CN113834934A - 免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种免疫层析试纸条及其制备方法。所述试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫和底板,所述NC膜上设有检测线和质控线,所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上;其中,结合垫上喷涂有示踪物标记的非生物素化抗体2;检测线包被有链霉亲和素与生物素化抗体1;质控线包被有羊抗鼠二抗;抗体1、抗体2分别结合抗原的不同表位。本发明利用生物素‑亲和素交联形成的网状结构,包被抗体(抗原)结合位点充分暴露,检测灵敏度大大提高;结构稳定,重复性好,试纸条稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域,具体地说,涉及一种免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
免疫层析技术出现于20世纪末,结合了免疫技术和色谱层析技术。最初以纳米金作为标记物,形成第一代胶体金技术,目前仍广泛应用于各个领域。经过科技的发展,各种标记物不断涌现,逐渐形成了第二代免疫荧光层析,第三代上转发光技术和量子点荧光技术和***的磁定量技术,逐渐从之前的定性检测,发展为现在的半定量或定量检测。免疫层析技术在即时检测(POCT)中应用极为广泛。
免疫层析由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸、聚氯乙烯底板(PVC底板)五部分组成。其中NC膜上有质控线和检测线(C线和T线),液体样本从样品垫加入,向吸水纸一侧流动,经过结合垫时,结合垫上的免疫标记物(胶体金,彩色微球,荧光微球等)被释放,在流动过程中与样本中的待测物发生免疫反应,这种复合物上的待测物再被固定在NC膜上T线处的结合物捕获聚集,免疫标记物本身可与NC膜上C线处的结合物捕获聚集,从而形成光学信号。其原理示意图见图1。
在免疫层析技术的实际应用中,常因检测灵敏度低导致漏检,这时需要在大批原料中筛选出最高灵敏度的抗体配对,但有时在现有原料基础上,仍不能达到理想的检测灵敏度,为此需要优化实验方案,以提高检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫层析试纸条及其制备方法。
本发明构思如下:常规包被方式是将包被抗体(抗原)直接划膜至NC膜检测线位置,包被抗体(抗原)之间相互独立,散乱分布于检测线,结合位点可能暴露不完全,导致结合效率低,灵敏度低。将包被抗体(抗原)生物素化后按一定比例与链霉亲和素预混划膜,其中每个链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成,每条肽链都能结合一个生物素化抗体,这样形成四聚体结构或网状结构,此结构如同支架作用将包被抗体(抗原)有序排列到一起,结合位点充分暴露,且抗体排列有序聚集,从而提高检测灵敏度。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种免疫层析试纸条,包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫和底板,所述NC膜上设有检测线和质控线,所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上。
其中,所述结合垫上喷涂有示踪物标记的非生物素化抗体2;所述检测线包被有链霉亲和素与生物素化抗体1;所述质控线包被有羊抗鼠二抗;抗体1、抗体2分别结合抗原的不同表位。
所述结合垫上包被的抗体2的终浓度为0.5-2mg/mL,出液量为2-5μL/cm,喷液速度为50mm/s。
所述NC膜的检测线上包被的链霉亲和素的终浓度为0.1-1mg/mL,生物素化抗体1的终浓度为1-2mg/mL;所述NC膜的质控线上包被的羊抗鼠二抗的终浓度为1-2mg/mL;划线出液量为1-1.2μL/cm,划线速度为50mm/s。
所述底板可以是PVC板。
所述样品垫的材料可以是玻璃纤维膜或聚酯纤维膜,其处理方法为:将样品垫浸泡在含0.5-5%海藻糖,0.5-2% BSA,0.05-0.2% PC-300的pH7.4的TBS溶液中,浸泡0.5-1h后取出,放入干燥箱中过夜烘干。
所述结合垫的材料可以是玻璃纤维膜或聚酯纤维膜,其处理方法为:将结合垫浸泡在含0.5-5%海藻糖,0.5-2% BSA,0.5-2%吐温20的pH7.4的PBS溶液中,浸泡0.5-1h后取出,放入干燥箱中过夜烘干。
所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次以2-3mm的间距交互层叠黏贴到所述底板上,所述试纸条宽度为2.5-5mm,长度为60-80mm,检测线与质控线之间间距为4-10mm。
优选地,所述抗原为新冠病毒核衣壳蛋白Nucleocapsid(GenBank: YP_009724397.2),抗体1、抗体2分别为抗新冠Nucleocapsid的抗体AM221和AM222(购自Acrobiosystems),抗体1生物素化后命名为ABLM221。
第二方面,本发明提供免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:
(1)NC膜的制备:将NC膜贴到PVC底板中间,将链霉亲和素与生物素化抗体1混合作为检测线,将羊抗鼠二抗作为质控线,所述检测线与质控线之间间距为4-10mm;用划膜仪将对应抗体划至NC膜上,在37℃干燥箱中烘4-6h;
(2)结合垫的制备:将示踪物标记的非生物素化抗体2喷涂到结合垫上,在37℃干燥箱中烘2-4h;
(3)试纸条的组装:将所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次搭接地粘贴在PVC底板上,裁切成合适大小,即得免疫层析试纸条。
进一步地,步骤(1)包括:用含0-0.5%海藻糖pH为7.4的PBS溶液将生物素化抗体1与链霉亲和素混合,生物素化抗体1的终浓度为1-2mg/mL,链霉亲和素的终浓度为0.1-1mg/mL,以此混合液作为检测线;将羊抗鼠二抗稀释至1-2mg/mL,作为质控线,然后按1-1.2μL/cm的速度划线包被于NC膜上。
进一步地,步骤(2)包括:
1)胶体金溶液的配制
分别配制1%氯金酸水溶液和10%柠檬酸三钠水溶液,用0.22μm滤器过滤;向1000mL超纯水中加入20g 1%氯金酸水溶液,在磁力搅拌器上加热至沸腾,迅速加入2.35mL 10%柠檬酸三钠水溶液,持续加热搅拌煮沸7-8分钟至溶液呈透明的***,停止加热,冷却至室温;
2)标记喷金
用0.1-0.2M K2CO3溶液将步骤1)配制的胶体金溶液调pH至抗体2的等电点附近,向1mL胶体金溶液中加入20-40μg抗体2,室温混匀20-30min,加入1% BSA封闭液封闭,室温混匀30min;然后4℃ 10000rpm离心20min,弃上清,加入复溶液复溶至30μL,然后按2-5μL/cm的喷量喷涂至结合垫上,干燥后即得结合垫。
进一步地,步骤(3)包括:将所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次以2-3mm的间距交互层叠黏贴到所述底板上,所述试纸条宽度为2.5-5mm,长度为60-80mm。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
利用生物素-亲和素交联形成的网状结构,包被抗体(抗原)结合位点充分暴露,检测灵敏度大大提高;结构稳定,重复性好,试纸条稳定性好。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中免疫层析试纸条检测原理与组成。
图2为本发明较佳实施例中两种试纸条检测抗原结果。
具体实施方式
本发明提供一种免疫层析试纸条(胶体金试纸条),包括PVC底板、样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸(吸水垫),按图1依次黏贴在PVC底板上。其中NC膜上有质控线与检测线,检测线包被按一定比例混合的链霉亲和素与生物素化抗体1,结合垫上喷涂有胶体金标记非生物素化抗体2,抗体1和抗体2分别结合抗原的不同表位。当待检样本中含有一定量的抗原时,经样品垫流经结合垫,与结合垫上的抗体2结合形成复合物,然后流经NC膜上的检测线时,进一步结合检测线上的抗体2,形成抗体1-抗原-金标抗体2夹心物,一段时间后,NC膜检测线上出现一条***线条;当检测样本中没有抗原时,结合垫上的抗体2无法与NC膜检测线上的抗体1形成夹心结构,此时检测线空白。
本发明生物素标记可以采用体内单点定点标记方式,也可以多点定点标记,也可以采用体外化学标记。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例所用抗原为新冠病毒核衣壳蛋白Nucleocapsid,抗体1、抗体2分别为抗新冠Nucleocapsid的抗体AM221与AM222,抗体1生物素化后命名为ABLM221。
实施例1 免疫层析试纸条的制备
1、实验材料及试剂的准备
(1)胶体金溶液的配制
分别配制1%氯金酸(HAuCl4)水溶液和10%柠檬酸三钠水溶液,0.22μm滤器过滤备用。准确量取1000mL超纯水,加入20g 1%氯金酸水溶液,加热磁力搅拌器上加热至沸腾,迅速加入2.35mL 10%柠檬酸三钠水溶液,持续加热搅拌煮沸7-8分钟至溶液呈透明的***,停止加热,冷却至室温。
(2)结合垫与样品垫预处理
将样品垫浸泡在含1%海藻糖,1% BSA,0.1% PC-300的pH7.4的TBS溶液中,将结合垫浸泡在含1%海藻糖,1% BSA,0.5%吐温20的pH7.4的PBS溶液中,半小时后取出沥干,置于37℃恒温鼓风干燥箱中,干燥24h,密封后置于低湿(相对湿度<20%)环境中。
2、试纸条的制作
将NC膜贴到PVC板中间位置。
(1)包被划膜:将羊抗鼠抗体稀释至1mg/mL,加入划膜仪1号泵中;将抗体ABLM221与链霉亲和素SA按摩尔比1:1混合,抗体ABLM221终浓度为1mg/mL,SA终浓度为0.36mg/mL,加入划膜仪3号泵中,划膜速度调为1μL/cm,在NC膜上分别包被质控线(C线)和检测线(T线)。将NC膜置于37℃恒温鼓风干燥箱中,烘干4h。另贴一张新的NC膜至PVC板,质控线与上述一致,将1mg/mL抗体AM221包被至检测线,作为对照。
(2)标记喷金:先用0.2M K2CO3溶液将胶体金溶液调至合适pH,1mL胶体金溶液加入20μg抗体AM222,室温充分混匀30min,加入1% BSA封闭液封闭,室温充分混匀30min。4℃10000rpm离心20min,弃上清,加复溶液(购自Acrobiosystems)复溶至30μL,用喷金仪按2μL/cm喷至结合垫上,按10mm×300mm裁剪,放37℃恒温鼓风干燥箱中,烘干2h。
(3)组装:将样品垫裁至25mm×300mm,吸水纸裁至27mm×300mm,按图1顺序组装后切条装卡。
实施例2 生物素抗体-亲和素不同组合方式对比
将抗体AM221、AM222生物素化后,分别命名为ABLM221、ABLM222。按表1组合,组装好试剂条后,检测高中低浓度及阴性抗原,用胶体金读数仪测定实验结果。胶体金读数结果见表2:
表1 生物素化抗体与亲和素不同组合方式
表2 生物素抗体与亲和素不同组合方式胶体金读数仪结果
从表2可以看出,与组合1(对照组)相比,组合7检测灵敏度提高最明显,其余方案无明显改善或灵敏度降低。组合2、组合6与组合1结果一致,说明将包被抗体与胶体金标记抗体生物化后不影响最终的灵敏度;组合3、组合5与组合1结果一致,说明胶体金标记的生物素化后抗体,加一个喷涂有Streptavidin(胶体金标记或未标记)的结合垫,此模式无法提高灵敏度;组合4与组合8较组合1灵敏度大大降低,这是由于间接法检测灵敏度较直接法低。
实施例3 SA与生物素化抗体混合比例的优化
保持生物素化抗体终浓度为1mg/mL,通过调整SA的量改变SA与生物素化抗体的预混比例,分别设置SA终浓度为45μg/mL、90μg/mL、180μg/mL、360μg/mL、720μg/mL、1440μg/mL、2880μg/mL,其他条件不变,分别制成试纸条,检测高中低浓度及阴性抗原。检测结果见表3:
表3 SA与生物素化抗体不同预混比例试纸条测抗原胶体金读数仪结果
从表3可以看出,一定范围内,随着SA浓度不断升高,检测灵敏度不断增强,当SA浓度为360μg/mL时,灵敏度比包被不加SA的普通试纸条高4倍以上,灵敏度最强,之后随SA浓度提高,灵敏度无明显增强。因此最终选择SA浓度为360μg/mL为最佳。
实施例4 试纸条检测限测试
将抗原用稀释液(1×PBS,pH7.4)从100ng/mL按二倍梯度稀释,分别检测普通试纸条(对照组)与优化后试纸条(实验组),采用人工判读与胶体金读数仪两种方式判定实验结果。人工判读如图2所示,胶体金读数仪结果见表4:
表4 两种试纸条测抗原胶体金读数仪结果
从图2可以看出,同一浓度的抗原,实验组T线颜色明显深于对照组,从表4可看出,对照组的检测检测限为1.56ng/mL,实验组检测限为0.39ng/mL,实验组灵敏度比对照组高4倍以上。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.免疫层析试纸条,其特征在于,包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫和底板,所述NC膜上设有检测线和质控线,所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上;
其中,所述结合垫上喷涂有示踪物标记的非生物素化抗体2;所述检测线包被有链霉亲和素与生物素化抗体1;所述质控线包被有羊抗鼠二抗;抗体1、抗体2分别结合抗原的不同表位。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述示踪物为胶体金、彩色微球或荧光微球。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述抗体1、抗体2分别为AM221和AM222。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述结合垫上喷涂的示踪物标记的抗体2的终浓度为0.5-2mg/mL,出液量为2-5μL/cm,喷液速度为50mm/s;和/或,
所述NC膜的检测线上包被的链霉亲和素的终浓度为0.1-1mg/mL,生物素化抗体1的终浓度为1-2mg/mL;所述NC膜的质控线上包被的羊抗鼠二抗的终浓度为1-2mg/mL;划线出液量为1-1.2μL/cm,划线速度为50mm/s。
5.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述底板为PVC板;和/或,
所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜,其处理方法为:将样品垫浸泡在含0.5-5%海藻糖,0.5-2% BSA,0.05-0.2% PC-300的pH7.4的TBS溶液中,浸泡0.5-1h后取出,放入干燥箱中过夜烘干;和/或,
所述结合垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜,其处理方法为:将结合垫浸泡在含0.5-5%海藻糖,0.5-2% BSA,0.5-2%吐温20的pH7.4的PBS溶液中,浸泡0.5-1h后取出,放入干燥箱中过夜烘干。
6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次以2-3mm的间距交互层叠黏贴到所述底板上,所述试纸条宽度为2.5-5mm,长度为60-80mm,检测线与质控线之间间距为4-10mm。
7.免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)NC膜的制备:将NC膜贴到PVC底板中间,将链霉亲和素与生物素化抗体1混合作为检测线,将羊抗鼠二抗作为质控线,所述检测线与质控线之间间距为4-10mm;用划膜仪将对应抗体划至NC膜上,在37℃干燥箱中烘4-6h;
(2)结合垫的制备:将示踪物标记的非生物素化抗体2喷涂到结合垫上,在37℃干燥箱中烘2-4h;
(3)试纸条的组装:将所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次搭接地粘贴在PVC底板上,裁切成合适大小,即得免疫层析试纸条。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(1)包括:用含0-0.5%海藻糖pH为7.4的PBS溶液将生物素化抗体1与链霉亲和素混合,生物素化抗体1的终浓度为1-2mg/mL,链霉亲和素的终浓度为0.1-1mg/mL,以该混合液作为检测线;将羊抗鼠二抗稀释至1-2mg/mL,作为质控线,然后按1-1.2μL/cm的速度划线包被于NC膜上。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(2)包括:
1)胶体金溶液的配制
分别配制1%氯金酸水溶液和10%柠檬酸三钠水溶液,用0.22μm滤器过滤;向1000mL超纯水中加入20g 1%氯金酸水溶液,在磁力搅拌器上加热至沸腾,迅速加入2.35mL 10%柠檬酸三钠水溶液,持续加热搅拌煮沸7-8分钟至溶液呈透明的***,停止加热,冷却至室温;
2)标记喷金
用0.1-0.2M K2CO3溶液将步骤1)配制的胶体金溶液调pH至抗体2的等电点,向1mL胶体金溶液中加入20-40μg抗体2,室温混匀20-30min,加入1% BSA封闭液封闭,室温混匀20-30min;然后4℃ 10000rpm离心20min,弃上清,加入复溶液复溶至30μL,然后按2-5μL/cm的喷量喷涂至结合垫上,干燥后即得结合垫。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)包括:将所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次以2-3mm的间距交互层叠黏贴到所述底板上,所述试纸条宽度为2.5-5mm,长度为60-80mm。
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