CN111796089A - 一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法，属于试剂制备技术领域。该方法是在辐射能量下活化胶乳微球和缓冲溶液；充分混合胶乳微球与抗体；辐射条件下偶联胶乳微球与抗体；加入封闭液；去除未结合抗体及封闭蛋白，即得目标试剂。所述方法制备胶乳类体外诊断试剂方法简单、试剂稳定性好，偶联效率高，而且更适合批量化生产。

Description

一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂制备技术领域，具体涉及一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法。
背景技术
体外诊断试剂是在疾病的预防、诊断、治疗检测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程，用于对人体样本进行体外测试的试剂、试剂盒、校准品和质控品等。其中生化、免疫和分子诊断试剂为我国三大类诊断试剂品种。
免疫诊断试剂是通过抗原与抗体特异性结合的反应进行测定的试剂，一般分为免疫比浊法和胶乳增强免疫比浊法。胶乳增强免疫比浊法是在免疫比浊法基础上进行的改进，即在抗体或第二抗体的基础上偶联胶乳微球颗粒，使得其与相应抗原或抗体结合后，形成更强的浊度信号，因此对检测目标具有更高的灵敏度。胶乳免疫比浊法试剂稳定，降低了个体免疫复合物对结果的影响程度，因此结果更稳定、可靠，特异性好，精确度高，常规生化分析仪、分光光度计和散射比浊仪等均可使用。胶乳免疫比浊法中偶联胶乳微球的方法有物理吸附法和化学结合法，化学结合法形成的胶乳微球结合蛋白较物理吸附法稳定，一般通过胶乳微球表面的功能基团(如羧基、羟基、酰胺基)与免疫活性分子上的氨基(伯氨、仲氨)以共价键形式结合在一起，该方法形成的试剂稳定性和抗干扰能力均较好。化学结合法包被胶乳试剂过程中，常用EDC和NHS联合活化微球颗粒，搅拌条件下加入活化剂，活化一定时间后搅拌条件下加入抗体。此方法的缺点是：操作流程复杂，活化剂与抗体的加入具有一定的时间间隔，且必须依次进行并在搅拌条件下方可加入。此操作流程下活化效果与活化剂浓度、活化时间、活化温度等多种因素有关，偶联效果不易控制，偶联后的胶乳试剂容易发生自身聚沉反应，影响试剂稳定性。
辐射技术是利用高能电子射线或γ射线的辐射，使得大分子物质发生性能变化或激活高分子聚合物功能团进行均一交联的技术。低能量射线作用时可激活高分子官能团发生一系列的均匀的交联反应，例如辐射合成水凝胶技术。而高能量射线作用时可使蛋白质分子发生结构变化，最终失去原有活性，例如辐射灭菌技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法，该试剂的稳定性高。
本发明首先提供一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，该方法包括：
步骤一：将胶乳颗粒和缓冲液混合，得到胶乳颗粒溶液；
步骤二：将步骤一的胶乳颗粒溶液进行密封处理，用钴60射线或电子加速器射线进行辐射处理，得到辐射处理后的胶乳颗粒；
步骤三：将目标抗体加入到步骤二的处理后的胶乳颗粒中，搅拌至均匀，得到混合物；
步骤四：将步骤三的混合物用钴60射线或电子加速器射线进行第二次辐照处理，得到二次辐射处理后的混合物；
步骤五：在步骤四得到的二次辐射处理后的混合物中加入封闭液，搅拌至均匀，37℃摇床孵育20min，得到封闭后的胶乳微球抗体溶液；
步骤六：将步骤五得到的封闭后的胶乳微球抗体溶液倒入切向流过滤***的样品容器中，以储存液作为清洗液进行换液处理，得到试剂。
优选的是，所述的胶乳颗粒为JSR品牌P0001-P2118，粒径范围为50nm-200nm。
优选的是，所述的步骤一的缓冲液为pH在5-10之间，浓度为25-200mM/L的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种。
优选的是，所述的步骤二和步骤四中辐射能量范围是0.5KGY-50KGY，辐射时间为1-20min。
优选的是，所述的步骤三的目标抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的是，所述的步骤三的目标抗体为兔抗、羊抗、鼠抗。
优选的是，所述的步骤三的目标抗体和处理后的胶乳颗粒的质量比为1：1-20。
优选的是，所述的步骤五的封闭液为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶或脱水山梨醇脂肪酸脂。
优选的是，所述的步骤六的储存液为pH在5-10之间，浓度为10-100mM/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、MES缓冲液中的一种。
本发明还提供上述制备方法得到的试剂。
本发明的有益效果
本发明提供一种基于辐射技术制备的试剂及其制备方法，该方法是利用射线能量偶联的胶乳类试剂，抗体与胶乳颗粒的偶联效率显著增强，胶乳微球的表面带有功能基团(如羧基、羟基、酰胺基)，通过电子射线或γ射线的辐射，低能量射线使得胶乳微球这样的大分子物质发生性能变化，激活高分子聚合物功能团，使得与抗体结合的位点进行活化；当加入蛋白时采用高能量射线，使得蛋白质在射线的辐射下与微球上的结合位点进行稳定的交联，抗体与胶乳颗粒偶联的更稳定，从而提高试剂稳定性。
本发明利用辐射技术活化胶乳微球颗，辐射条件下直接促进抗体与胶乳颗粒的偶联效果，简化胶乳颗粒与抗体的偶联流程，同时提高胶乳微球颗粒与抗体的结合效率及稳定性。本发明提供的胶乳类试剂配制流程简单、影响试剂稳定性因素减少，适合批量化生产。
附图说明
图1为自配试剂开瓶30天测试质控品1偏差图；
图2为自配试剂开瓶30天测试质控品2偏差图；
图3为自配试剂37℃热处理7天测试质控品1偏差图；
图4为自配试剂37℃热处理7天测试质控品2偏差图。
具体实施方式
本发明首先提供一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，该方法包括：
步骤一：将胶乳颗粒和缓冲液混合，得到胶乳颗粒溶液；所述的胶乳颗粒优选为JSR品牌P0001-P2118，粒径范围为50nm-200nm，与抗体结合的功能基团为羧基；所述的缓冲液为pH在5-10之间，浓度为25-200mM/L的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种；
步骤二：将步骤一的胶乳颗粒溶液进行密封处理，用钴60射线或电子加速器射线进行辐射处理，所述的辐射能量范围优选是0.5KGY-50KGY，辐射时间优选为1-20min，得到辐射处理后的胶乳颗粒；
步骤三：将目标抗体加入到步骤二的处理后的胶乳颗粒中，搅拌至均匀，得到混合物；所述的目标抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，更优选为兔抗、羊抗、鼠抗；所述的目标抗体和处理后的胶乳颗粒的质量比优选为1：1-20，更优选为1：5；
步骤四：将步骤三的混合物用钴60射线或电子加速器射线进行第二次辐照处理，所述的辐射能量范围优选是0.5KGY-50KGY，辐射时间优选为1-20min，得到二次辐射处理后的混合物；
步骤五：在步骤四得到的二次辐射处理后的混合物中加入封闭液，搅拌至均匀，37℃摇床孵育20min，得到封闭后的胶乳微球抗体溶液；所述的封闭液优选为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶或脱水山梨醇脂肪酸脂；
步骤六：将步骤五得到的封闭后的胶乳微球抗体溶液倒入切向流过滤***的样品容器中，以储存液作为清洗液进行换液处理，得到试剂。所述的储存液优选为pH在5-10之间，浓度为10-100mM/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、MES缓冲液中的一种。
按照本发明，本发明的胶乳颗粒溶液中还可以加入稳定剂，所述的稳定剂优选为0.5％甘氨酸溶液或者0.5％的牛血清蛋白。所述的抗体与胶乳颗粒偶联过程可加入交联剂，所述的交联剂优选为MBA(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)的一种或多种。
本发明还提供上述制备方法得到的试剂。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
以配制全量程CRP(胶乳免疫比浊法)为例，试剂配制步骤如下：
R1配制：
物料加入顺序为4.35g/L的PIPES,10.64g/L的PIPES-2Na、9g/L氯化钠、10g/L的PEG6000、0.5g/L叠氮钠和0.5g/L的BAS搅拌溶解，即得到R1试剂；
R2配制：抗人CRP抗体胶乳颗粒溶液
①将粒径为120nm的聚苯乙烯胶乳微球(JSR品牌P0001-P2118)20mL，用pH6.5的50mM/LTristan缓冲液稀释至100mL并充分混匀，即得到胶乳微球溶液；
②活化：将胶乳微球溶液密封处理，经钴60射线5KGY辐射活化10min，得到活化的胶乳微球；
③偶联：将抗人CRP抗体20mg加入到活化的胶乳微球(100mg)溶液中，充分搅拌均匀，再将混匀后溶液经钴60射线10KGY辐射促进偶联10min，得到二次辐射处理后的混合物；
④封闭：量取牛血清白蛋白(BSA)，按照体积比BSA:偶联后溶液＝1：100将BSA加入到偶联后的胶乳微球抗体溶液中，充分混匀后37℃摇床孵育20min。。
⑤清洗换液：将封闭后的胶乳微球抗体溶液倒入切向流过滤***的样品容器中，以储存液作为清洗液进行换液处理，即得抗人CRP抗体胶乳颗粒溶液。
缓冲溶液配比如表1所示
表1
名称 Tristan缓冲液
成分 含量
Tristan 50mmol/L
BSA 0.8g/L
NaN3 1g/L
储存液配比如表2所示
表2
名称 储存液
成分 含量
Tristan 25mmol/L
NaN3 1g/L
BSA 1.0％
甘氨酸 0.5％
配制试剂在生化分析仪上的应用
测试试剂盒：实施例的试剂盒、
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：570nm；副波长：700nm测光点：16-33；样本量：4/140/40；校准方法：spline，校准品浓度(g/L)为0、9.38、18.75、37.5、75.00、150.00g，校准方法：Spline，以基蛋生物CRP检测试剂盒为对比试剂在相同条件下测试，校准结果如下表3、4所示：
表3(实施例)
Figure BDA0002574661230000061
表4(对比试剂)
Figure BDA0002574661230000062
准确性测定：取质控品1(靶值为2.35mg/L)和质控品2(6.50mg)进行准确性检测，计算实施例准确性，以测试结果相对靶值的偏差表示，结果详见表5、表6。
表5
Figure BDA0002574661230000071
表6
Figure BDA0002574661230000072
表5和表6结果显示，实施例试剂对质控品的测试结果相对靶值偏差4％以内，满足体外诊断试剂相关要求，说明实施例自配试剂的准确度较好。
精密度测定：实施例试剂与对比试剂测试同一血清样品，计算两组测试结果标准差(SD)及重复性(CV)，具体结果如表7所示。
表7
测试编号 实施例试剂 对比试剂
1 3.02 3.04
2 3.09 3.03
3 3.08 3.05
4 3.00 3.05
5 3.03 3.05
6 3.03 3.10
7 3.04 3.02
8 3.05 3.03
9 3.07 3.03
10 3.06 3.06
标准差 0.01291 0.01732
平均值 3.06 3.04
CV值 0.42％ 0.57％
表7结果显示，实施例试剂与对比试剂均具有较好的重复性，说明实施例中试剂具备良好的精确度。
线性测定：自配线性样品，最高点浓度为150mg/L,将最高点倍比稀释五个梯度，以纯化水为零点，进行测试，测试结果见表8.
表8
Figure BDA0002574661230000073
Figure BDA0002574661230000081
Figure BDA0002574661230000082
表8线性测试结果显示，实施例试剂与对照试剂均具有测试高值能力，且线性偏差±8％以内，说明在线性范围内，实施例试剂具有较高的准确度。
临床样品检测：取20例临床血清样本进行检测，实施例中试剂与对比试剂在相同条件下进行检测，检测结果如表9所示。
表9
血清编号 实施例试剂(mg/L) 对比试剂(mg/L) 偏差 血清相关性
1 3.16 3.21 -1.56％ 0.999887
2 1.22 1.20 1.67％
3 1.55 1.51 2.65％
4 0.76 0.79 -3.80％
5 1.57 1.66 -5.42％
6 1.02 1.03 -0.97％
7 10.38 10.42 -0.38％
8 3.13 3.14 -0.32％
9 1.45 1.47 -1.36％
10 1.45 1.52 -4.61％
11 10.41 10.64 -2.16％
12 12.06 12.61 -4.36％
13 3.32 3.37 -1.48％
14 3.13 3.17 -1.26％
15 11.12 11.64 -4.47％
16 12.70 12.85 -1.17％
17 47.09 47.28 -0.40％
18 8.89 9.35 -4.92％
19 6.34 6.53 -2.91％
20 3.06 3.18 -3.77％
表9结果显示，实施例自配试剂与对比试剂测试血清比较，测试结果相对偏差±6％以内，且相关性较好，测值一致，说明实施例中自配试剂测试临床样品结果准确、与现市售试剂一致。
开瓶稳定性检测：测试实施例1自配试剂开瓶(系列1)和自配试剂冷藏稳定性(系列2)，即开瓶30天内测试质控品的结果与靶值的吻合程度，每5天测试一次，稳定性用以相对偏差波动为参考，测试结果见图1-4。
图1、图2显示，自配试剂开瓶30天内，相对质控品1偏差±4％以内，相对质控品2偏差±3％以内，说明开瓶30天内该试剂性能稳定，满足测试需求。
热处理稳定性检测：测试实施例自配试剂37℃热处理7天(系列3)和自配试剂冷藏稳定性(系列4)，即37℃热处理7天内测试质控品的结果与靶值的吻合程度，每天测试一次，稳定性用以相对偏差波动为参考，测试结果见图1。
图3、图4显示，自配试剂37℃热处理7天内，相对质控品1偏差±4％以内，相对质控品2偏差±3％以内，说明37℃热处理7天内该试剂性能稳定，满足测试需求。

Claims (10)

1.一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：将胶乳颗粒和缓冲液混合，得到胶乳颗粒溶液；
步骤二：将步骤一的胶乳颗粒溶液进行密封处理，用钴60射线或电子加速器射线进行辐射处理，得到辐射处理后的胶乳颗粒；
步骤三：将目标抗体加入到步骤二的处理后的胶乳颗粒中，搅拌至均匀，得到混合物；
步骤四：将步骤三的混合物用钴60射线或电子加速器射线进行第二次辐照处理，得到二次辐射处理后的混合物；
步骤五：在步骤四得到的二次辐射处理后的混合物中加入封闭液，搅拌至均匀，37℃摇床孵育20min，得到封闭后的胶乳微球抗体溶液；
步骤六：将步骤五得到的封闭后的胶乳微球抗体溶液倒入切向流过滤***的样品容器中，以储存液作为清洗液进行换液处理，得到试剂。
2.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的胶乳颗粒为JSR品牌P0001-P2118，粒径范围为50nm-200nm。
3.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤一的缓冲液为pH在5-10之间，浓度为25-200mM/L的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤二和步骤四中辐射能量范围是0.5KGY-50KGY，辐射时间为1-20min。
5.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的目标抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的目标抗体为兔抗、羊抗、鼠抗。
7.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的目标抗体和处理后的胶乳颗粒的质量比为1：1-20。
8.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤五的封闭液为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶或脱水山梨醇脂肪酸脂。
9.根据权利要求1所述的一种基于辐射技术制备的试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤六的储存液为pH在5-10之间，浓度为10-100mM/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、MES缓冲液中的一种。
10.权利要求1-9任一项所述制备方法得到的试剂。
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