CN113461179A - 一种沼泽红假单胞菌zt-mg2在富营养化水体治理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种沼泽红假单胞菌ZT‑MG2及其应用，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.22804，分类命名为：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株接种到铜绿微囊藻中有明显的抑制藻类生长的现象，且随着接菌量的增加，抑制效果也逐渐明显，且对于铜绿微囊藻具有明显抑制且致死效果，对于铜绿微囊藻产生的藻毒素具有明显的去除效果。

Description

一种沼泽红假单胞菌ZT-MG2在富营养化水体治理中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种具有特异性抑制藻类生长的沼泽红假单胞菌及其在富营养化水体中的应用。

背景技术

近年来，随着我国工农业生产和社会经济迅猛发展，排入江河、湖泊的废水和生活污水不断增加，从而导致环境不断的恶化，尤其是水环境，导致了江河湖泊出现了大面积的水华。水华的危害十分巨大，一方面藻类大量繁殖、水体溶氧含量与透明度降低、大量水生生物死亡、水生生态***平衡破坏。另一方面，多种藻类分泌的藻毒素，通过食物链在原生动物、贝类、虾、鱼等体内积累，严重威胁水产养殖业及人类生命安全。因此，面对严峻的水华污染，急需我们采取措施来改善水环境。

目前水华治理方法主要分为物理、化学、生物3类。物理方法包括机械打捞、气浮技术、超声波法、吸附法、过滤法等。

使用机械打捞清除水华，能够快速清除大量湖面水藻，此法可以作为蓝藻大面积爆发时的应急处理措施，且没有明显负面影响。气浮技术是在待处理水中通入或产生大量高度分散的微细气泡，使其与杂质、絮粒相互粘附，形成比重小于水的浮渣，依靠浮力浮上水面，以完成固液分离的一种净水方法。活性炭等吸附剂在水体中不但能对藻类有较高的去除率，还对藻毒素有一定的吸附作用，但是后期处理处理成本较高，限制了大范围的使用。

这些物理除藻方法具有方法简单、不引进二次污染，可防止外域生物入侵等优点，适合作为应急处理措施，但是对许多水体来说治标不治本，且需要专门的仪器设备，治理大面积的水华问题会耗费大量的人力物力资源。

化学方法主要是指用化学杀藻剂及絮凝剂来达到除燥、抑藻的效果。但是化学方法抑藻虽然会抑制藻细胞生长最终导致藻细胞死亡。但是会对其他的动植物生长发育有影响，会产生二次污染。破坏近岸生态***，对藻类水华的控制也只能起到短期的效果。

由此看出，物理和化学的防治方法在许多特定的环下发挥了一定的作用，但相比较生物防治方法而言，物理和化学方法成本高、效率度且容易破坏生态环境。在目前对环保要求越来越高的大背景下。生物法抑制水华成为研究的热点。其中目前发现微生物治理是现下研究热点。微生物中细菌通过直接溶藻和间接溶藻2种方式对藻类起作用。溶藻细菌多为革兰氏阴性菌，主要有粘细菌(Mysobacter)、噬胞菌属(Cytophaga)、杆菌(Bacillus)等。有些种类的粘细菌可直接与藻细胞接触，通过分泌溶解纤维素的酶来消化宿主的细胞壁，进而溶解整个藻细胞。间接溶藻是细菌通过分泌蛋白质、多肽类及氨基酸等胞外物质或通过对氮、磷等营养物质的竞争来达到抑藻目的。

沼泽红假单胞菌是光合细菌(英文缩写PSB)的一种，是地球上最古老的微生物之一。PSB菌体营养丰富，蛋白质含量高达65％，且富含多种生物活性物质，并具有适应性强，能耐受高浓度的有机废水和较强的分解转化能力，对酚、氰等毒物也有一定的耐受和分解能力等特点。并且沼泽红假单胞菌是兼性厌氧菌，其在非色素合成阶段，生长周期快，培养条件简单，适应性强，适用于广泛实际应用目前尚未发现利用沼泽红假单胞菌来抑制藻类生长的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型光合细菌，属红螺菌科红假单胞菌属，以解决现在富营养化水体中藻类大面积繁殖的问题。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明提供的一种沼泽红假单胞菌菌株ZT-MG2，于2017年11月由分离人马东燕在张家港鸿屹水产养殖中心螃蟹塘口分离得到。其性质为抑制藻类生长的光合细菌。于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC：22804，分类命名为：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所提供的沼泽红假单胞菌在富营养化水体中具有抑制藻类生长的作用。

本发明提供的沼泽红假单胞菌，在非光照不厌氧条件下经过24h后就能在TY培养基上长出白色单菌落，在光照厌氧条件下经过4天可以在TY培养基上长出红色单菌落。18℃-40℃均可生长，适应性广，可用于江河湖泊的自然水体。

本发明还提供了本发明所述的沼泽红假单胞菌ZT-MG2在环境污水处理中的应用。在一些实施例中，是在富营养化水体中的应用，更具体的实例中，是在富营养化污水藻类生长抑制中的应用。在一种具体的实例中，所述藻类为铜绿微囊藻或/和颤藻。

本发明还提供一种含有上述沼泽红假单胞菌ZT-MG2的菌剂。

本发明还所提供的菌剂在环境污水处理中的应用。在一些实施例中，是在富营养化水体中的应用，更具体的实例中，是在富营养化污水藻类生长抑制中的应用。在一种具体的实例中，所述藻类为铜绿微囊藻或/和颤藻。

本发明还提供一种净化剂，所述净化剂中含有本发明所述的沼泽红假单胞菌ZT-MG2。

本发明所述的净化剂，其中净化剂中活菌总浓度优选为1×10⁶～1×10¹⁰CFU/ml，优选为1×10⁷～1×10⁹CFU/ml，更优选为1×10⁸CFU/ml。

本发明还提供所述净化剂在环境污水处理中的应用。在一些实施例中，是在富营养化水体中的应用，更具体的实例中，是在富营养化污水藻类生长抑制中的应用。在一种具体的实例中，所述藻类为蓝藻，优选的，所述藻类为铜绿微囊藻或/和颤藻。

本发明的有益效果：

1、本研究从不同样本中分离、筛选到高效抑制藻类生长的优势沼泽红假单胞菌，在非光照厌氧条件下，经过24h后就能在TY培养基上生长到最大浓度，能在18-40℃下正常生长，说明本发明提供的沼泽红假单胞菌活力高，适应性强，可广泛用于各种富营养化水体抑制藻类的处理过程中。

2、通过筛选获得的菌株，经过驯化成高效稳定的菌株，菌株接种到铜绿微囊藻中有明显的抑制藻类生长的现象，且随着接菌量的增加，抑制效果也逐渐明显。进一步说明该菌种活力高，适应性强，对于藻类抑制能力强，对于铜绿微囊藻的去除效率高。。

3、对于铜绿微囊藻具有明显抑制且致死效果，对于铜绿微囊藻产生的藻毒素具有明显的去除效果，即不仅可以从源头控制藻浓度且同样可以显著减少叶绿素a及藻毒素的量。

附图说明

图1本发明提供的抑藻菌株ZT-MG2在非光照不厌氧条件下的菌落形态；

图2本发明提供的抑藻菌株ZT-MG2在光照厌氧条件下的菌落形态；

图3本发明提供的抑藻菌株ZT-MG2在非光照不厌氧条件下的生长曲线；

图4本发明提供的抑藻菌株ZT-MG2在非光照不厌氧条件下的最适pH；

图5本发明提供的抑藻菌株ZT-MG2在非光照不厌氧条件下的最适温度；

图6菌株ZT-MG2在实际模拟条件下对于铜绿微囊藻FACHB-930叶绿素a减少率；

图7菌株ZT-MG2对铜绿微囊藻FACHB-930藻毒素的削减情况；

图8菌株ZT-MG2在实际模拟条件下对铜绿微囊藻FACHB-930抑制情况的实际图；

图9菌株ZT-MG2在实际模拟条件下对铜绿微囊藻FACHB-930的致死率；

图10菌株ZT-MG2在实际模拟条件下对铜绿微囊藻FACHB-930致死情况的实际图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

本研究采用菌株对藻类叶绿素a及藻毒素的减少情况作为评价标准。

以下实施例中所用的TY培养基配比：蛋白胨5g，酵母粉3g，氯化钙(CaCl₂)0.67g，加去离子水1000mL，琼脂粉12g，自然pH。121℃，20min。

实施例1光合细菌的筛选与鉴定

1、光合细菌的筛选

1)取张家港鸿屹水产养殖中心螃蟹塘口，龙虾塘口，甲鱼塘口池底污泥各5g加入到装有500mL光合细菌培养基的透明塑料瓶中,放入30℃光照强度为2000lux下照射一周。

2)取张家港鸿屹水产养殖中心螃蟹塘口，龙虾塘口，甲鱼塘口养殖水各10mL加入到装有500mL光合细菌培养基的透明塑料瓶中,放入30℃光照强度为2000lux下照射一周。

3)塑料瓶中的培养基变成红褐色时，进行1％的接种量转接，待培养基的颜色变成红色，如此重复4次。

4)2mL离心管中事先分装好900μL无菌水，取富集好的污泥液和塘水各100μL装入含有无菌水的2mL离心管中。

5)最后涂布于TY固体培养基上，置于厌氧罐中进行培养，厌氧罐置于30℃，光照强度为2000lux。

6)同酵母菌同样的纯化方法。

7)挑选单菌落放入3mL的磨口厌氧瓶中，厌氧瓶中加满灭菌的TY培养基。然后放入30℃光照强度为2000lux的温室下照射一周，待厌氧瓶中的液体变红色后，放入光照弱些的温室中1天，最后放到黑暗条件下保存。

2、光合细菌的鉴定

2.1细菌总DNA的提取

1)挑取MG2单菌落接入3ml的光合细菌液体培养基中，在28℃，180rpm/min的恒温摇床中震荡培养12小时。

2)各取2mL菌液，12,000rpm/min离心2min，弃上清。

3)将菌体重悬于1mL的无菌水中，12,000rpm/min离心2min，弃上清，如此洗涤3次。

4)加入270μL 1×TE buffer，吹打混匀，使菌体充分重悬，再加入15μL溶菌酶，冰浴30min。

5)依次加入15μL 10％SDS、10μL 100μg/mL蛋白酶K，刮板混匀后置于37℃水浴30min。

6)加入200μL 4℃已预冷的5mol/L NaCl，刮板剧烈振荡混匀。

7)加入500μL的酚氯仿进行抽提，刮板剧烈震荡混匀，12,000rpm/min离心10min。

8)离心后混合物分三层，取最上层上清转至新的2mL离心管中，重复抽提直至在分界面处无白色絮状沉淀。

9)取所获得的上清液转移至1.5mL EP管中，加入0.8倍体积的1×TE buffer(约400μL)，再加入1倍体积的异丙醇(约500μL)，颠倒混匀后置于-70℃超低温冰箱中10min～15min。

10)取出样品，12,000rpm/min离心10min后，弃上层清液，用已在4℃预冷过的70％乙醇洗涤沉淀3次。

11)自然吹干后加入30μL已灭菌的ddH₂O溶解后，至于4℃保存待用。

2.2 16s rRNA基因扩增

使用16s rRNA通用引物进行PCR扩增，反应体系如表2所示，引物序列如表1所示：

表1 16s rRNA通用引物序列

表2 PCR反应体系(体系体积为50μL)

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min(30个循环)；72℃末端延伸10min。PCR产物约1,500bp，取PCR产物3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，若条带亮且清晰，将PCR产物进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。测序由南京斯普金公司完成，所得序列提交至NCBI核酸数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对。

经鉴定，单菌ZT-MG2为一株沼泽红假单胞菌，该菌株呈现典型的沼泽红假单胞菌菌落形态，菌落形态为圆形，表面光滑，边缘整齐，棕红色。菌落在光照厌氧培养下，菌落呈圆形，逐渐由白色变为淡粉色，再变成棕红色如图2所示；在非光照不厌氧的培养条件下，菌落呈白色圆形，生长周期快于光照厌氧条件，如图1所示。于2017年11月由分离人马东燕在张家港鸿屹水产养殖中心螃蟹塘口分离得到。其性质为抑制藻类生长的光合细菌。于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC：22804，分类命名为：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例2光合细菌的生长曲线

挑取图1所示菌株ZT-MG2的单菌落于TY液体培养基中,在28℃，180rpm/min的非光照恒温摇床中震荡培养24h，制成各自种子液。取各自种子液，按照1％接种量接入5mL的TY液体培养基中，每株3个重复。在28℃，180rpm/min的恒温摇床中震荡培养，每2小时，测定OD₆₀₀。如图3所示，24小时已达到最佳值。

实施例3光合细菌的最适pH和最适温度的测定

挑取图1所示菌株ZT-MG2的单菌落于TY液体培养基中，28℃震荡培养24小时，得到新鲜的种子液。取其自种子液，按照1％接种量接入5ml，pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的TY液体培养基中，每株3个重复。在28℃，180rpm/min的非光照恒温摇床中震荡培养24小时，测定OD₆₀₀。如图4所示。光合细菌的最适pH为5-8之间。

挑取图1所示菌株ZT-MG2的单菌落于TY液体培养基中，28℃培养24小时，得到新鲜的种子液。取各自种子液，按照1％接种量接入5mL的TY液体培养基中，每株3个重复。在20℃，30℃，40℃，50℃，180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24小时，测定OD₆₀₀。如图5所示，菌株ZT-MG2的最适温度为25℃-45℃。

实施例4光合细菌在实际模拟中对蓝藻的抑制

1、叶绿素a的测定

①取2mL混合均匀的藻液，3,000rpm离心15min，将上清去除，然后将藻体置于10mL离心管中，保存于-20℃超过12h。

②取90％乙醇于80-85℃的水浴锅中预热。

③离心管取出后立即加入8mL的热乙醇，然后置于80℃的水浴锅萃取2min。

④取出后立即用锡箔纸包裹，置于黑暗中避光萃取4-6h。

⑤取出后3,000rpm离心10min，得上清液。

⑥90％乙醇定容至10mL

⑦以90％的乙醇调0，测OD665和OD750。

⑧Cha＝(27.1×V1×OD665-OD750))/V2

V1：90％乙醇的体积；

V2：萃取的藻液的体积

2、藻毒素含量测定

1)每隔2天取1mL的充分混合的藻液，3,000rpm离心15min，取上清。

2)将剩下的藻体加入2mL的75％甲醇，于-70℃冷冻30min，然后于40℃水浴30min，然后震荡30min，接着6,000rpm离心15min，如此重复3次，合并收集上清。

3)将试剂盒室温平衡20min后，进行藻毒素测定

4)设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔先加入待测样品10μL，再加样本稀释液40μL；

5)随后标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。

6)弃去液体，在吸水纸上拍干，在每个孔内加入洗涤液350μL，静置1min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

7)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

8)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

3、对蓝藻抑制效果的测定的藻液样品来源是张家港鸿屹水产养殖中心的养殖水和其中的藻类，该藻类包括铜绿微囊藻和颤藻，在养殖水环境中，养殖水产品代谢废物以及其多余饵料导致水体中氮和磷的含量很高，而导致水体富营养化一个重要的原因就是由于大量营养盐的输入，故实验条件是在静置的养殖水中投加菌株ZT-MG2，并在不同的时间测定水体中蓝藻叶绿素a的含量，计算去除率。

1)将张家港营养丰盛的养殖水中的铜绿微囊藻进行富集培养，然后将培养至深绿色的铜绿微囊藻250mL加到350mm*40mm试管中，敞口放置。

2)接着将培养至对数期的光合细菌ZT-MG2按照1％和5‰接种量接入藻液中。

3)每2天测定叶绿素a的含量。

4)致死率的测定

由于铜绿微囊藻体积较小，显微镜下计数较困难，因此采用PI染色的方法染色计数，即

①每组均取混合均匀的藻液1mL,3,000rpm离心15min，弃去上清液

②加入稀释100倍的PI染色剂，避光染色10min后，弃去PI染色剂，然后加入200μL的PBS，3,000rpm离心10min，弃去上清，如此洗涤3次。

③将铜绿微囊藻的藻液混合均匀以后吸取20μL置于载玻片上，然后在激光共聚焦显微镜上进行观察。发红色荧光的藻体即为死亡藻体，无荧光发出的藻体即为存活藻体。根据致死率＝死亡藻体/总藻体计算致死率。

实验结果显示：

(1)经过8天实验周期以后，接入1％和5‰的ZT-MG2，其藻液的颜色变化如图8所示。从表观观察，绿色褪去，变成淡红色，结果表明：接入1％和5‰的ZT-MG2的处理组(右图)与不接入ZT-MG2的处理组(左图)相比，具有明显的抑制藻类生长的现象，且随着接菌量的增加，抑制效果也逐渐明显，如图9所示，该菌株以接菌量为1％接种到富营养化水体中在第2天对藻类的致死率到达45％，第四天达到90％，第八天达到97％。

(2)接种ZT-MG2的处理组到第8天时，1％接种量的处理组对于叶绿素a的减少已经达到85％以上，5‰接种量的处理组对于叶绿素a的减少已经达到77％，如图6所示。接种ZT-MG2的处理组在第8天检测藻毒素时，藻毒素含量明显减少，由2.5μg/mL减少到1.2μg/mL，减少量是不接种ZT-MG2处理组的50％以上，如图7所示，藻毒素含量明显减少。叶绿素a及藻毒素的减少量在藻类富集的水质检测中是一个反应水质状况的基础指标。实验结果表明：菌株ZT-MG2对于铜绿微囊藻具有明显抑制效果，且对于铜绿微囊藻产生的藻毒素具有明显的去除效果。

(3)由于铜绿微囊藻个体较小，采用显微镜计数较难，采用PI染色的方式来进行观察计数。由于PI是一种DNA结合性染料，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞，只能染细胞膜破裂的死亡细胞。在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡的细胞呈微弱红光，晚期凋亡的细胞红光加强，死亡细胞呈强红色荧光。如图10所示，CK组铜绿微囊藻的死亡数几乎为零，与其叶绿素a情况呈现出一致，几乎没有发生波动。1％接入的光合细菌会导致铜绿微囊藻的死亡数量明显变多，铜绿微囊藻的死亡数量呈现一个显著性上升的情况。说明ZT-MG2可以导致铜绿微囊藻的死亡，从而抑制了铜绿微囊藻的生长。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种沼泽红假单胞菌ZT-MG2在富营养化水体治理中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1357

<212> DNA

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 1

cggctgcccc cattgctggt tagcgcaccg tcttgcaggt aaagccaact cccatggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt ggcatgctga tccacgatta 120

ctagcgattc caacttcatg ggctcgagtt gcagagccca atccgaactg agacggcttt 180

ttgagatttg cgaagggtca ccccttagct tcccattgtc accgccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagc ccgtaagggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tcgcggctta 300

tcaccggcag tctccttaga gtgctcaact aaatggtagc aactaaggac gggggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtgctccag gctccgaaga gaaggtcacg tctctgcgac cggtcctgga catgtcaagg 480

gctggtaagg ttctgcgcgt tgcgtcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg aatgcttaaa 600

gcgttagctg cgccactagt gagtaaaccc actaacggct ggcattcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgtgcctc agcgtcagta 720

atggcccagt gagccgcctt cgccactggt gttcttgcga atatctacga atttcacctc 780

tacactcgca gttccactca cctctgccat actcaagact tccagtatca aaggcagttc 840

tggagttgag ctccaggctt tcacctctga cttagaaacc cgcctacgca ccctttacgc 900

ccagtgattc cgagcaacgc tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta 960

gccggggctt attcttgcgg taccgtcatt atcttcccgc acaaaagagc tttacaaccc 1020

tagggccttc atcactcacg cggcatggct ggatcaggct ttcgcccatt gtccaatatt 1080

ccccactgct gcctcccgta ggagtttgga ccgtgtctca gtcccaacgc gggcgatcat 1140

cctctcagac cagctactga tcgtcgcctt ggtgagccat tacctcacca actagctaat 1200

cagacgcggg ccgctctttc ggcgataaat ctttccccgt aagggcttat ccgctaatag 1260

cacaagtttc cctgtgttgt tccgaaccaa aaggtacgtt cccacgcgtt actcacccgt 1320

ctgccactga cgtattgcta cgcccgttcg actcgca 1357

Claims (10)

1.一种沼泽红假单胞菌菌株ZT-MG2，分类命名为：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，保藏编号为CGMCC NO.22804。

2.一种含有权利要求1所述的沼泽红假单胞菌菌株ZT-MG2的菌剂。

3.一种净化剂，所述净化剂中含有权利要求1所述的沼泽红假单胞菌菌株ZT-MG2。

4.根据权利要求3所述的净化剂，其特征在于，净化剂中活菌总浓度为1×10⁶～1×10¹⁰CFU/ml。

5.根据权利要求4所述的净化剂，其特征在于，净化剂中活菌总浓度为1×10⁷～1×10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求5所述的净化剂，其特征在于，净化剂中活菌总浓度为1×10⁸CFU/ml。

7.权利要求1所述的菌株ZT-MG2、权利要求2所述的菌剂、权利要求3～6任一项所述的净化剂在环境污水处理中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述环境污水为高富营养化水体。

9.权利要求1所述的菌株ZT-MG2、权利要求2所述的菌剂、权利要求3～6任一项所述的净化剂在富营养化污水藻类生长抑制中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述藻类为蓝藻，优选的，所述藻类为铜绿微囊藻或/和颤藻。

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