CN115406979B - 残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法 - Google Patents
残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种残留1‑乙基[3‑(二甲氨基)‑丙基]‑碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，将样品的浸提液通过C18反相色谱柱，使用高效液相色谱法配合紫外检测器，采用反向液相色谱外标百分比法定量分析，实现了重组类胶原蛋白海绵交联剂EDC残留量的定量检测，该方法操作简便，灵敏度高，峰形以及分离度满足药典要求，且检测限相较于其他方法检测限更敏感，是一种高效、快速、准确的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械检测分析技术领域，具体涉及一种交联剂1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐(EDC)的高效液相色谱分析方法。
背景技术
碳二亚胺是一类含有官能团-N＝C＝N-的化合物，其分子呈线性结构，能与胶原蛋白中的羧基及氨基发生交联反应，改善胶原蛋白材料的性能，在此交联剂下制备 得到的胶原蛋白海绵具有疏松的多孔网络结构，良好的吸水率和耐降解性能。碳二 亚胺交联可克服胶原材料机械强度低、易被酶降解等缺陷，具有作为支架材料应用 于创伤修复的巨大潜能。目前有很多工艺中采用EDC与其物质进行反应，如多糖、 胶原、多肽、高分子等，应用前景巨大。尤其是在胶原蛋白应用飞速发展的条件下， 采用EDC对胶原蛋白进行改性，衍生其他产品，如：胶原海绵、人工皮肤、硬脑 膜等，但样品制备过程中EDC可能过量，医疗器械中的残留需进行控制，所以定 量的测定化学改性中交联剂EDC残留的是有必要的。
目前有文献建立了一种多糖蛋白疫苗中残余碳二亚胺的检测方法，该方法使用的是液相色谱及质谱联用技术(LC-MC)对碳二亚胺尿素衍生物进行定量分析。但 液质联用成本较高，并不是所有的企业及研究者可以普遍使用，在应用上受到了极大的限制。申请号为201510239250.5的发明专利中公开了一种采用HPLC-ELSD检 测EDC残留的方法，检测对象为EDC，采用的是高效液相色谱仪及蒸发光散射检测器，但该专利中提到的方法不适用于在水溶液中处理的样本，因为在水溶液中 EDC会转化为EDU，且为不可逆反应。
发明内容
本发明的目的是提供了一种残留交联剂1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐(EDC)的高效液相色谱分析方法，该方法可通过高效液相色谱仪紫外检测 器(HPLC-UV)进行检测重组类胶原蛋白海绵中的交联剂EDC残留，从而保证重 组类胶原蛋白海绵的质量。
本发明所述残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：
(1)样品溶液的制备：取待测物加入超纯水中，于40～60℃浸提，使残留的 1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐水解成1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基 脲，然后用0.22μm水膜过滤，得到样品溶液；水解反应过程如下：
其中R1代表-CH2-CH3(乙基)，R2代表-(CH2)3-N-(CH3)2(二甲氨基丙基)；
(2)配制1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液；
(3)采用高效液相色谱法配合紫外检测器检测1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液，记录同一保留时间下的峰面积；色谱条件为：色谱柱采用C18反相 柱，流动相为流动相A和流动相B体积比99：1～80：20的混合溶液，所述流动 相A为含0.1mM 1-庚烷磺酸钠、体积浓度0.04％三乙胺的水溶液并用磷酸调pH至3，流动相B为乙腈，洗脱方式为等度洗脱；以1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的 浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，根据标准品溶液的检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程；
(4)按照步骤(3)的条件检测步骤(1)中样品溶液，代入步骤(3)得到的 标准曲线方程中计算出样品溶液中1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的浓度，根据公 式：EDC残留量＝EDU浓度×样品溶液总体积/173×191/待测物质量×100％，计算待 测物中EDC残留量，所述EDC为1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐， EDU为1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲。
上述步骤(2)中，优选称取10mg 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品，置 于100mL容量瓶中，加超纯水至刻度线，摇晃使其充分溶解，得到100μg/mL的 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液；将1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液 用超纯水分别稀释为3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL的1-[3-(二 甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液。
上述步骤(3)中，所述C18反相柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱AQ-C18WeLch，其规格为4.6mm×250mm，填料孔径/>粒径5μm。
上述步骤(3)中，优选进样体积为10～20μL，流速为0.8～1.2mL/min，柱温 为25～40℃，检测波长为200～210nm。
上述步骤(3)中，进一步优选所述色谱柱进样前需用流动相平衡柱子120～150min。
上述步骤(3)中，更进一步优选所述流动相为流动相A和流动相B体积比97： 3～95：5的混合溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)检测时间短，减少了有机相的使用，为企业节省成本和减少对环境的污 染；且在进样时，使用的是混合流动相，减少了基线波动；
(2)EDU由于极性较强在C18柱上无保留而穿柱，且EDU在200～210nm 的紫外吸收较弱，通过1-庚烷磺酸钠、三乙胺、磷酸等试剂延长了EDU在C18柱 上的保留使其主峰达到合理的保留时间，同时加强了EDU在色谱柱上的吸收，减 弱了其他杂质对EDU的影响，检测限更敏感，达到纳克级别；精密度良好(重复 性RSD％<1.97％)，线性关系良好，检测限浓度为重组类胶原蛋白海绵交联剂EDC 杂质规定限值的0.44％时，信噪比为3.71，各个浓度的回收率均在94％之上，回收 率良好，准确度高，耐用性良好(RSD％<2％)；
(3)本方法相较于液质谱联用(LC-MS)、高效液相色谱仪联合蒸发光散射 检测器(HPLC-ELSD)更便宜、更普遍，从而降低企业成本，且操作简单，通过 调整流动相中的相关试剂，使其检测限达到40ng/mL，且EDC转化为EDU具有不 可逆性，直接检测EDU结果更可靠、准确，稳定性更好，既可以满足企业生产的高通量检测，也适用于实验室以研发为目的的检测。
附图说明
图1是EDU的标准曲线图。
图2是本发明流动相对EDU的检测限色谱图。
图3是普通流动相对EDU的检测限色谱图。
图4是EDU储备液的高效液相色谱图。
图5是现配EDC水溶液的高效液相色谱图。
图6是EDC水溶液放置7天后的高效液相色谱图。
图7是重组类胶原蛋白海绵浸提液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行说明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实例。
实施例1
1、样品溶液的制备：称取重组类胶原蛋白海绵100mg，用剪刀剪碎后置于离 心管中，加入2mL超纯水，并用封口膜密封离心管，在50℃水浴锅中浸提72h， 使重组类胶原蛋白海绵中残留的交联剂EDC在超纯水中转换成EDU；然后用 0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后得到的重组类胶原蛋白海绵浸提液即为样品溶液。
2、配制EDU标准品溶液：称取10mg EDU标准品，置于100mL容量瓶中， 加超纯水至刻度线，摇晃使其充分溶解，得到100μg/mL的EDU储备液。将EDU 储备液用超纯水分别稀释0、2、4、8、16倍，获得浓度为3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、 24μg/mL、48μg/mL的EDU标准品溶液。
另外，称取10mg EDC，置于100mL容量瓶中，加超纯水至刻度线，混匀放置 7天，备用；检测前再称取10mg EDC，置于100mL容量瓶中，加超纯水至刻度线， 混匀备用。
3、采用Angilent Infinity 1260Ⅱ高效液相色谱仪配合紫外检测器检测EDU标准品溶液，记录同一保留时间下的峰面积；色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷 键合硅胶柱(C18反相柱)AQ-C18 WeLch，其规格为4.6mm×250mm， 填料孔径/>粒径5μm，流动相为流动相A和流动相B体积比97：3的混合溶 液，所述流动相A为含0.1mM 1-庚烷磺酸钠、体积浓度0.04％三乙胺的水溶液并用 磷酸调pH至3，流动相B为乙腈(色谱级Fisher Chemical)，进样前色谱柱先用 流动相150min，进样体积为20μL，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为 201nm，检测器为紫外检测器，洗脱方式为等度洗脱。以EDU的浓度y为纵坐标， 峰面积x为横坐标，根据标准品溶液的检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程： y＝0.039x+0.4939(见图1)，R2＝0.9995，线性关系良好。说明通过1-庚烷磺酸钠、三乙胺、磷酸等试剂延长了EDU在C18柱上的保留使其主峰达到合理的保留时间， 同时加强了EDU在色谱柱上的吸收，减弱了其他杂质对EDU的影响。检测限浓度 为重组类胶原蛋白海绵交联剂EDC杂质规定限值的0.44％时，信噪比为3.71，检 测限达到40ng/mL，即40ng/mL*20μL＝800pg，色谱图见图2。
若将上述流动相换成含体积浓度0.1％的三氟乙酸的超纯水(流动相A)和含体 积浓度0.1％的三氟乙酸的乙腈(流动相B)体积比97：3的混合溶液(普通流动相)， 结果显示其检测限值为微克级别，且其他成分对主峰影响较大，色谱图见图3。
取上述EDU储备液、放置7天的EDC水溶液、现配EDC水溶液，分别用超 纯水将其稀释成9.05μg/mL的溶液，按照上述方法进行检测。通过高效液相色谱图 4～6对比，EDU为最终产物。
4、按照步骤3的条件检测步骤1中样品溶液，其色谱图见图7。将峰面积代入 步骤3得到的标准曲线方程中计算出样品溶液中1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]碳 二亚胺盐酸盐的浓度，根据公式：EDC残留量＝EDU浓度×样品溶液总体积/173×191/待测物质量×100％。结果显示，重组类胶原蛋白海绵中EDC的残留量小于0.02％， 即EDC的残留量小于9μg/mL。
为了证明本发明的有益效果，对本发明的方法进行重复性、稳定性、加标回收 率以及样品检测实验，具体实验如下：
1、重复性
称取重组类胶原蛋白海绵若干，按照上述实施例1的方法制备成样品溶液，进 样20μl，重复进样6次，按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下 的峰面积，结果见表1。
表1重复性结果
| 名称 | 主峰保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 拖尾因子 | 理论塔板数 |
| 样品溶液-1 | 7.299 | 166.147 | 18.872 | 1.14 | 17018.9 |
| 样品溶液-2 | 7.294 | 171.659 | 18.988 | 1.14 | 16743.1 |
| 样品溶液-3 | 7.285 | 170.430 | 19.181 | 1.14 | 16901.59 |
| 样品溶液-4 | 7.279 | 171.238 | 19.279 | 1.14 | 16946.11 |
| 样品溶液-5 | 7.274 | 175.433 | 19.549 | 1.18 | 16865.19 |
| 样品溶液-6 | 7.27 | 174.895 | 19.604 | 1.16 | 16865.65 |
| 标准偏差SD | 0.011 | 3.37 | 0.294 | -- | -- |
| 算术平均值Xbar | 7.284 | 171.633 | 19.246 | -- | -- |
| 相对标准偏差RSD(％) | 0.16 | 1.96 | 1.53 | -- | -- |
以上数据证明所用高效液相色谱仪精密度良好。
2、稳定性
取样品溶液，将其在室温下放置0h、4h、24h、48h、96h，检测杨品液放置0h、 4h、24h、48h、96h的稳定性，精密吸取20μL的样品溶液，注入高效液相色谱仪 中，按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下的峰面积，检测结果 见表2。
表2稳定性检测结果
| 名称 | 峰面积 | 峰高 | 理论塔板数 |
| 样品溶液0h | 433.006 | 48.204 | 16803.10 |
| 样品溶液0h | 430.951 | 48.074 | 16834.84 |
| 样品溶液4h | 438.734 | 49.327 | 16947.52 |
| 样品溶液4h | 432.476 | 49.332 | 16997.93 |
| 样品溶液24h | 452.562 | 50.691 | 16908.13 |
| 样品溶液24h | 455.001 | 50.762 | 16860.88 |
| 样品溶液48h | 448.592 | 50.529 | 16651.98 |
| 样品溶液48h | 446.718 | 50.537 | 16671.07 |
| 样品溶液96h | 437.212 | 46.049 | 15683.01 |
| 样品溶液96h | 438.526 | 46.251 | 15746.76 |
| 标准偏差SD | 8.70 | -- | -- |
| 算术平均值Xbar | 441.378 | -- | -- |
| 相对标准偏差RSD(％) | 1.97 | -- | -- |
上述数据证明样品溶液在室温放置96h后，样品溶液的性质稳定，放置时间对 样品中EDU杂质在96h内没有影响，证明EDC转化为EDU的不可逆性。
3、加标回收率
称取重组类胶原蛋白海绵若干，按照上述实施例1的方法制备成供试品溶液； 精密称量EDU 0.2mg置于10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，混匀，作为对 照品溶液。取上述供试品溶液加入不同体积的对照品溶液，制备成加样回收的样品 溶液，按照实施例1的色谱条件进行检测。按照下述公式计算加样回收率：加样回 收率＝回收率％＝(C-A)/B*100％，式中A为供试品溶液所含被测成分量；B为加入 对照品的量；C为实测值。结果见表3。
表3加标回收率结果
注：对照品2.4-1中的2.4表示取20μg/mL的对照品溶液2.4mL，加水定容至10mL，混匀， -1代表平行样1。样+对2.4-1-1中的2.4代表取20μg/mL的对照品溶液2.4mL，加入供试品溶液 3mL，再定容至10mL，-1-1代表第1组样品的平行样1，样+对3.6-2-2中的3.6代表取20μg/mL 的对照品溶液3.6mL，加入供试品溶液3mL，再定容至10mL，-2-2代表第2组样品的平行样2. 其余代表的意思与上述相同。
由表3可见，当EDU含量在0.1％～1％之间时，回收率限度为90％～108％之 间，实际检测中高低浓度的回收率为95％，加样回收率良好。
4.样品检测
称取连续三批重组类胶原蛋白海绵样品，按照上述实施例1的方法制备成样品 溶液，并按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下的峰面积，检测 结果见表4。
表4样品检测结果
| 名称 | 主峰保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 拖尾因子 | 理论塔板数 | 含量％ |
| 15-1 | 7.114 | 145.555 | 16.780 | 1.18 | 16664.16 | 0.014％ |
| 15-2 | 7.113 | 144.908 | 16.760 | 1.19 | 16698.24 | 0.013％ |
| 15-3 | 7.111 | 144.621 | 16.737 | 1.18 | 16695.04 | 0.013％ |
| 29-1 | 7.108 | 124.032 | 14.490 | 1.15 | 16977.49 | 0.012％ |
| 29-2 | 7.106 | 125.145 | 14.527 | 1.16 | 16786.46 | 0.012％ |
| 29-3 | 7.103 | 123.961 | 14.508 | 1.15 | 16993.17 | 0.012％ |
| 05-1 | 7.099 | 202.664 | 23.514 | 1.20 | 16644.25 | 0.018％ |
| 05-2 | 7.096 | 202.349 | 23.568 | 1.18 | 16741.64 | 0.018％ |
| 05-3 | 7.093 | 203.013 | 23.609 | 1.20 | 16726.95 | 0.018％ |
注：表中15、29、05为三批样品，其后的-1、-2、-3代表每批样品做三个平行。
上述检测结果含量值均低于限定值，结果合格。
上述实施例仅为对重组类胶原蛋白海绵中交联剂EDC残留量检测方法，但不 限于重组类胶原蛋白海绵，对于其他物质中交联剂EDC的检测，本方法皆适用。
Claims (6)
1.一种残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：
(1)样品溶液的制备：取待测物加入超纯水中，于40～60℃浸提，使残留的1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐水解成1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，然后用0.22μm水膜过滤，得到样品溶液；
(2)配制1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液；
(3)采用高效液相色谱法配合紫外检测器检测1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液，记录同一保留时间下的峰面积；色谱条件为：色谱柱采用C18反相柱，流动相为流动相A和流动相B体积比99：1～80：20的混合溶液，所述流动相A为含0.1mM 1-庚烷磺酸钠、体积浓度0.04％三乙胺的水溶液并用磷酸调pH至3，流动相B为乙腈，洗脱方式为等度洗脱；以1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，根据标准品溶液的检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程；
(4)按照步骤(3)的条件检测步骤(1)中样品溶液，代入步骤(3)得到的标准曲线方程中计算出样品溶液中1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的浓度，根据公式：EDC残留量＝EDU浓度×样品溶液总体积/173×191/待测物质量×100％，计算待测物中EDC残留量，所述EDC为1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐，EDU为1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲。
2.根据权利要求1所述的残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中，称取10mg 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品，置于100mL容量瓶中，加超纯水至刻度线，摇晃使其充分溶解，得到100μg/mL的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液；将1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液用超纯水分别稀释为3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液。
3.根据权利要求1所述的残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于：步骤(3)中，所述C18反相柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱AQ-C18 WeLch，其规格为4.6mm×250mm，填料孔径/>粒径5μm。
4.根据权利要求1所述的残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于：步骤(3)中，进样体积为10～20μL，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～40℃，检测波长为200～210nm。
5.根据权利要求1所述的残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于：步骤(3)中，所述色谱柱进样前需用流动相平衡柱子120～150min。
6.根据权利要求1所述的残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法，其特征在于：步骤(3)中，所述流动相为流动相A和流动相B体积比97：3～95：5的混合溶液。
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