CN113466375A - 一种植物多糖含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物多糖含量的测定方法，是将样品经除脂、去小分子化合物，然后用水回流提取、微波辅助消解后制备得到植物多糖水解液。水解液中单糖以离子交换色谱柱，氢氧化钠/醋酸钠溶液梯度洗脱，脉冲安培检测器检测，测定多糖水解产生的单糖组成及含量，以各单糖的加和含量为基准计算出样品中植物多糖的含量。本发明的植物多糖含量的测定方法能有效的缩短植物多糖水解的时间，再使用离子色谱法测定含量，为植物多糖检测提供更优的选择，同时为控制植物中的药用植物质量及进一步研究药用植物的生物活性提供技术支撑及基础数据。

Description

一种植物多糖含量的测定方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种植物多糖含量的测定方法。

背景技术

植物多糖是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，是植物体内十分重要的生物大分子，具有多种生物活性，如调节免疫力、调节血糖血脂、护肝、抗氧化、调节肠道微生物等。因此，准确测定植物多糖的含量及单糖组成对研究其化学结构及性质具有重要意义。

目前，关于植物多糖含量的测定方法主要有硫酸-苯酚法、PMP衍生法、离子色谱法等。经典的硫酸-苯酚法是通过多糖类成分在浓硫酸作用下水解，与苯酚缩合成有色化合物，然后利用分光光度法测其多糖含量。经过几年的应用和实施、检验，生产行业领域对经典的硫酸-苯酚法标准检测方法已发现存在如下的缺点：一是检测结果准确性差，准确性差主要是由于该方法专属性差、重现性差、干扰严重；二是检测方法操作繁琐、不能实现高通量检测、危险，因为该方法是显色反应，检测结果与显色时间有直接相关性，所以较难实现自动化、大批量的检测；三是该方法使用大量的浓硫酸和苯酚等高腐蚀、有毒试剂，对环境和实验人员均有较大负面影响。

PMP衍生法是先将多糖用硫酸或三氟乙酸水解，再通过PMP衍生，然后利用高效液相色谱技术测定多糖含量的方法，但该法存在以下不足：一是需要衍生，操作繁琐；二是PMP过量添加，不好去除，一般通过多次萃取的方法去除，但由于不同实验人员的操作习惯造成较大的误差，从而导致植物多糖含量测定结果不准确。

而离子色谱法具有较高的灵敏度且无需衍生前处理、操作简便，是目前比较认可的一种多糖含量测定方法。但用离子色谱法测定多糖含量的报道，大多都是采用常规的多糖水解方法，即采用硫酸或三氟乙酸在高温下水解一定时间后，再通过离子色谱测定单糖组成。而传统多糖水解时间较长，不利于离子色谱法测定植物多糖含量的普及。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物多糖含量的测定方法，从而克服现有技术中存在的上述的问题。

本发明所提供的植物多糖含量的测定方法，包括如下的步骤：

S1：将待检测的样品粉碎后用弱极性溶剂进行处理，处理后的样品再使用有机溶剂进行提取，最后再使用水提取样品中的多糖；

所述的弱极性溶剂，为***、石油醚或正己烷；

所述的有机溶剂为醇溶剂；

S2：将提取液进行过滤后，滤液进行微波消解，滤膜过滤后，滤液进行离子色谱分析；

所述的微波消解，其一种具体的步骤是将提取液加入3～7mol/L三氟乙酸后，80～120℃微波中消解20～60min；

所述的离子色谱分析，是采用脉冲安培检测器，Au工作电极，Pd参比电极；进样量：5～20μL；流速：0.2～1mL/min；流动相：氢氧化钠溶液和醋酸钠溶液；

其中氢氧化钠溶液浓度范围为1～200mmol/L，醋酸钠溶液浓度范围为1～200mmol/L；

S3：待检测的样品中各单糖的质量按式1)计算：

m_i＝c_i×V_i×D×10^-6…………………………………1)

m_i——待测样品中各单糖的质量，单位g；

c_i——由标准曲线计算所得样品中各单糖组分的质量浓度μg/mL；

V_i——样品的稀释体积mL；

D——稀释因子，即待测的样品溶液被稀释的倍数；

所述的单糖包括D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，D-甘露糖，L-***糖，L-鼠李糖，D-果糖，L-岩藻糖，D-核糖，D-脱氧核糖，D-山梨糖，D-赤藓糖，D-苏力糖，D-来苏糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸或D-甘露糖醛酸；

S4：待检测的样品中多糖的质量按式2)计算：

m_多——待测样品中多糖的质量，单位g；

m_i——待测样品中各单糖的质量，单位g；

Mi——待测样品中各单糖的摩尔质量，单位：克每摩尔(g/mol)；

S4：待检测的样品中多糖的含量百分比按式3)计算：

m_多——待测样品中多糖的质量，单位g；

m——待测样品的质量，单位g；液体为称取样品中干物质的重量；固体为称取样品重量减去水分含量。

本发明的植物多糖含量的测定方法能有效的缩短植物多糖水解的时间，再使用离子色谱法测定含量，为植物多糖检测提供更优的选择，同时为控制植物中的药用植物质量及进一步研究药用植物的生物活性提供技术支撑及基础数据。

附图说明

图1为实施例1的单糖混合标准溶液色谱图；

图2为实施例1的枸杞多糖溶液色谱图。

具体实施方式

本发明通过除脂、去小分子化合物，然后用水回流提取、微波辅助消解后制备得到植物多糖水解液；水解液中单糖以离子交换色谱柱，氢氧化钠/醋酸钠溶液梯度洗脱，脉冲安培检测器(Au为工作电极，Pd为参比电极)检测，测定多糖水解产生的单糖组成及含量，以各单糖的加和含量为基准计算出样品中植物多糖的含量。

以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。

实施例1：

1、枸杞多糖的提取

取干燥枸杞子，去除果蒂、叶子等杂质，粉碎，混匀备用。

准确称取样品粉末(0.5±0.05)g，加***100mL，加热回流1小时，静置，放冷，小心弃去***液，残渣置水浴上挥尽***。加入80％乙醇100mL，加热回流1小时，趁热滤过，滤渣与滤器用热80％乙醇30mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150mL，加热回流2小时。趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，旋转蒸发浓缩溶剂后，移至25mL容量瓶中，用少量热水洗涤旋蒸瓶，合并浓缩液与洗液，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。

2、枸杞多糖的微波消解

量取样品溶液5mL，置微波消解罐中，加入4mol/L三氟乙酸(TFA)5mL，于110℃微波中水解30min后，冷却至室温，氮吹完全除去三氟乙酸，加水定容至5mL，摇匀，0.22μm滤膜过滤，供离子色谱分析用。试样中各单糖的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行离子色谱分析。

3、单糖标准溶液的配制

准确称取经真空干燥至恒重的D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，D-甘露糖，L-***糖，L-鼠李糖，D-果糖，L-岩藻糖，D-核糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸对照品各约100mg，置于同一100mL容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，作为单糖标准溶液，供离子色谱分析。

4、离子色谱检测条件

按照制造商操作手册运行离子色谱仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性：

色谱条件如下：

色谱柱：Metrosep Carb 2-250/4.0色谱柱和Metrosep Carb 2Guard/4.0保护柱。

进样量：20μL

流速：0.6mL/min

流动相：以氢氧化钠和醋酸钠溶液梯度洗脱(A:1mmol/L氢氧化钠和1.5mmol/L醋酸钠混合溶液；B:100mmol/L氢氧化钠和150mmol/L醋酸钠混合溶液)

梯度洗脱程序见表1。

检测器：脉冲安培检测器，Au工作电极，Pd参比电极，检测器电位波形程序见表2。

表1：梯度洗脱程序表

时间/min	A	B
			0.00	100	0
30.0	100	0
			30.1	0	100
55.0	0	100
			55.1	100	0
75.0	100	0

表2：检测器电位波形程序表

时间/s	电位/V	积分
			0.00	+0.05	—
0.20	+0.05	开始
			0.30	+0.05	结束
0.35	+0.55	—
			0.55	-0.10	—

5、方法学考察

(1)精密度

配制各单糖浓度范围为0.5μg/mL的混合溶液，按离子色谱条件进行检测，具体实验结果如表3所示，实验相对标准误差在0.40％～2.81％之间，实验偏差较小，精密度符合要求。

表3精密度实验结果(n＝6)

(2)检出限和定量限

检出限是指一种分析方法在给定的可靠程度内可从样品中检测到待测物质的最小浓度或者最小量。检出限为物质引起检测器产生的响应信号是噪声值的三倍时，即信噪比为S/N＝3时的量。

定量限是指样品中被检测物能被定量检测到的最低量，其测定结果应具有一定的准确度。定量限表现的是某一分析方法是否具备敏捷的定额检测能力。检测器产生的响应信号为噪声值十倍，即信噪比S/N＝10时的量为定量限。

表4：各单糖的检出限和定量限表

(3)标准曲线

分别取单糖系列配制成0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μg/mL的混合标准溶液及待上机试样溶液，按照上述列出的条件进行离子色谱分析测定。由保留时间对各单糖进行定性，根据混标溶液中各单糖响应信号，建立标准工作曲线，工作曲线线性相关系数R²≥0.998，对试样的各单糖含量进行定量计算，通过加和求得试样中多糖的含量。

待测样液中各单糖的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析过程中，每20次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的混合标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过5％，则应重新进行标准曲线的制作。

表5：各单糖线性方程表

(4)稳定性

配制浓度为1.0μg/mL的各单糖混合溶液，按上述离子色谱条件进行检测，得到其峰面积，如此反复每隔1h进样1次，共进样5次，计算5次峰面积的相对标准偏差(即RSD值)，5次重复进样的相对标准偏差在0.97％～2.99％之间，测定稳定性良好。

(5)重复性

配制浓度为1.0μg/mL的各单糖混合溶液6份，按上述离子色谱条件进行检测，分别得到其峰面积，计算其RSD值，具体实验结果如表6所示，其RSD值在1.1％～3.6％之间，误差小于规定的4％，由此判断其重复性良好，实验方案可行，实验人员的操作相对规范。

表6：重复性实验结果表(n＝6)

实施例2：采用建立的方法测定枸杞中枸杞多糖含量

分别取微波辅助消解后的试样溶液20μL，注入离子色谱仪，按照上述离子色谱条件进行分析，记录峰面积。根据对照品的保留时间定性，外标法定量。测得3批枸杞实际样品中各单糖含量如表7所示：

表7枸杞实际样品中各单糖组分的质量浓度表(单位：μg/mL)

根据检测结果计算得3批枸杞样品中枸杞多糖含量分别为2.24％、2.28％和2.56％。

7、加标回收实验

同时也进行了加标回收率的测定，以检测该法对枸杞中不同含量的枸杞多糖的检测精度。以各单糖浓度一定的枸杞多糖提取液为本底进行加标，各单糖添加量分别为枸杞多糖提取液中各单糖浓度的0.5倍、1倍和1.5倍，按照6.8.2的色谱条件每个加标量检测6次，其具体结果如表8所示。其低浓度加标平均回收率在为86.25～109.62％之间、中浓度加标平均回收率在80.48～103.13％之间、高浓度加标平均回收率在82.96～108.06％之间，其回收率均满足要求。

表8：枸杞多糖提取液加标回收率实验结果表

本实施例中利用离子色谱测定枸杞中枸杞多糖的含量，无需衍生前处理、操作简便，且准确性高。避免了因衍生操作造成的较大误差、克服了衍生方法重复性差的问题。同时，采用微波辅助消解的样品前处理方法，传统的高温水解方法需要6-12个小时，而本发明仅需要20～60分钟即可将植物多糖完全水解，大大缩减了水解时间，提高了检测效率。因此，本发明方法适用于多种植物多糖含量的检测。

Claims (8)

1.一种植物多糖含量的测定方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

S1：将待检测的样品粉碎后用弱极性溶剂进行处理，处理后的样品再使用有机溶剂进行提取，最后再使用水提取样品中的多糖获得提取液；

S2：将提取液进行过滤后，滤液进行微波消解，滤膜过滤后，滤液进行离子色谱分析；

S3：待检测的样品中各单糖的质量按式1)计算：

m_i＝c_i×V_i×D×10^-6…………………………………1)

m_i——待测样品中各单糖的质量，单位g；

c_i——由标准曲线计算所得样品中各单糖组分的质量浓度μg/mL；

V_i——样品的稀释体积mL；

D——稀释因子，即待测的样品溶液被稀释的倍数；

S4：待检测的样品中多糖的质量按式2)计算：

m_多——待测样品中多糖的质量，单位g；

m_i——待测样品中各单糖的质量，单位g；

Mi——待测样品中各单糖的摩尔质量，单位：克每摩尔(g/mol)；

S4：待检测的样品中多糖的含量百分比按式3)计算：

m_多——待测样品中多糖的质量，单位g；

m——待测样品的质量，单位g；液体为称取样品中干物质的重量；固体为称取样品重量减去水分含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1)中弱极性溶剂为***、石油醚或正己烷。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1)中的有机溶剂为醇溶剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2)中的微波消解，是将提取液加入3～7mol/L三氟乙酸后，80～120℃微波中消解20～60min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2)中的离子色谱分析，是采用脉冲安培检测器，Au工作电极，Pd参比电极；进样量：5～20μL；流速：0.2～1mL/min；流动相：氢氧化钠溶液和醋酸钠溶液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的氢氧化钠溶液浓度范围为1～200mmol/L，醋酸钠溶液浓度范围为1～200mmol/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单糖为D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，D-甘露糖，L-***糖，L-鼠李糖，D-果糖，L-岩藻糖，D-核糖，D-脱氧核糖，D-山梨糖，D-赤藓糖，D-苏力糖，D-来苏糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸或D-甘露糖醛酸。

8.一种检测植物多糖含量的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于实施权利要求1所述方法的试剂。

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