真空烘箱中4h，烘干。
进一步的，所述步骤3中，所述CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的用量为2～6μL。
进一步的，所述CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的具体制备步骤为：
采用种子生长法合成金纳米棒，取1mL所述的金纳米棒溶液与100μL 1％的聚丙烯酸钠盐混合搅拌，8000rpm离心后分散于1mL 10mmol L-1的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol L-1的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol L-1的N-羟基琥珀酰亚胺，反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体Ⅱ，继续反应2h后，加入10μL 10mg mL-1的BSA封闭30min，离心得到抗体Ⅱ修饰的金纳米棒偶联物。将其分散于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液(pH＝8.0，含1％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)中。
进一步的，所述金纳米棒的合成步骤为：
1)制备种子溶液：将0℃的0.6mL 0.01mol L-1NaBH4溶液加入到包含5mL0.2mol L- 1CTAB和5mL 0.5mmol L-1HAuCl4的混合溶液中，室温下快速搅拌2min后，静置2h得到种子溶液。
2)合成金纳米棒：将50mL 0.2mol L-1CTAB溶液，50mL 1mmol L-1HAuCl4溶液，3mL4mmol L-1AgNO3溶液在室温下混合均匀后，加入0.7mL 0.1mol L-1的抗坏血酸。混合均匀后，加入0.24mL所述种子溶液，27～30℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液。
进一步的，本发明还提供上述制备方法得到的双模态检测CRP的试纸条。
本发明还提供基于上述试纸条检测CRP的含量的方法，包括：
将含有CRP的样品加于双模态检测CRP的试纸条上，作用10～20min后，采集灰度和温度信号，制作标准曲线获取待测样品中CRP的含量。
本发明双模态定量检测CRP抗原的检测原理为：
当将CRP样品滴加到样品垫上后，样品在毛细力的作用下向吸水垫方向侧流；流经结合垫时，CRP抗原与偶联物上抗体Ⅱ特异性结合；到达检测线时，抗体I通过与CRP抗原特异性结合捕获与CRP结合的金纳米棒偶联物，未与CRP抗原结合的偶联物到达质控线时被羊抗兔IgG捕获。由于金纳米棒的光学特性，捕获的金纳米棒形成两条肉眼可见的线，通过扫描获取该线上灰度值信号强度；另外，由于金纳米棒在650～670nm有很强的等离子体共振吸收峰，可将光能转换为热能，因此还能够通过650nm激光照射检测线和质控线一定时间后，利用热成像仪记录温度信号；分析获取的灰度和温度信号，可实现对CRP抗原的检测。
本发明的有益效果
本发明提供一种双模态检测CRP的试纸条、制备方法及检测方法，与现有方法相比，本发明利用金纳米棒标记可同时获取检测的比色和光热信号，具有操作简单、样品消耗量少、检测快速且成本低廉的特点，特别是利用热成仪直接读取温度可实现检测结果的快速判读；利用该方法能检测到CRP的最低浓度为1ng mL-1，标准曲线范围为50ng mL-1～2000ng mL-1。
附图说明
图1是本发明检测CRP的方法过程示意图；
图2是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的明场照片；
图3是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的扫描灰度信号图；
图4是本发明方法获取灰度信号得到的CRP检测标准曲线图；
图5是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的光热温度信号图；
图6是本发明方法获取温度信号得到的CRP检测标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合示意图对本发明的CRP抗原的双模态检测试纸条及方法进行更详细地描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
本发明采用的试材均为普通市售产品，皆可于市场购得。
具体的，本发明提出一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，该方法包括：
步骤1：将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG分别与抗体稀释液混合，包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线；
步骤2：沿层析方向依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在底板上，制备初级试纸条；
步骤3：制备CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物，将其加于所述初级试纸条的结合垫上，得到双模态检测CRP的试纸条。
按照本发明，所述的步骤1中抗体的包被具体过程如下：
将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG分别与抗体稀释液混合，使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG喷涂于所述硝酸纤维素素膜上，划线量为1μg mL-1，然后置于37℃真空烘箱中过夜，烘干。
所述的CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG的浓度均为0.5～2mg mL-1。所述抗体稀释液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液。
按照本发明，所述的步骤2中优选先将样品垫预先浸泡于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液中(pH＝8.0，含0.1％吐温20，0.5％PVP)，置于37℃真空烘箱中4h，烘干。沿层析方向，将处理好的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上对应区域，利用自动斩切机进行剪裁，得到宽度为3mm的初级试纸条。
按照本发明，步骤3中所述CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的具体制备步骤优选为：
采用种子生长法合成金纳米棒，取1mL所述的金纳米棒溶液与100μL 1％的聚丙烯酸钠盐混合搅拌，8000rpm离心后分散于1mL 10mmol L-1的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol L-1的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol L-1的N-羟基琥珀酰亚胺，反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体Ⅱ，继续反应2h后，加入10μL 10mg mL-1的BSA封闭30min，离心得到抗体Ⅱ修饰的金纳米棒偶联物。将其分散于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液(pH＝8.0，含1％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)中。
所述金纳米棒的合成步骤优选为：
1)制备种子溶液：将0℃的0.6mL 0.01mol L-1NaBH4溶液加入到包含5mL0.2mol L- 1CTAB和5mL 0.5mmol L-1HAuCl4的混合溶液中，室温下快速搅拌2min后，静置2h得到种子溶液。
2)合成金纳米棒：将50mL 0.2mol L-1CTAB溶液，50mL 1mmol L-1HAuCl4溶液，3mL4mmol L-1AgNO3溶液在室温下混合均匀后，加入0.7mL 0.1mol L-1的抗坏血酸。混合均匀后，加入0.24mL所述种子溶液，27～30℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液。
按照本发明，所述金纳米棒偶联物的用量优选为2～6μL。
本发明还提供上述制备方法得到的双模态检测CRP的试纸条。
本发明还提供基于上述试纸条检测CRP的含量的方法，包括：
将含有CRP的样品加于双模态检测CRP的试纸条上，作用10～20min后，采集灰度和温度信号，制作标准曲线获取待测样品中CRP的含量。
所述灰度信号的采集具体步骤为：将所述反应后的试纸条放入微阵列扫描仪中，通过扫描获取灰度信号。
所述的温度信号的采集具体步骤为：利用650nm激光照射所述反应后的试纸条45s，使用热成像仪采集温度信号。
以下结合具体实施例进行解释说明：
实施例1
将硝酸纤维素膜粘贴于底板上相应区域，将CRP单克隆抗体I和羊抗兔IgG分别与抗体稀释液混合，浓度均为1mg mL-1，所述抗体稀释液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)。使用HM3030三维划线仪将其喷涂于硝酸纤维素膜上合适位置，分别作为检测线和质控线，划线量设为1μg mL-1，然后置于37℃真空烘箱中过夜，烘干。
将样品垫预先浸泡于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液中(pH＝8.0，含0.1％吐温20，0.5％PVP)，后置于37℃真空烘箱中4h，烘干。将处理好的样品垫、结合垫和吸水垫粘贴于底板上对应区域，利用ZQ2002自动斩切机进行剪裁，得到宽度为3mm的初级试纸条。
将制备的CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物分散于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液(pH＝8.0，含1％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)中后，加于初级试纸条的结合垫上，得到CRP抗原双模态检测的试纸条。其中金纳米棒和CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物制备的具体步骤如下：
1)制备种子溶液：将0℃的0.6mL 0.01mol L-1NaBH4溶液加入到包含5mL0.2mol L- 1CTAB和5mL 0.5mmol L-1HAuCl4的混合溶液中，室温下快速搅拌2min后，静置2h得到种子溶液。
2)合成金纳米棒：将50mL 0.2mol L-1CTAB溶液，50mL 1mmol L-1HAuCl4溶液，3mL4mmol L-1AgNO3溶液在室温下混合均匀后，加入0.7mL 0.1mol L-1的抗坏血酸。混合均匀后，加入0.24mL所述种子溶液，27～30℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液。
3)取1mL上述合成的金纳米棒溶液与100μL 1％的聚丙烯酸钠盐混合搅拌，8000rpm离心后分散于1mL 10mmol L-1的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmolL-1的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol L-1的N-羟基琥珀酰亚胺，反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体Ⅱ，继续反应2h后，加入10μL 10mg mL-1的BSA封闭30min，离心得到抗体Ⅱ修饰的金纳米棒偶联物。
将CRP的样品溶液加到制备的试纸条的样品垫上，作用10～20min，得到完成CRP检测的试纸条。CRP样品溶液是由CRP反应液和CRP混合得到，CRP反应液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)，CRP浓度分别为1ng mL-1，10ng mL-1，50ng mL-1，100ng mL-1，200ng mL-1，500ng mL-1，1000ng mL-1，2000ng mL-1；
将完成CRP检测的试纸条放入Arrayit微阵列扫描仪中，扫描采集信号，得到CRP试纸条检测的灰度信号；
利用650nm激光照射完成CRP检测的试纸条45s，使用热成像仪采集温度信号，得到CRP试纸条检测的温度信号。
具体过程参照图1，图1为本发明所述的检测CRP的方法过程示意图，其中a为CRP抗原，b为CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒，c为CRP单克隆抗体II，d为CRP单克隆抗体I，e为羊抗兔IgG。将CRP样品溶液滴加到样品垫上后，样品在毛细力的作用下向吸水垫方向侧流；流经结合垫时，CRP抗原与偶联物上抗体Ⅱ特异性结合；到达检测线(T线)时，抗体I通过与CRP抗原特异性结合捕获与CRP结合的金纳米棒偶联物，未与CRP抗原结合的偶联物到达质控线(C线)时被羊抗兔IgG捕获。由于金纳米棒的光学特性，捕获的金纳米棒形成两条肉眼可见的线，通过扫描获取该线上灰度值信号强度；另外，由于金纳米棒在650～670nm有很强的等离子体共振吸收峰，可将光能转换为热能，因此还能够通过650nm激光照射检测线和质控线一定时间后，利用热成像仪记录温度信号；分析获取的灰度和温度信号，可实现双模态检测CRP抗原的目的。
按照以上实验步骤，得到的结果如图2～图6所示。
图2是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的明场照片，表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度肉眼可见的变化。
图3是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的扫描灰度信号图，图4是本发明方法获取灰度信号得到的CRP检测标准曲线图；分别表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度变化而变化的灰度信号图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为CRP浓度的对数值，纵坐标为CT/CC(T线灰度值/C线灰度值)。图5是本发明方法所获得的CRP检测试纸条随CRP浓度变化而变化的光热温度信号图，图6是本发明方法获取温度信号得到的CRP检测标准曲线图；分别表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度变化而变化的光热信号图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为CRP浓度的对数值，纵坐标为TT/TC(T线温度值/C线温度值)。试验中羊抗兔二抗IgG和CRP单克隆抗体I的浓度均为1mg mL-1，CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的用量为5μL。CRP浓度分别为1ng mL-1，10ng mL-1，50ng mL-1，100ng mL-1，200ng mL-1，500ng mL-1，1000ng mL-1，2000ng mL-1，利用这一方法所获得的CRP的检测范围为：50ng mL-1～2000ng mL-1
综上，在本发明实施例提供的双模态检测CRP抗原的试纸条及方法中，有益效果：本发明提供一种双模态检测CRP的方法，具有操作简单、样品消耗量少、检测快速且成本低廉的特点，特别是利用热成仪直接读取温度可实现检测结果的快速判读，能检测到CRP最低浓度为1ng mL-1，检测范围为50ng mL-1～2000ng mL-1。
上述仅为本发明的优选实例，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等行为，均属于未脱离本发明的技术方案内容，仍属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，该方法包括：
步骤1：将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG分别与抗体稀释液混合，包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线；
步骤2：沿层析方向依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在底板上，制备初级试纸条；
步骤3：制备CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物，将其加于所述初级试纸条的结合垫上，得到双模态检测CRP的试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG的浓度均为0.5～2mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述抗体的包被具体过程为：使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体I和羊抗兔二抗IgG喷涂于所述硝酸纤维素膜上，划线量为1μg mL-1，然后置于37℃真空烘箱中过夜，烘干。
4.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述抗体稀释液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤2中样品垫预先浸泡于0.02mol mL-1Tris-HCl溶液中，置于37℃真空烘箱中4h，烘干；所述的Tris-HCl溶液pH＝8.0，含0.1％吐温20，0.5％PVP。
6.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的用量为2～6μL。
7.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述CRP单克隆抗体II修饰的金纳米棒偶联物的具体制备步骤为：
采用种子生长法合成金纳米棒，取1mL所述的金纳米棒溶液与100μL 1％的聚丙烯酸钠盐混合搅拌，8000rpm离心后分散于1mL 10mmol L-1的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol L-1的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol L-1的N-羟基琥珀酰亚胺，反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体Ⅱ，继续反应2h后，加入10μL10mg mL-1的BSA封闭30min，离心得到抗体Ⅱ修饰的金纳米棒偶联物；将其分散于0.02molmL-1 Tris-HCl溶液中，所述的Tris-HCl溶液pH＝8.0，含1％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖。
8.根据权利要求1所述的一种双模态检测CRP的试纸条的制备方法，其特征在于，所述金纳米棒的合成步骤为：
1)制备种子溶液：将0℃的0.6mL 0.01mol L-1NaBH4溶液加入到包含5mL 0.2mol L- 1CTAB和5mL 0.5mmol L-1HAuCl4的混合溶液中，室温下快速搅拌2min后，静置2h得到种子溶液；
2)合成金纳米棒：将50mL 0.2mol L-1CTAB溶液，50mL 1mmol L-1HAuCl4溶液，3mL 4mmolL-1AgNO3溶液在室温下混合均匀后，加入0.7mL 0.1mol L-1的抗坏血酸。混合均匀后，加入0.24mL所述种子溶液，27～30℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液。
9.权利要求1所述的制备方法得到的双模态检测CRP的试纸条。
10.基于权利要求9所述的试纸条检测CRP的含量的方法，包括：
将含有CRP的样品加于双模态检测CRP的试纸条上，作用10～20min后，采集灰度和温度信号，制作标准曲线获取待测样品中CRP的含量。
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