CN113493420A - Egfr酪氨酸激酶抑制剂及其用途 - Google Patents

Egfr酪氨酸激酶抑制剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及其用于制备预防或治疗EGFR突变引起的相关疾病药物的用途。

Description

EGFR酪氨酸激酶抑制剂及其用途
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂及其用途。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌和大细胞癌。与SCLC相比，NSCLC的癌细胞生长***较慢，扩散转移相对较晚。NSCLC约占所有肺癌的80％，预后不良，约75％的患者发现的时候已处于中晚期。而表皮生长因子受体(EGFR)的过度表达和突变已被明确证实将导致不可控的细胞生长，与大部分癌症疾病的进程有关，尤其是NSCLC(Oncotarget.2016Jul 5；7(27):41691-41702)。
EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，该家族由EGFR(Erb-Bl)、Erb-B2(HER-2/neu)、Erb-B3和Erb-B4组成。EGFR是一种糖蛋白，是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，位于细胞膜表面(Clin CancerRes；21(3)February 1,2015,526-533)。
在NSCLC病人中，EGFR不仅有过度表达，而且还在它的酪氨酸激酶结构区域有不依赖于配体结合的激酶活性异常激活突变。其中最常见的激酶活性突变是EGFR(Exon 19delE746-A750)和EGFR(Exon 21L858R)，第一代已经上市的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)已经被批准用于治疗这两种突变，但第一代EGFR-TKI在治疗过程中产生耐药性，耐药性的产生与EGFR 790号位的苏氨酸置换为蛋氨酸(T790M)发生的二次突变相关。第二代的非可逆共价抑制剂，如阿法替尼(Afatinib)对治疗EGFR(delE746-A750)和EGFR(L858R)效果更好，但对耐药性T790M突变体效果不佳，其原因是对野生型EGFR比抑制EGFR(delE746-A750/T790M)和EGFR(L858R/T790M)耐药性突变体活性更高，从而表现出了剂量依赖性毒性(Biologics,2014,8:183-192)，无法获得有效的治疗窗口。因此研究出第三代EGFR-TKI，比如AZD9291,CO-1686和HM61713。第三代EGFR-TKI是具有特异选择性的酪氨酸激酶抑制剂。相较于第一代和第二代EGFR-TKI，第三代的EGFR-TKI降低了对野生型的EGFR的抑制，减少临床上的毒副作用，可以使用更高的临床剂量获得较好的疗效。(J Clin Oncol 2014；32:abstr 8009；J Clin Oncol 2014；32:abstr 8010)。
另外一种异常激活进而诱导癌症发生的EGFR突变是外显子20***突变(EGFRexon20ins)，先前的研究表明这类突变占所有的EGFR突变肺癌的4％-10％(PLoS ONE 201510(7):e0133859)。目前在临床上仍然没有药物能用于治疗(Mol Cancer Ther.2013,12,220)，这类突变病人对现有上市的EGFR抑制剂药物都不敏感，目前标准治疗方案为细胞毒类化疗，预后效果差，副作用强，目前尚无靶向药物可用。靶向EGFR exon20***突变的候选药物Poziotinib和Ref-1已经进入临床研究，但它们对野生型EGFR抑制能力非常强，因此会带来较大的毒副作用，比如皮肤毒性等。严重限制了临床剂量的提高和临床药效。另外，还有最近刚刚进入临床的化合物CLN-081和DZ9008，虽然在体外活性上表明降低了对野生型的毒性，但它们的临床效果还没有进一步证实。综上，具有更高活性和低毒性的化合物仍有待开发。
发明内容
本发明公开了一类可作为EGFR蛋白激酶抑制剂的化合物以及其在制备预防或治疗EGFR相关疾病药物中的用途。
一方面，本发明提供式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002416713450000021
其中，Z1为-NH-、-N(CH3)-、-O-或-S-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N；
每个R1独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成五至六元饱和或不饱和的芳环或芳杂环；
每个R2独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
R3选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
R4选自氢、C1-C6烷基或-NR5R6；
R5和R6各自独立的选自氢、C1-C6烷基、-R7N(R8)(R9)；
R7、R8、R9各自独立的选自氢或C1-C6烷基；
m、n分别独立的选自1、2或3；
虚线为单键或双键。
在一些实施方案中，式(Ⅰ)是式(Ⅰa)：
Figure BDA0002416713450000031
Z1为-NH-、-N(CH3)-、-O-或-S-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N；
每个R1独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成五至六元饱和或不饱和的芳环或芳杂环；
每个R2独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
m、n分别独立的选自1、2或3；
虚线为单键或双键。
在另一些实施方案中，Z1为-NH-、-N(CH3)-或-O-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N，且Z3和Z4不同时为N；
每个R1独立的选自氢、C1-C3烷基或卤素；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成苯环；
每个R2独立的选自氢、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、卤素、氰基或甲氧基；
m、n分别独立的选自1或2；
虚线为单键或双键。
在另一些实施方案中，
Figure BDA0002416713450000041
选自：
Figure BDA0002416713450000042
在另一些实施方案中，
Figure BDA0002416713450000043
选自：
Figure BDA0002416713450000044
前述芳基即具有共轭π电子***的全碳单环或稠环多环芳族基团。芳基基团在一个或多个环中可具有6至10个碳原子。最常见的是，芳基基团在环中具有6个碳原子。例如，C6-10芳基是含有6至10个碳原子的芳族基团，例如苯基或萘基。
前述杂芳基，即在至少一个环中具有一个或多个杂原子环成员(成环原子)的单环或稠环多环芳族杂环基团，所述杂原子环成员彼此独立地选自O、S和N。杂芳基基团具有5至14个成环原子，包括1至13个碳原子和1至8个选自O、S和N的杂原子。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个成环原子，包括一至四个杂原子。杂芳基基团还可含有一至三个氧代或硫羰(即，＝S)基团。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至8个成环原子，包括一个、两个或三个杂原子。例如，5元杂芳基基团是如上定义的单环杂芳基基团，在单环杂芳基环中具有5个成环原子；6元杂芳基是如上定义的单环杂芳基基团，在单环杂芳基环中具有6个成环原子；5～10元杂芳基是如上定义的单环或双环杂芳基基团，在单环或双环杂芳基环中具有5、6、7、8、9或10个成环原子。
在另一些实施方案中，所述化合物选自如下化合物：
Figure BDA0002416713450000051
Figure BDA0002416713450000061
前述化合物可用于制备预防或治疗受体酪氨酸激酶突变，尤其是EGFR突变相关疾病药物；所述EGFR突变相关疾病为癌症，尤其是在EGFR的外显子20结构域中发生突变的相关癌症，如非小细胞肺癌，乳腺癌，脑癌，卵巢癌，胰腺癌，子宫癌，***，皮肤癌，***癌，膀胱癌，肝癌，胃肠组织癌，食道癌，甲状腺癌，白血病，淋巴瘤以及多发性骨髓瘤等。
本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、异构体；药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂可包含任何常规药物载体或赋形剂。合适的药物载体包括惰性稀释剂或填充剂、水以及各种有机溶剂诸如水合物和溶剂。如果需要，药物组合物可含有另外的成分，诸如调味剂、粘合剂、赋形剂等。
前述药物组合物还可包含其它一种或多种抗癌药物，所述抗癌药物为小分子药物，单克隆抗体，或融合蛋白药物。
本申请所提供的具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性的化合物，对EGFR(D770_N771insNPG)***突变激酶活性具有很强的抑制能力。对野生型EGFR高表达小鼠原B细胞(BaF3)增殖能力的抑制，大大低于目前处于临床研究阶段的Poziotinib和Ref-1，与此同时，能有效的抑制EGFR exon20***突变高表达的BaF3细胞增殖。相比于单一的突变EGFR高表达肿瘤细胞增殖抑制活性，突变细胞相对于野生细胞抑制活性的选择性是作为临床治疗窗口更为重要和关键的指标。因此和目前临床化合物相比，本申请所提供的化合物在临床应用中能够使用更高的剂量而不带来明显的毒性，大大提高疗效，获得更好的预后效果。并且对常见的EGFR突变，EGFR(delE746-A750)，Her2***突变高表达肿瘤细胞的异常增殖都有良好的抑制效果。
具体实施方式
实施例1 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000071
步骤一：
Figure BDA0002416713450000072
将化合物1.1(15.000g，54.57mmol，1eq.)溶于DMSO(100mL)中，加入化合物1.2(6.67g，60.03mmol，1.1eq.)，K2CO3(15.08g，109.14mmol，2eq.)，加热至80℃，反应15小时。将体系倒入水(200mL)中，静置30min，过滤，滤饼烘干，得褐色固体(7.350g，收率38.53％)。
步骤二：
Figure BDA0002416713450000081
将化合物1.3(2.500g，7.15mmol，1eq.)溶于二氧六环(100mL)中，加入化合物1.4(1.30g，8.58mmol，1.2eq.)，Pd(dppf)Cl2(523.35mg，715.25umol，0.1eq.)，K3PO4(1.52g，7.15mmol，1eq.)，H2O(10mL)，氮气置换三次，氮气保护，加热至60℃，反应1.5小时，将体系倒入水(150mL)中，EtOAC(300mL)萃取，分液，有机相用饱和NaCl水溶液洗一次，分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(正庚烷：EtOAC＝15:1)，得白色固体(2.100g，收率89.04％)。
步骤三：
Figure BDA0002416713450000082
将化合物1.5(2.100g，6.37mmol，1eq.)溶于二氧六环(100mL)中，加入化合物1.6(1.19g，6.37mmol，1eq.)，Pd2(dba)3(583.16mg，636.84umol，0.1eq.)，x-phos(607.18mg，1.27mmol，0.2eq.)，Cs2CO3(4.15g，12.74mmol，2eq.)，氮气置换三次，氮气保护，加热至100℃，反应4小时，体系冷却，过滤，滤液直接投下一步。
步骤四：
Figure BDA0002416713450000083
将上一步滤液，加入N,N,N'-三甲基乙二胺(3.25g，31.81mmol，5eq.)，加热至80℃，反应15小时，将体系倒入水(120mL)中，用EtOAC(250mL)萃取，分液，有机相用饱和NaCl水溶液洗一次，分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(DCM：MeOH＝30:1)，得红色油状物(2.940g，收率：82.29％)。
步骤五：
Figure BDA0002416713450000091
将化合物1.8(2.940g，5.23mmol，1eq.)溶于EtOH(80mL)中，加入Fe(1.46g，26.17mmol，5eq.)，NH4Cl(1.29g，26.17mmol，5eq.)，H2O(20mL)，加热至80℃，反应5小时。将体系过滤，用EtOAC(200mL)洗涤，滤液加入水(100mL)，分液，有机相用饱和NaCl水溶液洗一次，分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得褐色固体(2.140g，收率：76.89％)。
步骤六：
Figure BDA0002416713450000092
将化合物1.9(2.140g，4.03mmol，1eq.)溶于DCM(20mL)中，干冰乙醇浴降至-20℃，加入三乙胺(814.66mg，8.05mmol，2eq.)，化合物1.10(364.33mg，4.03mmol，1eq.)，反应10min，向体系加入水(20mL)，用DCM(100mL)萃取，分液，有机相用饱和NaCl水溶液洗一次，分液，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(DCM：MeOH＝30:1)，再用EtOAC打浆，得类白色固体(0.800g，33.93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.07(s,1H),8.53(s,1H),7.96-8.00(t,1H),7.90(m,2H),7.61(s,1H),7.41-7.44(d,2H),6.97-7.17(m,6H),6.36-6.43(dd,1H),6.17-6.22(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.79-3.81(d,6H),2.84-2.87(t,2H),2.70(s,3H),2.28-2.31(t,2H),2.20(s,6H)。LC-MS(m/z):587.00[M+H]+。
实施例2 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-(对甲苯基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000101
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为对甲苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.13(s,1H),8.60(s,1H),7.96(s,1H),7.86(s,1H)，7.84(s,1H),7.47-7.50(m,2H),7.42-7.45(d,2H),7.28-7.32(t,2H),6.94-6.98(m,3H),6.40-6.44(m,1H),6.18-6.22(dd,1H),5.73-5.76(dd,1H),3.80(s,3H),2.85-2.88(t,2H),2.71(s,3H),2.23-2.31(t,2H),2.18-2.22(m,9H)。LC-MS(m/z):569.69[M+H]+。
实施例3 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-((2-甲基嘧啶-5-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000102
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为2-甲基嘧啶-5-胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.08(brs,1H),8.84(s,2H),8.55(brs,1H),8.37(s,1H),8.12(s,1H),7.93(s,1H),7.50-7.54(m,2H),7.29-7.34(t,2H),6.97(s,1H),6.34(s,1H),6.14-6.18(d,1H),5.70-5.73(m,1H),3.79(s,3H),2.91-2.93(m,2H),2.71(s,3H),2.28-2.50(m,9H)。LC-MS(m/z):571.66[M+H]+。
实施例4 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-((5-甲基吡嗪-2-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000111
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为5-甲基吡嗪-2-胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.17(s,1H),9.24(s,1H),8.57(s,1H),8.41(s,1H),8.09(s,1H),8.03(s,1H),7.88(s,1H),7.51-7.54(m,2H),7.32-7.37(m,2H),7.02(s,1H),6.32-6.39(m,1H),6.13-6.17(dd,1H),5.70-5.72(dd,1H),3.80(s,3H),2.92(m,2H),2.74(m,3H),2.35(m,5H),2.24(m5H)。LC-MS(m/z):571.28[M+H]+。
实施例5 N-(5-((5-(3-氯-4-氟苯基)-4-(对甲苯基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000112
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为对甲苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(3-氯-4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.10(s,1H),8.57(s,1H),8.11(s,1H),7.88(s,1H),7.86(s,1H),7.63-7.66(dd,1H),7.41-7.51(m,4H),6.94-7.0(m,3H),6.38-6.44(m,1H),6.18-6.23(dd,1H),5.73-5.74(d,1H),3.80(s,3H),2.88(m,2H),2.71(s,3H),2.31(m,2H),2.19-2.22(m,9H)。LC-MS(m/z):603.25[M+H]+。
实施例6 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-(甲基(对甲苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000121
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为N，4-二甲基苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.07(s,1H),9.06(s,1H),7.86(s,1H),7.78(s,1H),7.01-7.03(m,3H),6.71-6.83(m,6H),6.35-6.41(dd,1H),6.18-6.23(dd,1H),5.70-5.73(dd,1H),3.89(s,3H),3.44(s,3H),2.87-2.88(m,2H),2.70(s,3H)，2.20-2.30(m,8H),2.08(s,3H)。LC-MS(m/z):583.77[M+H]+。
实施例7 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-(对甲苯氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000122
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为对甲酚，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.02(s,1H),8.41(s,1H),8.37(s,1H),8.16(s,1H),7.67-7.72(m,2H),7.10-7.15(m,4H),6.91(s,1H),6.39-6.43(dd,1H),6.22-6.27(dd,1H),5.75-5.78(dd,1H),3.76(s,3H),2.85(m,2H),2.67(s,3H),2.23-2.34(m,10H)。LC-MS(m/z):570.75[M+H]+。
实施例8 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-(萘-1-基氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000131
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为萘-1-醇，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.0(brs,1H),8.45(s,1H),8.28(brs,1H),8.09(s,1H),7.96-7.98(m,1H),7.77-7.85(m,4H),7.43-7.57(m,4H),7.30-7.35(m,2H),6.83(s,1H),6.40(m,1H),6.22-6.26(d,1H),5.76-5.79(d,1H),3.66(s,3H),2.82(m,2H),2.64(s,3H),2.23-2.34(m,8H)。LC-MS(m/z):606.71[M+H]+。
实施例9 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟苯基)-4-((2-氟苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000132
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.07(s,1H),8.50(s,1H),7.93(s,1H),7.78-7.88(m,3H),7.52-7.56(m,2H),7.31-7.36(t,2H),7.12-7.14(m,1H),6.95-7.05(m,3H),6.36-6.40(dd,1H),6.18-6.22(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.78(s,3H),2.83-2.86(t,3H),2.70(s,2H),2.27-2.30(t,2H),2.20(s,6H)。LC-MS(m/z):574.95[M+H]+。
实施例10 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-(4-氟苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000141
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为2-氟-5-甲基苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):9.92(brs,1H),8.45(brs,1H),8.11(s,1H),7.92(m,2H),7.50-7.58(m,3H),7.36-7.30(m,2H),7.0-7.04(m,1H),6.94(s,1H),6.85-6.86(m,1H),6.19-6.23(d,1H)5.73-5.76(d,1H),3.81(s,3H),2.93(m,2H),2.66(s,3H),2.18-2.37(m,9H)。LC-MS(m/z):589.04[M+H]+。
实施例11 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟-4-甲基苯基)氨基)-5-(4-氟苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000142
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为2-氟-4-甲基苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.04(s,1H),8.57(s,1H),7.91(s,1H),7.78(s,1H),7.65-7.70(t,3H),7.51-7.55(m,2H),7.31-7.36(m,2H),6.96-6.99(m,2H),6.37-6.43(m,1H),6.18-6.23(dd,1H),5.73-5.76(dd,1H),3.79(s,3H),2.86(m,2H),2.70(s,3H),2.10-2.40(m,11H)。LC-MS(m/z):589.01[M+H]+。
实施例12 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟-3-甲基苯基)氨基)-5-(4-氟苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000151
使用实施例1相似的方法，将步骤一的化合物1.2替换为2-氟-3-甲基苯胺，步骤二的化合物1.4替换为(4-氟苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.04(s,1H),8.52(s,1H),7.94(s,2H),7.76-7.80(m,1H),7.60(s,1H),7.52-7.57(m,2H),7.32-7.36(m,2H),6.97(s,1H),6.85-6.90(m,2H),6.36-6.42(dd,1H),6.17-6.21(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.79(s,3H),2.85-2.88(t,2H),2.70(s,3H),2.17-2.40(m,11H)。LC-MS(m/z):588.50[M+H]+。
实施例13 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000152
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-(三氟甲基)苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.05(s,1H),8.46(s,1H),8.10(s,1H),8.01(s,1H),7.89(s,1H),7.82-7.84(d,2H),7.73-7.75(d,2H),7.65-7.69(m,1H),7.00-7.16(m,3H),6.94(s,1H),6.36-6.43(dd,1H),6.18-6.23(dd,1H),5.73-5.76(dd,1H),3.78(s,3H),2.83-2.86(t,2H),2.69(s,3H),2.21-2.30(m,8H)。LC-MS(m/z):625.16[M+H]+。
实施例14 N-(5-((5-(4-氰基苯基)-4-((2-氟苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000161
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-氰基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.04(s,1H),8.46(s,1H),8.15(s,1H),8.02(s,1H),7.92-7.95(m,3H),7.73(d,2H),7.63-7.67(m,1H),7.0-7.16(m,3H),6.94(s,1H),6.37-6.43(dd,1H),6.19-6.23(dd,1H),5.73-5.76(dd,1H),3.78(s,3H),2.85(m,2H),2.68(s,3H),2.21-2.40(m,8H)。LC-MS(m/z):582.10[M+H]+。
实施例15 N-(5-((5-(4,4-二氟环己-1-烯-1-基)-4-((2-氟苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000162
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4,4-二氟环己-1-烯-1-基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.05(s,1H),8.49(s,1H),7.94(s,2H),7.71-7.85(m,2H),7.16-7.21(m.3H),6.93(s,1H),6.35-6.42(m,1H),6.17-6.22(m,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.78(s,3H),2.82-2.85(t,2H),2.68-2.71(m,5H),2.20-2.28(m,9H)。LC-MS(m/z):596.48[M+H]+。
实施例16 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(4-丙基苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000171
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-丙基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.05(s,1H),8.51(s,1H),7.93-7.98(m,3H),7.66(s,1H),7.41-7.43(d,2H),7.33-7.35(d,2H),7.11-7.16(m,1H),6.97-7.02(m,3H),6.37-6.43(dd,1H),6.18-6.22(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.79(s,3H),2.87(m,2H),2.70(s,3H),2.60-2.64(t,2H),2.22-2.31(m,8H),1.62-1.67(m,2H),0.92-0.96(t,3H)。LC-MS(m/z):599.27[M+H]+。
实施例17 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟-2-甲基苯基)-4-((2-氟苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000172
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-氟-2-甲基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.05(s,1H),8.52(s,1H),7.77(s,1H),7.72-7.75(m,2H),7.41(s,1H),7.29-7.32(m,1H),7.21-7.24(m,1H),7.0-7.17(m,4H),6.95(s,1H),6.36-6.43(dd,1H),6.18-6.22(dd,1H),5.73-5.76(dd,1H),3.80(s,3H),2.83-2.86(t,3H),2.69(s,3H),2.21-2.30(m,11H)。L C-MS(m/z):589.04[M+H]+。
实施例18 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-(4-氟-3-甲基苯基)-4-((2-氟苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000181
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(4-氟-3-甲基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.05(s,1H),8.52(s,1H),7.93(s,1H),7.86-7.93(m,2H),7.73(s,1H),7.41-7.43(m,1H)7.33-7.34(m,1H),7.24-7.28(t,1H),7.14(m,1H),7.0-7.04(m,2H),6.96(s,1H),6.36-6.38(m,1H),6.18-6.22(d,1H),5.72-5.75(d,1H)3.79(s,3H),2.84-2.87(t,2H),2.70(s,3H),2.28-2.30(m,5H),2.21(s,6H)。LC-MS(m/z):589.04[M+H]+。
实施例19 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(吡啶-4-基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000182
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为吡啶-4-基硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.03(s,1H),8.63-8.64(d,2H),8.45(s,1H),8.18(s,1H),8.06(s,1H),7.97(s,1H),7.67-7.70(t,1H),7.55-7.56(d,2H),7.01-7.17(m,3H),6.94(s,1H),6.37-6.43(dd,1H),6.19-6.23(d,1H),5.73-5.76(d,1H),3.78(s,3H),2.85(m,2H),2.69(s,3H),2.21-2.30(m,8H)。LC-MS(m/z):557.78[M+H]+。
实施例20 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(2-甲氧基苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000191
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(2-甲氧基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.06(s,1H),8.53(s,1H),8.05(m,1H),7.95(s,1H),7.90(s,1H),7.43-7.45(m,1H),7.30-7.32(m.2H),7.09-7.19(m,3H),6.96-6.99(m,3H),6.36-6.39(dd,1H),6.17-6.22(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.80-3.83(d,6H),2.85-2.88(m,2H),2.71(s,3H),2.29-2.31(m,2H),2.21(s,6H)。LC-MS(m/z):587.18[M+H]+。
实施例21 N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-氟苯基)氨基)-5-(3-甲氧基苯基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0002416713450000192
使用实施例1相似的方法，将步骤二的化合物1.4替换为(3-甲氧基苯基)硼酸，得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(ppm):10.06(s,1H),8.51(s,1H),7.96-8.0(m,3H),7.75(s,1H),7.41-7.45(m,1H),6.97-7.18(m,7H),6.46-6.43(dd,1H),6.17-6.22(dd,1H),5.72-5.75(dd,1H),3.80-3.85(d,6H),2.85-2,88(t,2H),2.70(s,3H),2.20-2.40(m,8H)。LC-MS(m/z):587.07[M+H]+。
实验例1 EGFR D770_N771insNPG激酶活性抑制测定
在杆状病毒表达***中表达的EGFR D770_N771insNPG激酶购自上海优宁维(univBiological Inc.)。含有生物素标记的多肽底物TK Substrate-biotin、Eu标记的特异性磷酸化多肽抗体TK Antibody-Cryptate，HTRF荧光受体试剂Streptavidin-XL665和5×激酶反应缓冲溶液、检测缓冲液Detection buffer的TK激酶HTRF检测试剂盒(#62TK0PEC)购自Cisbio Bioassays(Codolet,France)。二硫苏糖醇(DTT)、氯化镁、氯化锰、三磷酸腺苷(ATP)、二甲基亚砜(DMSO)和HEPES缓冲液以可获得的最高纯度水平从Sigma获得。
EGFR激酶活性抑制测定的一般方法：磷酸化反应缓冲液由1M HEPES(pH 7.0)、5mMMgCl2、1mM MnCl2组成，实验开始前在该缓冲液中即时加入1mM DTT。配置待测化合物DMSO存储母液，并根据实验所需，采用DMSO进行三倍浓度梯度稀释。所得梯度稀释溶液进一步采用磷酸化反应缓冲溶液进行稀释，获得待测化合物溶于含有5％DMSO的反应缓冲液的工作溶液。将2μL化合物工作溶液溶液和稀释于反应缓冲液的4μL EGFR激酶溶液添加到白色低体积384孔微量滴定板中，再加入溶于反应缓冲液中的4μL ATP和生物素标记的多肽底物的混合溶液，开始磷酸化反应。在WT EGFR实验中，WT激酶、多肽底物、ATP和DMSO的最终浓度分别为0.01ng/ul、500nM、4μM和1％，在EGFR D770_N771insNPG实验中，激酶、多肽底物、ATP和DMSO的最终浓度分别为0.01ng/ul、200nM、4μM和1％。避光条件下反应在室温下执行60分钟。分别加入稀释于检测缓冲液中的TK Antibody-Cryptate抗体和Streptavidin-XL665各5μL，室温孵育60分钟。WT EGFR激酶反应体系中Streptavidin-XL665终浓度为15.61nM，EGFR D770_N771insNPG激酶反应体系中Streptavidin-XL665终浓度为31.25nM，抗体按照供应商提供的最终浓度稀释。使用Tecan(
Figure BDA0002416713450000201
Figure BDA0002416713450000202
Switzerland)多功能酶标仪Spark进行读板，检测两组均相时间分辨荧光强度，其中激发波长为320nm，发射波长分别为665nm和620nm。使用Prism 7(La Jolla,15CA)对665nm/620nm荧光强度比值相对于抑制剂浓度进行做图，采用S形剂量依赖曲线模型对所得抑制曲线记性你和，获得抑制剂的IC50值。根据前述实施例制备的部分化合物的EGFRD770_N771insNPG激酶抑制活性IC50测定结果见表1。
表1
化合物 IC<sub>50</sub>(nM)
实施例1 0.85
实施例2 0.83
实施例9 2.00
实施例10 5.67
实施例11 4.93
实施例12 8.94
实验结果显示本申请所述化合物能有效的抑制EGFR D770_N771insNPG激酶活性，其中实施例1,2的IC50均小于1nM。
实验例2细胞增殖抑制实验
H358、HCC827、NCI-H1781、Calu-3细胞购自中国科学院细胞库(上海)，BaF3 EGFRWT、BaF3 EGFR D770_N771insSVD、BaF3 EGFR V769_D770insASV、BaF3 ERBB2A775_G776insYVMA细胞购自北京康源博创，MDA-MB-231、SK-BR-3、BT474购自南京科佰生物科技有限公司。MEM培养基、RPMI1640培养基、青霉素-链霉素双抗、0.5％的胰酶(10X)和表皮细胞生长因子EGF购自ThermoFisher(Waltham,MA,USA)。经认证的胎牛血清(FBS)购自Biological Industries(Israel)。康宁96和384孔细胞培养板购自CORNING(USA)。Cell-Titer
Figure BDA0002416713450000211
购自Promega Corporation(Madison,WI,USA)。
为了评估合成化合物对肺癌细胞H358、HCC827、NCI-H1781、Calu-3和BaF3EGFRWT、BaF3 EGFR D770_N771insSVD、BaF3 EGFR V769_D770insASV、BaF3 ERBB2 A775_G776insYVMA细胞增殖的抑制能力，将Calu-3指数增长的细胞接种于含10％牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的MEM培养基，H358、HCC827、NCI-H1781、BaF3 EGFR D770_N771insSVD、BaF3 EGFR V769_D770insASV、BaF3 ERBB2 A775_G776insYVMA指数增长的细胞接种于含10％牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基，BaF3 EGFR WT指数增长的细胞接种于含10％牛血清、1％青霉素-链霉素双抗和50ng/mL EGF的RPMI1640培养基，HCC827、NCI-H1781、Calu-3、BaF3 ERBB2 A775_G776insYVMA密度为75000个细胞/mL，H358密度为100000个细胞/mL，BaF3 EGFR D770_N771insSVD、BaF3 V769_D770insASV密度为50000个细胞/mL，BaF3 EGFR WT密度为125000个细胞/mL,384孔板，每孔20μL，并放置在37℃，5％CO2的培养箱中过夜。将化合物在DMSO中稀释至12个点、3倍梯度稀释液，从2mM开始。将化合物储备板的1μL DMSO溶液添加到99μL细胞培养基(测定中化合物的最终最高浓度为10μM，并且DMSO的最终浓度为0.5％)。将培养基中的20μL化合物溶液按照梯度加到384板的每个铺细胞的孔中。在加入化合物溶液后，将384孔板放置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3天。采用Promega(Madison,WI,USA)的CellTiter-Glo检测试剂盒，通过定量细胞培养中存在的ATP，测定细胞活力。20分钟的孵育后使用TECAN公司的SPARK多功能酶标仪在化学发光的程序下进行读数。在Prism 7(LaJolla,CA)中使用S形剂量反应模型(可变斜率，四个参数)确定化合物使细胞成活率抑制50％的浓度(IC50值)。
实验中所使用的药性对照物Poziotinib、Osimertinib、Pyrotinib均以市售方式获得，Ref-1根据WO2015195228A1记载的制备方法制得，结构如下：
Figure BDA0002416713450000221
根据前述实施例制备的部分化合物对于BaF3 EGFR WT、BaF3 EGFR D770_N771insSVD、BaF3 EGFR V769_D770insASV细胞增殖抑制的结果见表2。
表2
Figure BDA0002416713450000222
Figure BDA0002416713450000231
结果显示，本发明化合物对WT EGFR高表达BaF3细胞增殖抑制的活性均远低于目前两个处于临床研究阶段的候选药物，预示着由此带来的毒性将大大降低。对于WT EGFR和EGFR Exon20***中最为广泛的两种突变D770_N771insSVD和V769_D770insASV高表达的BaF3细胞增殖抑制活性之间相比较所得的选择性，目前两个临床化合物分别为0.18/0.33和0.25/0.18，表明临床疗效剂量远高于毒性剂量，因而临床应用会受到极大限制。而本发明大部分化合物的选择性明显高于临床化合物，比如其中实施例9和13，选择性分别为5.5/5.0和1.3/3.3，分别是Poziotininb和Ref-1的30/15，7.2/10和22/28,5.2/18倍，预示着临床治疗空间大大提高和药效更为明显。
根据前述实施例制备的部分化合物对于HCC 827、H358 WT细胞增殖抑制的结果见表3。
表3
Figure BDA0002416713450000232
Figure BDA0002416713450000241
结果显示本发明化合物对表达野生型EGFR的H358 NSCLC细胞增殖抑制要远低于Poziotinib，接近甚至低于临床安全性得到完全验证的第三代EGFR抑制剂Osimertinib。
根据前述实施例制备的部分化合物对于Calu-3、NCI-H1781及BaF3 ERBB2A775_G776insYVMA细胞增殖抑制的结果见表4。
表4
Figure BDA0002416713450000242
结果显示虽然实施例2对BaF3 ERBB2 A775_G776insYVMA和NCI-H1781细胞增殖的抑制要低于目前处于ERBB2 A775_G776insYVMA和ERBB2 G776_V777insV高表达非小细胞肺癌治疗临床研究阶段的Pyrotinib，但对WT ERBB2高表达Calu-3的增殖抑制要明显低于Pyrotinib，显示出更为优异的选择性和临床治疗空间。

Claims (13)

1.式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002416713440000011
其中，Z1为-NH-、-N(CH3)-、-O-或-S-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N；
每个R1独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成五至六元饱和或不饱和的芳环或芳杂环；
每个R2独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
R3选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
R4选自氢、C1-C6烷基或-NR5R6；
R5和R6各自独立的选自氢、C1-C6烷基、-R7N(R8)(R9)；
R7、R8、R9各自独立的选自氢或C1-C6烷基；
m、n分别独立的选自1、2或3；
虚线为单键或双键。
2.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中式(Ⅰ)是式(Ⅰa)：
Figure FDA0002416713440000012
Z1为-NH-、-N(CH3)-、-O-或-S-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N；
每个R1独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成五至六元饱和或不饱和的芳环或芳杂环；
每个R2独立的选自氢、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤素、羟基、硝基、氨基、氰基或烷氧基；
m、n分别独立的选自1、2或3；
虚线为单键或双键。
3.根据权利要求2所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中：
Z1为-NH-、-N(CH3)-或-O-；
Z2、Z3、Z4、Z5各自独立的选自C或N，且Z3和Z4不同时为N；
每个R1独立的选自氢、C1-C3烷基或卤素；两个相邻的R1可与他们相连的原子一起形成苯环；
每个R2独立的选自氢、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、卤素、氰基或甲氧基；
m、n分别独立的选自1或2；
虚线为单键或双键。
4.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002416713440000021
选自：
Figure FDA0002416713440000022
5.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002416713440000023
选自：
Figure FDA0002416713440000031
6.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自如下化合物：
Figure FDA0002416713440000032
Figure FDA0002416713440000041
7.权利要求1-6任一项所述的化合物用于制备预防或治疗受体酪氨酸激酶突变引起的相关疾病药物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述受体酪氨酸激酶突变为EGFR突变。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述EGFR突变引起的相关疾病为癌症。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌，乳腺癌，脑癌，卵巢癌，胰腺癌，子宫癌，***，皮肤癌，***癌，膀胱癌，肝癌，胃肠组织癌，食道癌，甲状腺癌，白血病，淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
11.根据权利要求7所述的用途，其中所述EGFR突变引起的相关疾病为在EGFR的外显子20结构域中发生突变引起的相关癌症。
12.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-6任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其还包含其它一种或多种抗癌药物，所述抗癌药物为小分子药物，单克隆抗体或融合蛋白药物。
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