CN113495140A - 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法。一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，包括包被幽门螺旋杆菌抗原的包被板，含有酶标记鼠抗人的酶结合物，***反应液和幽门螺旋杆菌IgG校准品四个组分。本试剂盒基于酶免免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。***稀释液中通过加入变色剂，加样变色的设计更是提高了检测效率，降低操作错误率。酶结合物稀释液中使用酪蛋白和其它保护蛋白进行保护提高试剂有效期。

Description

一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其是涉及一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法。本发明还涉及在该方法中使用的一种防止样本漏加或错加的***反应液，因样本加样量极低，通过加样后***反应液的变色效果实现这一目的。
背景技术
幽门螺杆菌病是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，幽门螺杆菌(感染)在一类致癌物清单中，幽门螺杆菌病的不良预后是胃癌。幽门螺旋杆菌感染检测有许多方法，如活组织镜检、幽门螺旋杆菌的分离培养、快速尿素酶试验、尿素呼气试验、尿氨排出试验以及多聚酶链反应等。上述方法检测成本高，时间长。
被幽门螺旋杆菌感染后，人体免疫***会产生相对应的IgA、IgM、IgG抗体，通过外周血血清可以检测标志物是否存在，从而推断是否感染。血清学试验已成为检测幽门螺杆菌感染的首选方法，因为与更具侵入性的诊断测试相比，它更容易操作，检测时间短，检测成本低。血清学检测呈阳性表明存在幽门螺杆菌抗体，证实既有过去感染的可能，也有潜在的当前感染。市场上现有产品均为胶体金定性检测试剂，其灵敏度和特异性受检测平台限制。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，包括包被幽门螺旋杆菌抗原的包被板，含有酶标记鼠抗人的酶结合物，***反应液和幽门螺旋杆菌IgG校准品四个组分。
***反应液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂、显色剂、酶保护剂。
缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白为酪蛋白，防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种，显色剂为溴甲酚紫，酶保护剂为吐温20。
酶结合物中的酶结合物稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白包括至少两种蛋白，一种为酪蛋白，其它的为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
酶标记鼠抗人抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(4800—5200)的比例混合得到酶结合物。
HRP标记鼠抗人的酶结合物为酶HRP标记鼠抗人的酶结合物。
幽门螺旋杆菌IgG校准品的稀释液包括HEPES缓冲液、保护蛋白、制霉菌素、防腐剂；保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
幽门螺旋杆菌IgG校准品分别为包含0U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml、150U/ml浓度幽门螺旋杆菌IgG的的校准品。
所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒的使用方法，
包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl***反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
本试剂盒基于酶免免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。***稀释液中通过加入变色剂，加样变色的设计更是提高了检测效率，降低操作错误率。酶结合物稀释液中使用酪蛋白和其它保护蛋白进行保护提高试剂有效期。
作用原理如下：
以幽门螺旋杆菌结构区和非结构区的基因重组抗原及辣根过氧化物酶标记的抗人IgG为主要原料，应用间接酶联免疫法原理对血清或血浆样品中所含的幽门螺旋杆菌IgG抗体进行检测。用幽门螺旋杆菌抗原制备包被板，加入待测样本后样本中所含的幽门螺旋杆菌IgG抗体会与之结合，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG，通过免疫反应最终形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，该复合物催化发光底物显色，显色吸光度强度与幽门螺旋杆菌抗体含量成正比。
附图说明
图1是回归曲线图。
图2是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，包括包被幽门螺旋杆菌抗原的包被板，含有酶标记鼠抗人的酶结合物，***反应液和幽门螺旋杆菌IgG校准品四个组分。
***反应液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂、显色剂、酶保护剂。
缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白为酪蛋白，防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种，显色剂为溴甲酚紫，酶保护剂为吐温20。
酶结合物中的酶结合物稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白包括至少两种蛋白，一种为酪蛋白，其它的为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
酶标记鼠抗人抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(4800—5200)的比例混合得到酶结合物。
HRP标记鼠抗人的酶结合物为酶HRP标记鼠抗人的酶结合物。
幽门螺旋杆菌IgG校准品的稀释液包括HEPES缓冲液、保护蛋白、制霉菌素、防腐剂；保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
幽门螺旋杆菌IgG校准品分别为包含0U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml、150U/ml浓度幽门螺旋杆菌IgG的的校准品。
所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒的使用方法，
包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl***反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品，均为市场上普通所售产品。所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
制备幽门螺旋杆菌IgG定量检测试剂盒
1、制备包被板
①将幽门螺旋杆菌抗原(采购自杭州弘炬生物，型号为HP33)按照1ug/ml加入到0.05MPH7.4的PBS缓冲液中配制成包被液，在室温18-23℃下条件充分混匀。。
②将配制好的包被液按100μl/孔加入空白酶标板(采购自厦门云鹏生物)内，在冰箱2～8℃下放置16-24hr。
③甩去酶标板中的包被液，拍干后用洗液洗板2次。
④洗板后2分钟内封闭，按150μl/孔加入封闭液1％蛋白胨水，在冰箱2～8℃下放置16-24hr。
⑤将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干箱干燥(湿度≤30％)4～8hr。
制备完成。
2、本发明***反应液的配制
第一步配制tris-NaCl缓冲液，采用下表表1中的原料混合配制成tris-NaCl水溶液；
表1
品名 原料要求 含量
纯化水 分析纯 988ml
Tris 分析纯 3.03g
NaCl 分析纯 8.2g
然后使用6M的盐酸调整PH值为6.0，制备成tris-NaCl缓冲液。
第二步配制***反应液
采用下表表2中的原料混合配制成***反应液。
表2
品名 原料要求 含量
tris-NaCl缓冲液 988ml
酪蛋白 分析纯 10.00g
吐温20 分析纯 1.04g
溴甲酚紫 分析纯 0.020g
Proclin300 分析纯 1ml
3、本发明酶结合物的配制第一步配制tris-NaCl缓冲液
第一步配制tris-NaCl缓冲液，采用下表表3中的原料混合配制成tris-NaCl水溶液；
表3
品名 原料要求 含量
纯化水 分析纯 988ml
Tris 分析纯 6.06g
NaCl 分析纯 8.2g
然后使用6M的盐酸调整PH值为7.4，制备成tris-NaCl缓冲液。
第二步配制酶稀释液
每升酶结合物稀释液采用下表表4中的原料混合配制成。
表4
Figure BDA0002419946010000041
Figure BDA0002419946010000051
制得的酶结合物稀释液与HRP标记的鼠抗人抗体(采购自杭州博岳生物，型号为M1006)按5000：1体积比进行混合制得酶结合物。
4、本发明校准品的配制
第一步配制HEPES缓冲液，采用下表表5中的原料混合配制成HEPES溶液；
表5
品名 含量 原料要求
纯化水 993ml 分析纯
HEPES 6.5g 分析纯
Nacl 8.0g 分析纯
然后使用1M的氢氧化钠调整HEPES溶液PH值为7.2，制备成HEPES缓冲液；
第二步配制校准品稀释液，采用下表表6中的原料混合配制成校准品稀释液；
表6
品名 含量 原料要求
HEPES缓冲液 983ml
BSA 30g 分析纯
制霉菌素 0.05g
Proclin300 1ml 分析纯
将含有高值幽门螺旋杆菌IgG的样品(博岳生物H1045)用该稀释液进行稀释，分别配制成0U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml、150U/ml六个浓度的校准品。制霉菌素的厂家和型号分别为源叶生物-S17029。
4、其他通用试剂组分：底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
5、试验过程
(一)【主要组成成份】如下表表7
表7
Figure BDA0002419946010000052
Figure BDA0002419946010000061
(二)【检验方法】
实验前准备
1、将所有试剂及样本恢复至室温18～25℃至少30分钟。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度37℃。
3、每瓶洗涤液用1000ml纯化水稀释，摇匀后备用。
实验步骤
1、加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔。用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本，再加入酶结合物50μl。
2、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟。
3、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次(每次均需甩净液体)，最后在吸水纸上拍干。
4、显色：每包被孔加底物液100μl，室温18～23℃下避光反应20分钟。
5、终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
(三)结果计算
(1).酶标仪检测：选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2).计算：本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式，即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴)，以标准品OD值为纵坐标(Y轴)，建立点到点标准曲线，计算待测样本25羟基维生素的含量，大于20U/ml判定为阳性。计算示例数据如下表表8，建立的点到点标准曲线如曲线参考图1。
表8
品名 浓度(U/ml) OD值
标准品1 0 0.012
标准品2 10 0.237
标准品3 25 0.668
标准品4 50 1.253
标准品5 100 1.873
标准品6 150 2.893
6、本发明试剂盒的临床性能评价及发明优点
采用本发明试剂盒与roche公司生产的Monobind(Mb)公司生产的幽门螺旋杆菌IgG检测试剂盒通过酶联免疫法平行考核177份体检人群样本，浓度范围为0.5～140U/ml，检测结果进行临床相关性分析，检测结果如下表表9，根据表中数据制得相关性参考图如图2。
表9
Figure BDA0002419946010000071
Figure BDA0002419946010000081
根据图2相关性参考图可知，本发明制得的试剂盒与现有产品相关性良好，从而说明本发明提供的定量检测试剂盒补充了对幽门螺旋杆菌的检测方法，弥补了已上市现的有检测试剂盒检测的时效性和成本的缺陷，同时也保持了良好的检测效果。***稀释液中通过加入变色剂，加样变色的设计更是提高了检测效率，降低操作错误率。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：包括包被幽门螺旋杆菌抗原的包被板，含有酶标记鼠抗人的酶结合物，***反应液和幽门螺旋杆菌IgG校准品四个组分。
2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：***反应液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂、显色剂、酶保护剂。
3. 根据权利要求2所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白为酪蛋白，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种，显色剂为溴甲酚紫，酶保护剂为吐温20。
4. 根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：酶结合物中的酶结合物稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白包括至少两种蛋白，一种为酪蛋白，其它的为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：酶标记鼠抗人抗体与酶结合物稀释液按体积比1:（4800—5200）的比例混合得到酶结合物。
6.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：HRP标记鼠抗人的酶结合物为酶HRP标记鼠抗人的酶结合物。
7. 根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：幽门螺旋杆菌IgG校准品的稀释液包括HEPES缓冲液、保护蛋白、制霉菌素、防腐剂；保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒，其特征在于：幽门螺旋杆菌IgG校准品分别为包含0U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml、150U/ml浓度幽门螺旋杆菌IgG的的校准品。
9.根据权利要求1-8任一权利要求所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒的使用方法，其特征在于：
包括以下步骤，
（1）加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50µl校准品及待测样本，然后分别加入50µl***反应液，再加入酶结合物50µl；
（2）温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
（3）洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
（4）显色：每包被孔加底物液100µl，18-23℃下避光反应20分钟；
（5）终止：每包被孔加终止液50µl，终止反应。
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