CN110016444B - 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 - Google Patents
不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110016444B CN110016444B CN201910271444.1A CN201910271444A CN110016444B CN 110016444 B CN110016444 B CN 110016444B CN 201910271444 A CN201910271444 A CN 201910271444A CN 110016444 B CN110016444 B CN 110016444B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- substrate
- wet
- acinetobacter
- zjph1806
- ethanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- BYBLEWFAAKGYCD-UHFFFAOYSA-N Miconazole Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1COC(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CN1C=NC=C1 BYBLEWFAAKGYCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 14
- 229960002509 miconazole Drugs 0.000 title abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 102
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 52
- VYWPPRLJNVHPEU-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethanone Chemical compound ClCC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1Cl VYWPPRLJNVHPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- -1 4-chlorphenyl Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 33
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 29
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 29
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 22
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 16
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 claims description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 12
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 12
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 10
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000588625 Acinetobacter sp. Species 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 28
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 11
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 description 7
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- XHEPANNURIQWRM-QMMMGPOBSA-N (1r)-2-chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethanol Chemical compound ClC[C@H](O)C1=CC=C(Cl)C=C1Cl XHEPANNURIQWRM-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OWIRVNDMYDSKIJ-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloro-1h-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(Cl)=NC2=C1Cl OWIRVNDMYDSKIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHEPANNURIQWRM-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethanol Chemical compound ClCC(O)C1=CC=C(Cl)C=C1Cl XHEPANNURIQWRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000999270 Acinetobacter sp. PAMU-1.11 Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000003050 experimental design method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 229940116871 l-lactate Drugs 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 1
- BDOLXPFAFMNDOK-UHFFFAOYSA-N oxazaborolidine Chemical compound B1CCON1 BDOLXPFAFMNDOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K tripotassium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种不动杆菌ZJPH1806及其制备咪康唑手性中间体的应用,2,2',4'‑三氯苯乙酮经不对称还原制备(R)‑2‑氯‑1‑(2,4‑氯苯基)乙醇,所得产物的光学纯度高。在pH 7.6的磷酸缓冲液体系中,以甘油为辅助底物,加入2g/L的底物反应26h,R‑型产物的产率为83.2%,e.e.值>99.9%。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种咪康唑手性中间体的制备,特别涉及一种利用新菌株--不动杆菌ZJPH1806生物催化不对称合成咪康唑手性中间体的方法。
(二)背景技术
2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇(分子量:225.48,CAS号:11446-57-0)是制备咪康唑(Miconazole)的关键手性中间体。其中R构型化合物,即式(Ⅰ-a)为本发明述及的制备咪康唑关键手性中间体。式(Ⅲ)的化学名称为1-[2-(2,4-二氯苯基)-2-[(2,4-二氯苯基)甲氧基]乙基]-1H-咪唑,也称双氯苯咪唑。
式(Ⅰ)为2,2',4'-三氯苯乙酮,式(Ⅱ)为2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇,式(Ⅲ)为咪康唑。
式(Ⅰ-a)为式(Ⅰ)的(R)-异构体,式(Ⅰ-b)为式(Ⅰ)的(S)-异构体。
咪康唑是一类抗真菌范围广泛、安全有效的抗真菌剂,用于治疗人和动物皮肤中的真菌感染疾病,药理学研究发现R-(-)-咪康唑的抗真菌活性高于相应的S-构型异构体和外消旋体,能明显提高药效,降低毒副作用。咪康唑合成的关键是制备得到其重要手性中间体(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇,即式(Ⅰ-a),根据该手性中间体的合成方法不同,可分为化学法和生物法两类。
采用化学法制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇,需要使用手性恶唑硼烷和重金属钌的配合物作为催化剂,会对环境造成污染且收率不高。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。
Juan Mangas-Sanchez(Bioorg Med Chem Lett.2008,18,1820-1824.)等报道了采用商品酶催化还原的制备方法,分别以市售醇脱氢酶ADH A或醇脱氢酶ADH T为催化剂,加入NADH(或NADPH)作为辅助因子,1.0mM 2,2',4'-三氯苯乙酮为底物,30℃转化24h,产率分别为74%和65%。Yue-Peng Shang(Adv.Synth.Catal.2017,359,426-431.)等从Scheffersomyces stipitis CBS 6045中克隆酮还原酶Ss CR,在重组大肠杆菌中表达,在不额外添加NADP+的情况下,加入300mM 2,2',4'-三氯苯乙酮转化6h,转化率为99%,ee值为99%,反应放大至1L时,产率为88.2%。唐云平(CN108396040A.X[P].2018-08-14.)等人将来自Candida macedoniensis AKU 4588羰基还原酶的基因通过重组,得到重组菌株E.coli BL21/pET21c-cr2。当重组羰基还原酶添加量为20-100U/L时,在pH 7.6-8.8缓冲液中,30-40℃、Zn2+存在的条件下催化底物2,2',4'-三氯苯乙酮反应合成咪康唑中间体(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇,产物ee值为99%。
利用微生物全细胞生物催化不对称反应可制备得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。该方法可利用微生物自身所含有的完整酶系,使反应过程中的羰基还原酶催化体系与辅酶再生体系偶联,无需额外添加价格昂贵的辅因子(NADP+或NAD+),使生物催化工艺更经济;并且羰基还原酶处于细胞内相对稳定的环境,使该酶抵抗环境因素干扰的能力更强。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产羰基还原酶的微生物新菌株-不动杆菌ZJPH 1806,以及利用该菌株全细胞催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的应用,相较于化学法合成路线,该方法的立体选择性高,催化剂制备成本低廉,且转化过程对环境友好。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一株新菌株-不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:2019214,保藏日期:2019年3月29日,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编:430072。
本发明还涉及所述的不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用,具体所述应用的方法为:以不动杆菌ZJPH1806经发酵培养获得的湿菌体为酶源,以2,2',4'-三氯苯乙酮为底物,加入二甲基亚砜(DMSO),以pH 5~9(优选pH 6~8,最优选7.6)的缓冲液为反应介质构成转化体系,在25~50℃(优选25~40℃,最优选40℃)、150~250rpm(优选200rpm)条件下进行转化反应,反应结束后,将转化液分离纯化,获得(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。所述转化体系中,底物用量以缓冲液体积计为0.1~10g/L(优选1~3g/L,最优选1.5g/L),湿菌体用量以缓冲液体积计为100~450g/L(优选100~300g/L,最优选150g/L)。
进一步,为促进还原过程中的辅酶再生,提高反应效率,所述转化体系中还添加有辅助底物,所述辅助底物为下列之一:麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乙醇、异丙醇、甘油;辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油时,加入量为20~300g/L缓冲液,辅助底物为乙醇或异丙醇时,加入体积为缓冲液体积的10~30%。最优选的,所述辅助底物为甘油,甘油添加量以缓冲液体积计为200g/L,此时所得产物的光学纯度和产率最高。
进一步,所述缓冲液pH 6.0~8.0的常规缓冲液,离子强度范围为0.01~0.2M,优选0.1M、pH 7.6的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4)。
进一步,所述湿菌体细胞可按照常规方法由菌株经发酵后分离获得,优选的,所述湿菌体细胞由如下方法获得:将不动杆菌ZJPH1806接种至发酵培养基,30℃、200rpm摇床培养24h,发酵液经离心、洗涤沉淀,收集得到湿菌体细胞;所述发酵培养基终浓度组成如下:葡萄糖20~40g/L,玉米浆40~70g/L,KH2PO4 0.5~2g/L,溶剂为水,pH 6.0~9.0。优选发酵培养基终浓度组成如下:葡萄糖27.62g/L,玉米浆57.35g/L,KH2PO4 0.90g/L,溶剂为水,pH8.0。
更进一步,所述湿菌体在发酵前先进行活化和扩大培养,具体为:
(1)斜面培养:将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基,30℃恒温培养箱培养1~2d,获得斜面菌种,4℃冰箱保存;斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨7.5g/L,酵母膏6g/L,(NH4)2SO4 3g/L,KH2PO4 1.5g/L,NaCl 0.75g/L,MgSO4·7H2O 0.75g/L,琼脂粉20g/L,溶剂为水,pH 6.5;
(2)种子培养:将斜面菌种接种至种子培养基中,30℃、200rpm培养12h,获得种子液;种子培养基组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,(NH4)2SO4 2g/L,KH2PO42g/L,NaCl 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,溶剂为水,pH 6.5;
(3)发酵培养:将种子液以10%(v/v)的接种量转接至发酵培养基中,30℃,200rpm培养24h,将发酵液于4℃,9000rpm条件下离心15min,弃去上清,并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次,再次离心分离获得湿菌体,备用。
本发明所述不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用最优选为:取0.1M pH为7.6的磷酸盐缓冲液,加入不动杆菌ZJPH1806湿菌体细胞,底物,二甲基亚砜(DMSO)和甘油构成转化体系,30℃、200rpm摇床振荡转化24h,反应结束后将转化液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取两次,得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇;所述湿菌体细胞浓度以湿重计为100g/L缓冲液,底物浓度为2g/L,DMSO体积加入量10%(v/v),甘油加入量为200g/L。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:本发明提供一株可用于高立体选择性不对称还原潜手性酮底物(Ⅰ)制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇(式(Ⅰ-a)化合物)的微生物菌株--不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806,利用该菌株制备所得产物的光学纯度高。在pH 7.6的磷酸缓冲液体系中,加入2g/L的底物反应26h,R-型产物的产率为83.2%,e.e.值>99.9%。
(四)附图说明
图1为不动杆菌ZJPH1806的平板培养菌落形态。
图2为式(Ⅰ-a)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图3为式(Ⅰ-b)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图4为式(Ⅰ)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图5为不动杆菌ZJPH1806菌株生物还原反应萃取液的液相检测色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1、不动杆菌ZJPH1806菌株的筛选及鉴定
1、菌株筛选
1)富集培养及初筛:将从浙江省金华市婺城区尖峰山果园附近采集的新鲜土样1g,加入至装有50mL富集培养基的250mL摇瓶中,30℃、200rpm,培养5d,取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中,继续富集培养5d,如此重复富集2次。富集培养基组成为:(NH4)2SO42g/L,KH2PO4 2g/L,NaCl1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,2,2',4'-三氯苯乙酮(2g/L)为唯一碳源,溶剂为水,pH 6.5。
2)平板培养:富集培养液用生理盐水稀释104-106倍后涂布于含筛选培养基的平板,30℃培养2d,经多次转接分离培养后,获得单菌落菌株。挑取单菌落进行平板划线,经2次划线分离培养后获得纯化单菌落。平板筛选培养基终浓度组成为:(NH4)2SO4 2g/L,KH2PO42g/L,NaCl 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,2,2',4'-三氯苯乙酮2g/L,20g/L琼脂粉,溶剂为水,pH 6.5。
3)斜面培养:挑取平板培养基中获得的单菌落至斜面培养基,30℃恒温培养箱培养1~2d,4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨7.5g/L,酵母膏6g/L,(NH4)2SO4 3g/L,KH2PO4 1.5g/L,NaCl 0.75g/L,MgSO4·7H2O 0.75g/L,琼脂粉20g/L,溶剂为水,pH 6.5。
4)种子培养:将斜面菌种接种至种子培养基中,30℃、200rpm培养12h,获得种子液;种子培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,(NH4)2SO4 2g/L,KH2PO4 2g/L,NaCl 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,溶剂为水,pH 6.5;
5)发酵培养:将种子液以体积浓度为10%的接种量接种至发酵培养基中,装液量为100mL/250mL摇瓶,30℃、220rpm培养24h,获得发酵液。发酵培养基组成为:葡萄糖27.62g/L,玉米浆57.35g/L,KH2PO4 0.90g/L,溶剂为水,pH 8.0。其中玉米浆购自河南鑫洋实业有限责任公司。
6)生物转化反应:将发酵液离心得到的湿菌体悬浮于K2HPO4-KH2PO4(0.1M,pH6.5)磷酸盐缓冲液中,加入2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮底物和100g/L葡萄糖,置30℃摇床中转化24h。转化结束后,转化液用等体积乙酸乙酯萃取,经离心后得到上清液,采用手性液相色谱法分析目的产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇对映体过量值(ee值)和产率,反应后残留底物的含量,从而筛选得到菌株ZJPH1806,产率为49.4%,ee值为99.9%(图5)。
7)分析检测:反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析。取1mL萃取液烘干后用无水乙醇溶解,稀释100倍后进行分析检测。液相色谱条件:日本岛津LC-20A高效液相色谱仪,浙大N2000色谱工作站;日本大赛璐多糖衍生物类手性色谱柱OB-H(250mm×4.6mm×5μm)。色谱条件如下:流动相为正己烷/异丙醇=97:3(v/v);流速1mL/min;柱温:30℃;检测波长:220nm。
液相色谱法定性及定量分析:检测转化反应后产物及残留底物的含量,并计算相关物质浓度、产率、酶活和e.e.值。
公式(1)中C产物、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)表征。
公式(2)中:CS和CR分别为(S)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的摩尔浓度。
羰基还原酶酶活力定义:在30℃,200rpm转化条件下,每分钟还原2,2’,4’-三氯苯乙酮底物生成1μmol产物(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
菌株的羰基还原酶活力以细胞所含酶的比活力(U/g)表示。
2、菌株ZJPH1806的鉴定
(1)菌株ZJPH1806生理生化特征:
革兰氏染色阴性,菌落呈白色,圆形,边缘整齐,表面光滑。显微镜下呈短杆状,可以利用酪氨酸芳胺酶和柠檬酸盐(钠),可使L-苹果酸盐同化、L-乳酸盐碱化和琥珀酸盐碱化。
(2)菌株ZJPH1806的16S rDNA序列特性:以提取到的细胞总DNA为模板,利用通用引物27F(5’AGTTTGATCMTGGCTCAG3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’)扩增菌株的16SrDNA基因,再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株ZJPH1806的16SrDNA基因序列(1467bp)如SEQ ID NO.1所示:
tcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgggggaggttgcttcggtaattgacctagcggcggacgggtgagtaatacttaggaatctgcctattaatgggggacaacatctcgaaagggatgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcacttgtgaccttgcgttaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatggggggaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctcctgtagttaatacctacagagagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactgggaagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatagtaagaactttccagagatggattggtgccttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcacttcgggtgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtaggtagtctaaccgtaaggaggacgcttaccacggtgtggccgatgactggggtgaa。
将菌株ZJPH1806的16S rRNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST),结果表明:菌株ZJPH1806与菌株Acinetobacter sp.PAMU-1.11(GenBank登录号为44885679)的序列同源性为95%。
根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定,该菌株ZJPH1806被鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.),命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:2019214,保藏日期2019年3月29日,地址中国,武汉,武汉大学,邮编430072。
实施例2优化培养基组成
1、优化发酵培养基中碳源、氮源和无机盐种类
发酵培养基组成:碳源15g/L、氮源含氮量1.8g/L、无机盐1mM,溶剂为水,pH6.5。
将不动杆菌ZJPH1806接种至不同碳源、氮源和无机盐组成的发酵培养基中,培养条件为:初始pH值6.5,摇瓶装液量100mL/250mL锥形瓶,培养温度30℃、摇床转速200rpm,体积接种量10%,培养时间24h,采用实施例1方法测定酶活及ee值。
通过考察不同种类碳源、氮源和无机盐种类的单因素实验(表1-表3、表5所示),得到最佳碳源、氮源和无机盐的种类分别为葡萄糖、玉米浆和KH2PO4。
表1不同碳源种类对菌体酶活及ee值的影响
表2葡萄糖添加量对菌体酶活及ee值的影响
表3不同氮源种类对菌体酶活及ee值的影响
表4玉米浆添加量对菌体酶活及ee值的影响
表5不同无机盐种类对菌体酶活及ee值的影响
备注:(-)表示与初始发酵培养基相比,培养基中未添加该组份
表6不同K+添加量对菌体酶活及ee值的影响
由表2,表4,表6得到不动杆菌ZJPH1806菌株的发酵培养基组成为:葡萄糖20~40g/L,玉米浆30~70g/L,KH2PO4 0.5~5.0g/L,溶剂为水,pH 6.0~9.0。
2、采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法,对发酵培养基中影响产酶的三个显著因素,即葡萄糖、玉米浆和KH2PO4浓度进行优化(表7、8):
得到不动杆菌ZJPH1806菌株的发酵培养优选组成为:葡萄糖20~35g/L,玉米浆50~70g/L,KH2PO4 0.5~2.5g/L,溶剂为水,pH 6.0~9.0,最优发酵培养基配方:葡萄糖27.62g/L,玉米浆57.35g/L,KH2PO4 0.90g/L,溶剂为水,pH 8.0。
表7最陡爬坡实验设计及结果
表8 Box-Behnken旋转中心组合实验设计及酶活
实施例3:湿菌体细胞的获得
(1)斜面培养:将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基,30℃恒温培养箱培养1~2d,获得斜面菌种,4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨7.5g/L,酵母膏6g/L,(NH4)2SO4 3g/L,KH2PO4 1.5g/L,NaCl 0.75g/L,MgSO4·7H2O 0.75g/L,琼脂粉20g/L,溶剂为水,pH 6.5。
(2)种子培养:将斜面菌种接种至种子培养基中,30℃、200rpm培养12h,获得种子液;种子培养基组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,(NH4)2SO4 2g/L,KH2PO42g/L,NaCl1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,溶剂为水,pH 6.5。
(3)发酵培养:将种子液以10%(v/v)的接种量转接至发酵培养基中,30℃,200rpm培养24h,将发酵液于4℃,9000rpm条件下离心15min,弃去上清,并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次,再次离心分离获得湿菌体细胞,备用。
发酵培养基配方:葡萄糖27.62g/L,玉米浆57.35g/L,KH2PO4 0.90g/L,溶剂为水,pH 8.0。
实施例4:辅助底物对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M,pH6.5)中,湿菌体以湿重计浓度为100g/L;加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,再分别加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,乙醇、异丙醇、甘油作为辅助底物,以不添加任何辅助底物为对照,置于30℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表9。在优选实施方案中,加入100g/L甘油作为辅助底物时,产物产率为50.1%,e.e.值>99.9%。
表9添加不同辅助底物对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
实施例5:甘油添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M,pH6.5)中,湿菌体以湿重计浓度为100g/L;加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,分别加入50~250g/L的甘油作为辅助底物,置于30℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表10。在优选实施方案中,加入200g/L甘油浓度作为辅助底物时,产物产率为52.3%,e.e.值>99.9%。
表10不同甘油添加量对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
实施例6:缓冲液pH值对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL不同pH值(表7)K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M)中,湿菌体以湿重计浓度为100g/L;加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,分别加入200g/L甘油作为辅助底物,置于30℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表11。在优选实施方案中,K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M)pH为7.6时,产物产率为56.2%,e.e.值>99.9%。
表11缓冲液不同pH值对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
实施例7:转化温度对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M,pH7.6)中,湿菌体以湿重计浓度为100g/L;加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,分别加入200g/L甘油作为辅助底物,置于不同温度(25~50℃,见表12)中,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表8。在优选实施方案中,优选反应温度为40℃时,产物产率为59.3%,e.e.值>99.9%。
表12不同转化温度下的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
实施例8:湿菌体添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M,pH7.6)中,湿菌体以湿重计,添加不同量的湿菌体(50-300g/L见表5),加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,分别加入200g/L甘油作为辅助底物,40℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表13。在优选实施方案中,优选湿菌体添加量为150g/L时(干重:26.7g/L),产物产率为76.6%,e.e.值>99.9%。
表13不同湿菌体添加量的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
实施例9:底物添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备1.5g的湿菌体悬浮于10mLK2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M,pH7.6)中,湿菌体以湿重计浓度为150g/L;加入不同量(见表14)的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,加入200g/L甘油作为辅助底物,置于40℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取。采用实施例1的检测方法,在优选实施方案中,优选底物添加量为1.5g/L时,产物产率为83.2%,e.e.值>99.9%。
表14不同底物添加量下的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
实施例10:
将按照实施例3方法制备的1.5g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.6)中,湿菌体以湿重计浓度为150g/L;加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,加入200g/L甘油作为辅助底物,置于40℃,200r/min的摇床中转化26h。采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇浓度为1.66g/L,光学纯度ee值>99.9%,产率83.2%。
实施例11:
将按照实施例3方法制备的1.5g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.6)中,湿菌体以湿重计浓度为150g/L;加入终浓度2.5g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,加入200g/L甘油作为辅助底物,置于40℃,200r/min的摇床中转化26h。采用实施例1的检测方法,产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的浓度为1.63g/L,光学纯度ee值>99.9%,产率65.1%。
实施例12:
红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012对2,2',4'-三氯苯乙酮的生物还原能力考察
(1)红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为中国,武汉,武汉大学,邮编430072,保藏编号为CCTCC NO:M2013650,保藏日期2013年12月11日,该菌已在先前的专利申请(公开号为CN 103773724 A,申请日期2014年1月17日)中公开。
(2)红串红球菌(R.erythropolis)XS1012的来源和湿菌体的制备方法详见已申请的专利(CN103773724A,公开日期2014年5月7日)。
(3)2,2',4'-三氯苯乙酮的生物转化
将红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012湿菌体移入装有10mL,0.1M的pH 6.5磷酸盐缓冲液的250mL锥形瓶中,同时加入初始浓度为2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮底物,100g/L湿菌体,以10%(v/v)DMSO作为助溶剂,加入100g/L葡萄糖作为辅助底物构成转化体系,置于30℃,200r/min的摇床中转化24h。反应结束后,加入等体积的乙酸乙酯萃取,采用实施例1的方法检测转化产物中(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的含量,未检测到有产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇生成。
结论:红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012不能转化2,2',4'-三氯苯乙酮制备得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 不动杆菌ZJPH1806及其制备咪康唑手性中间体的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter sp.)
<400> 1
tcagattgaa cgctggcggc aggcttaaca catgcaagtc gagcggggga ggttgcttcg 60
gtaattgacc tagcggcgga cgggtgagta atacttagga atctgcctat taatggggga 120
caacatctcg aaagggatgc taataccgca tacgccctac gggggaaagc aggggatcac 180
ttgtgacctt gcgttaatag atgagcctaa gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc 240
ctaccaaggc gacgatctgt agcgggtctg agaggatgat ccgccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg ggggaaccct 360
gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg 420
aggaggctcc tgtagttaat acctacagag agtggacgtt actcgcagaa taagcaccgg 480
ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac agagggtgcg agcgttaatc ggatttactg 540
ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggctttttaa gtcggatgtg aaatccccga gcttaacttg 600
ggaattgcat tcgatactgg gaagctagag tatgggagag gatggtagaa ttccaggtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa taccgatggc gaaggcagcc atctggccta 720
atactgacgc tgaggtacga aagcatgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
atgccgtaaa cgatgtctac tagccgttgg ggcctttgag gctttagtgg cgcagctaac 840
gcgataagta gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagacta aaactcaaat gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct 960
ggtcttgaca tagtaagaac tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa cttacataca 1020
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt ttccttattt gccagcactt cgggtgggaa ctttaaggat actgccagtg 1140
acaaactgga ggaaggcggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga ccagggctac 1200
acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgctacctag cgataggatg ctaatctcaa 1260
aaagccgatc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagaatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtttgttg caccagaagt aggtagtcta accgtaagga ggacgcttac 1440
cacggtgtgg ccgatgactg gggtgaa 1467
Claims (10)
1.不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:2019214,保藏日期:2019年3月29日,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编:430072。
2.一种权利要求1所述不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述应用的方法为:以不动杆菌ZJPH1806经发酵培养获得的湿菌体为酶源,以2,2',4'-三氯苯乙酮为底物,加入二甲基亚砜,以pH 5~9的缓冲液为反应介质构成转化体系,在25~50℃、150~250rpm条件下进行转化反应,反应结束后,将转化液分离纯化,获得(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述转化体系中,底物用量以缓冲液体积计为0.1~10g/L,湿菌体用量以缓冲液体积计为100~450g/L。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述转化体系中还添加有辅助底物,所述辅助底物为下列之一:麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乙醇、异丙醇、甘油。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油时,加入量为20~300g/L缓冲液,辅助底物为乙醇或异丙醇时,加入体积为缓冲液体积的10~30%。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述缓冲液为0.1M、pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述湿菌体细胞由如下方法获得:将不动杆菌ZJPH1806接种至发酵培养基,30℃、200rpm摇床培养24h,发酵液经离心、洗涤沉淀,收集得到湿菌体细胞;所述发酵培养基终浓度组成如下:葡萄糖20~40g/L,玉米浆40~70g/L,KH2PO4 0.5~2g/L,溶剂为水,pH 6.0~9.0。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述湿菌体在发酵前先进行活化和扩大培养,具体为:
(1)斜面培养:将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基,30℃恒温培养箱培养1~2d,获得斜面菌种,4℃冰箱保存;斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨7.5g/L,酵母膏6g/L,(NH4)2SO4 3g/L,KH2PO4 1.5g/L,NaCl 0.75g/L,MgSO4·7H2O 0.75g/L,琼脂粉20g/L,溶剂为水,pH 6.5;
(2)种子培养:将斜面菌种接种至种子培养基中,30℃、200rpm培养12h,获得种子液;种子培养基组成为:葡萄糖15g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,(NH4)2SO4 2g/L,KH2PO4 2g/L,NaCl 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,溶剂为水,pH 6.5;
(3)发酵培养:将种子液以体积浓度10%的接种量转接至发酵培养基中,30℃,200rpm培养24h,将发酵液于4℃,9000rpm条件下离心15min,弃去上清,并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次,再次离心分离获得湿菌体。
10.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述应用的方法为:取0.1M pH为7.6的磷酸盐缓冲液,加入不动杆菌ZJPH1806湿菌体细胞,底物,二甲基亚砜和甘油构成转化体系,30℃、200rpm摇床振荡转化24h,反应结束后将转化液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取两次,得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇;所述湿菌体细胞浓度以湿重计为100g/L缓冲液,底物浓度为2g/L,DMSO体积加入量10%,甘油加入量为200g/L。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910271444.1A CN110016444B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910271444.1A CN110016444B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110016444A CN110016444A (zh) | 2019-07-16 |
CN110016444B true CN110016444B (zh) | 2021-05-11 |
Family
ID=67190622
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910271444.1A Active CN110016444B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110016444B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110982757B (zh) * | 2019-12-30 | 2021-04-06 | 浙江工业大学 | 阴沟肠杆菌zjph1903及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101863832A (zh) * | 2010-06-13 | 2010-10-20 | 湖北远成药业有限公司 | 一种工业化生产硝酸咪康唑的方法 |
CN108396040A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-08-14 | 浙江海洋大学 | 一种咪康唑中间体的生物合成方法 |
-
2019
- 2019-04-04 CN CN201910271444.1A patent/CN110016444B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101863832A (zh) * | 2010-06-13 | 2010-10-20 | 湖北远成药业有限公司 | 一种工业化生产硝酸咪康唑的方法 |
CN108396040A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-08-14 | 浙江海洋大学 | 一种咪康唑中间体的生物合成方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"Cloning, expression, and characterization of a novel diketoreductase from Acinetobacter baylyi";Xuri Wu 等;《Acta Biochim Biophys Sin》;20090201;第41卷(第2期);摘要,第163页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110016444A (zh) | 2019-07-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112795603B (zh) | 一种制备(s)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法 | |
US10294479B2 (en) | Candida carbonyl reductase and method for preparing (R)-lipoic acid precursor | |
CN112143764B (zh) | 一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法 | |
CA2585411A1 (en) | Method of producing chiral alcohols | |
CN111996176B (zh) | 羰基还原酶突变体及其应用 | |
EP2171074B1 (de) | Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole unter Verwendung einer Dehydrogenase aus Azoarcus sp. EbN1 | |
CN101857887B (zh) | 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法 | |
CN103013898B (zh) | 一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用 | |
CN110016444B (zh) | 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 | |
CN113355299B (zh) | 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用 | |
CN110760449B (zh) | 半乳糖地霉zjph1810及制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇应用 | |
WO2007026860A1 (ja) | 光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法 | |
CN110982757B (zh) | 阴沟肠杆菌zjph1903及应用 | |
CN116064435A (zh) | 姜黄素还原酶CfcurA、编码基因及其应用 | |
CN113462728B (zh) | 一种利用土星轮头酵母制备(r)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的方法 | |
CN111925949B (zh) | 新月弯孢霉b-36及其在合成手性醇中的应用 | |
KR20040010202A (ko) | α-케토 산 환원효소, 이의 제조방법, 및 이를 이용한광학적으로 활성인 α-히드록시 산의 제조방법 | |
CN112126614B (zh) | 一种利用全细胞转化制备覆盆子酮的方法 | |
WO2017202193A1 (zh) | 重组酮还原酶在制备(r)-3-奎宁醇中的应用 | |
CN108441433B (zh) | 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用 | |
CN107794282B (zh) | 一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株 | |
CN107118986B (zh) | 一种恶臭假单胞菌及在制备(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇中的应用 | |
Yun et al. | Enzymatic production of (R)-phenylacetylcarbinol by pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis | |
CN111778198B (zh) | 一种藤黄细球菌hmc01及其在不对称还原制备手性醇中的应用 | |
CN112176019B (zh) | 一种生物催化制备(r)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |