CN104560821B - 一种维氏硝化杆菌xy‑01及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种维氏硝化杆菌XY‑01，保藏号为CGMCC 10171，所述维氏硝化杆菌XY‑01可采用分批补料的方法进行发酵培养，培养产物可用于养殖水体亚硝酸盐氮的去除，可有效解决养殖水体中存在的亚硝酸盐积累问题，提高鱼虾产量，在水产养殖领域有广泛的应用前景。

Description

一种维氏硝化杆菌XY-01及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种维氏硝化杆菌(Nitrobacterwinogradskyi)XY-01及其培养方法与应用。
背景技术
亚硝酸盐即亚硝酸的盐类，含有亚硝酸根离子NO2 -，有毒，有致癌性，除硝酸银外，一般都易溶于水。碱金属盐较稳定，其他盐加热时都分解。既有氧化性又有还原性。大量用于化学合成、食品行业以及作为实验室必备的化学试剂。
在水产养殖中，鱼虾残饵及其***物在水中分解产生了大量的氨和有毒物质，再经过亚硝化菌和光合细菌的作用很快转化为亚硝酸，亚硝酸与水体中的金属离子结合会产生亚硝酸盐，除此之外，长时间不清除池底淤泥，养殖密度过大会导致水底缺氧，在微生物作用下，含氮有机物分解，也会以亚硝酸盐的形态存在于水体中导致亚硝酸盐积累。水生动物吸收过量亚硝酸盐，会影响血液中携氧细胞的运作，抑制了血液的载氧能力，严重可导致鱼虾大量死亡。
可见，亚硝酸盐积累是引起高密度水产养殖中鱼虾等水生动物中毒死亡的主要原因之一，寻求有效的亚硝酸盐降解方法，控制养殖后期池体中亚硝酸盐浓度是提高养殖成功率，增加亩产量的必经之路。
传统的氧化法或还原法虽然能安全有效的降低亚硝酸盐浓度，但是存在着维持时间短，水体亚硝酸盐容易反弹等缺点；物理吸附法虽然具有作用时间短、成本低等优点，但需要吸附剂的用量巨大；通过换水等间接方法处理显然也存在治标不治本的缺点。
因此，普通的物理化学法虽然能有一定的效果，但是存在着药剂需要量大、维持时间短、易反弹等诸多问题，因此，筛选能够高效降解亚硝酸盐的菌株并探索其高密度培养方法，成为水产养殖领域亟待解决的难题之一。
本发明公开的维氏硝化杆菌能在好氧条件下高效地降解水体中的亚硝酸盐，降低亚硝酸盐氮浓度，因此必将为水产养殖中微污染生态环境生物处理技术的发展做出积极的贡献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种维氏硝化杆菌XY-01，可有效降解水体中的亚硝酸盐。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于上述维氏硝化杆菌XY-01的培养方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于制备含上述维氏硝化杆菌XY-01的菌剂的方法及其由该方法制备的菌剂。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述维氏硝化杆菌XY-01或含上述维氏硝化杆菌XY-01的菌剂的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
本发明提供一种维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01，其保藏号为CGMCC 10171(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号、保藏日期：2014年12月15日，保藏编号：CGMCC 10171)。
优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，由污水处理厂活性污泥中筛选出来，其菌落在培养平板上呈透明圆形细小颗粒状，革兰氏染色呈阴性，通过16SrDNA测序鉴定为维氏硝化杆菌，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，具有较强的亚硝酸盐降解能力。
优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，可降解亚硝酸盐氮的浓度范围为≦615mg/L，优选的，≦400mg/L，更优选的，≦300mg/L，最优选的，≦200mg/L。
更优选的，所述维氏硝化杆菌XY-01在其培养液中的亚硝酸盐氮降解速率可达到60mg-N/(L·h)以上。优选可达73mg-N/(L·h)
本发明还提供一种用于上述维氏硝化杆菌XY-01的培养基，组分如下：每1L水中，
其中，离子溶液组分：每1L水含FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g。
优选的，所述培养基组分为：
每1L水中，
其中，离子溶液组分：每1L水含FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g。
更优选的，所述培养基组分为：
每1L水中，
其中，离子溶液组分：每1L水含FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g。
优选的，上述培养基，是由下述方法制备得到的：上述各组分按组方称量好后用水溶解制成备用培养基，于121℃，0.11Mpa下灭菌20-30min。
本发明还提供一种硝化杆菌XY-01的培养方法，用上述培养基进行培养。
优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01采用分批补料方式进行培养。更优选的，具体操作方法为：采用分光光度法测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于30mg/L时，补充40％的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L左右，培养至OD600达到0.3以上时结束培养。
本发明还提供一种上述硝化杆菌XY-01在制备水体处理菌剂中的用途。
本发明还提供一种菌剂，其中，该菌剂包括上述分离的硝化杆菌XY-01菌株。优选的，该菌剂还包括稳定剂和保护剂。
本发明还提供一种菌剂的制备方法，其中，该菌剂由上述硝化杆菌XY-01制备而得。优选的，该制备方法包括(1)硝化杆菌XY-01发酵液的浓缩；(2)加入稳定剂和保护剂。
优选的，发酵液的浓缩方法为将培养结束时得到的发酵液采用管式离心机浓缩至原体积的1/10，使其亚硝酸盐氮降解能力达到600mg-N/(L·h)以上，优选可达730mg-N/(L·h)。
优选的，稳定剂是终浓度为0.3‰的亚硝酸钠。保护剂优选为甘油、山梨醇、二甲基亚砜、海藻糖中的任一种或多种。
本发明还提供一种上述硝化杆菌XY-01菌株或者所述菌剂在水体处理中的应用。
本发明还提供一种水体处理方法，包括在水体中投放上述XY-01菌株或者上述菌剂。优选的，在好氧条件下，实现其降解亚硝酸盐的作用。
优选的，所述水体是养殖水体，更优选的，该养殖水体是富含亚硝酸盐的养殖水体。优选的，水体中亚硝酸盐氮的浓度范围为≦615mg/L，优选的，≦400mg/L，更优选的，≦300mg/L，最优选的，≦200mg/L。
优选的，所述菌株或者菌剂的接种量为每立方米水体6-2500mL(接种比例为0.006‰-2.5‰)，优选的接种量为每立方米水体10-2500mL(接种比例为0.01‰-2.5‰)，更优选的接种量为每立方米水体100-2500mL(接种比例为0.1‰-2.5‰)，其中菌株或者菌剂的OD600至少3，优选大于3，其亚硝酸盐氮降解能力达到600mg-N/(L·h)以上，优选可达730mg-N/(L·h)。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种维氏硝化杆菌XY-01(保藏号为CGMCC 10171)，并能够实现其高密度培养，培养产物经浓缩后可用于养殖水体中亚硝酸盐的降解，降解的亚硝酸盐浓度高，降解速率快，去除率接近100％。与物理、化学方法相比具有效果持久、不引入其它污染物等优点，在水产养殖领域有广泛的应用前景。
保藏信息
分类名词：维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年12月15日
保藏号：CGMCC 10171
附图说明
图1为维氏硝化杆菌XY-01培养液亚硝酸盐氮降解曲线
图2为维氏硝化杆菌XY-01接种比2.5‰条件下亚硝酸盐氮降解曲线
图3为维氏硝化杆菌XY-01接种比0.01‰条件下亚硝酸盐氮降解曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
在下面的实施例中所用的菌种均为维氏硝化杆菌XY-01，实施例中不同的培养基及溶液配方如下：
1.富集培养基：NaNO20.5g，NaCl 0.3g，MgSO40.14g，KH2PO40.136g，NaHCO31.6g，FeSO40.03g，蒸馏水1000mL，pH 8.4
2.发酵培养基1：Na2HPO41.7g，KH2PO40.18g，NaNO20.3g，MgSO4·7H2O 0.01g，CaCL20.001g，离子溶液1mL，pH 7.3，
离子溶液组分：FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g，水1L。
3.发酵培养基2：Na2HPO42.55g，KH2PO40.27g，NaNO21.2g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCL20.0019g，离子溶液10mL，pH 8.4，
离子溶液组分：FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g，水1L。
4.发酵培养基3：Na2HPO43.2g，KH2PO40.36g，NaNO23g，MgSO4·7H2O0.03g，CaCL20.003g，离子溶液20mL，pH 9，
离子溶液组分：FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g，水1L。
5.牛肉膏-蛋白胨培养基：牛肉膏-蛋白胨培养基：牛肉膏3g/L；蛋白胨10g/L；氯化钠5g/L,pH 7.4～7.6。
6.LB培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠5g/L,pH 7.0。
7.微污染水产养殖水：取自于天津市宝坻区热带鱼养殖塘和汉沽区南美白对虾养殖池塘。
实施例1 维氏硝化杆菌XY-01的筛选和鉴定
取水产养殖池塘底泥样品1g溶于配好的100mL富集分离培养基中，在30℃恒温箱中180r/min的条件下培养至检测不出亚硝酸盐氮，然后吸取5mL培养产物转接到新的培养基中继续培养，反复3次，最后将培养产物按梯度稀释，10-1、10-2…直至稀释到10-7，每个浓度下涂平板，挑取单菌落重复划线纯化2-3次，得到纯化菌株接入斜面上，经牛肉膏-蛋白胨培养基和LB培养基验证无异养菌生长；其菌落在培养平板上呈透明圆形细小颗粒状，革兰氏染色呈阴性，经过16SrDNA测序鉴定，确定为维氏硝化杆菌，该菌16SrDNA测序的序列如下：
SEQ ID NO.1：
GTCGGCTGCCTCCCTTGCGGGTTAGCGCACCGCCTTCAGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGGGCTCGGGTTGCAGAGCCCAATCCGAACTGAGACGGTTTTTTGAGATTTGCTAGGGGTCACCCCTTTGCTTCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCGGCTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGCAACTAAGGACGGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGCTCCATGCTCCGAAGAGAAGGTCACATCTCTGCGACCGGTCATGGACATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTAGTGAGTAAACCCACTAACGGCTGGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGCGTCAGTATCGGGCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAGTTCCACTCACCTCTCCCGAACTCAAGATCCTCAGTATCAAAGGCAGTTCTGGAGTTGAGCTCCAGGATTTCACCCCTGACTTAAAGACCCGCCTACGCACCCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGCAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTATTCTTGCGGTACCGTCATTATCTTCCCGCACAAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACAAGCTAATCAGACGCGGGCCGATCTTTCGGCGATAAATCTTTCCCCGTAAGGGCTTATCCGGTATTAGCCCAAGTTTCCCTGGGTTGTTCCGAACCAAAAGGTACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTGACGTATTGCTACGCCCGTTCGACTGCATGGTA。
实施例2 维氏硝化杆菌XY-01降解亚硝酸盐
具体实施步骤如下：菌株接种至发酵培养基1中，30℃振荡培养，按照《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(GB7493-87)》测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于30mg/L时，补充40％的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L左右，至菌浓为OD600达到0.3以上结束培养，9000r/min离心收集菌体，全部转接至相同量的发酵培养基2(亚硝酸盐氮浓度约为240mg/L)中，30℃、150r/min摇床振荡培养，每隔1h取样5mL，9000r/min离心取上清，测定亚硝酸盐氮浓度，绘制亚硝酸盐氮降解曲线，结果如图1所示，由图可知培养液的亚硝酸盐氮降解速率为73mg-N/(L·h)。
实施例3 维氏硝化杆菌XY-01降解亚硝酸盐
具体实施步骤如下：菌株接种至发酵培养基2中，30℃振荡培养，按照《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(GB7493-87)》测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于30mg/L时，补充40％的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L左右，至菌浓为OD600达到0.3以上结束培养，转接至发酵罐扩大培养至菌浓为OD600达到0.3以上，经管式离心机浓缩处理后，菌浓增加至OD600≈3.0，以2.5‰接种0.5mL该菌液至200mL发酵培养基3中，30℃、150r/min摇床振荡培养，每天取样5mL，9000r/min离心取上清，测定亚硝酸盐氮浓度，绘制亚硝酸盐氮降解曲线，结果如图2所示，由图可知，接种比为2.5‰的条件下，菌株XY-01接种至亚硝酸盐氮浓度为613mg/L培养基后，可快速适应环境，3天内可将亚硝酸盐氮浓度降至0.2mg/L，去除率接近100％。
实施例4 维氏硝化杆菌XY-01降解亚硝酸盐
处理对象为取自于天津市宝坻区热带鱼养殖塘的水体，运行方式为2L量杯内曝气培养。
具体实施步骤如下：菌株接种至发酵培养基1中，30℃振荡培养至菌浓为OD600达到0.3以上，转接至发酵罐扩大培养至菌浓为OD600达到0.3以上，经管式离心机浓缩处理后，菌浓增加至OD600≈3.0，以0.1‰接种量接种0.2mL该菌液于装有2L宝坻区热带鱼养殖塘水的量杯中，同时设置空白对照，并设一组平行，共4组，室温(20-25℃)下曝气运行3天；分别于反应第24h、第48h和第72h取样，9000r/min离心取上清，按照《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(GB7493-87)》测定亚硝酸盐氮。结果如表1所示，由表1可知，接种比为0.1‰的条件下，菌株XY-01可快速降解养殖水体中的亚硝酸盐，3天内可将亚硝酸盐氮浓度降至0.1mg/L左右，有效消除亚硝酸盐积累对水生生物的影响。
表1.维氏硝化杆菌XY-01小试亚硝酸盐氮降解数据
实施例5 维氏硝化杆菌XY-01降解亚硝酸盐
处理对象为取自于天津市汉沽区南美白对虾养殖塘的水体，运行方式为20L量杯内曝气培养。
具体实施步骤如下：菌株接种至发酵培养基2中，30℃振荡培养至菌浓为OD600达到0.3以上，转接至发酵罐扩大培养至菌浓为OD600达到0.3以上，经管式离心机浓缩处理后，菌浓增加至OD600≈3.0，以0.01‰接种量接种0.2mL该菌液分别于装有20L汉沽区南美白对虾养殖塘水和发酵培养基1(亚硝酸盐氮浓度调整为与该养殖水体相近的10mg/L左右)的量杯中，同时设置空白对照，共3组，室外(15-20℃)下曝气运行14天；每天取样5mL，9000r/min离心取上清，按照《水质 亚硝酸盐氮的测定 分光光度法(GB7493-87)》测定亚硝酸盐氮。结果如图3所示，由图可知，接种比为0.01‰、温度15-20℃的条件下，菌株XY-01接种至培养基和养殖水体后，都存在一定的延滞期，在培养基中，延滞期为4天，在养殖水体中，延滞期为8天，但经过延滞期后，可快速将***中的亚硝酸盐氮降至0.1mg/L左右。
实施例6 维氏硝化杆菌XY-01菌剂制备
具体实施步骤如下：菌株接种至发酵培养基1中，30℃振荡培养，按照《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(GB7493-87)》测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于30mg/L时，补充40％的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L左右，至菌浓为OD600达到0.3以上结束培养，经管式离心机浓缩至原体积的1/10，菌浓增加至OD600≈3.0，亚硝酸盐氮降解能力达到600mg-N/(L·h)以上，加入0.3‰的亚硝酸钠作为稳定剂，加入甘油、山梨醇、二甲基亚砜、海藻糖中的任一种或多种作为保护剂，即得到了维氏硝化杆菌XY-01菌剂。
实施例7 维氏硝化杆菌XY-01菌剂降解亚硝酸盐
处理对象为天津市汉沽区南美白虾塘的养殖水，其亚硝酸盐氮为9.8mg/L。运行方式为4500m3田间投加试验，池体中部设表面曝气机进行曝气处理。实验阶段为养殖后期，对虾浮头现象频繁，需每天使用化学增氧剂以防止对虾因窒息而死。
具体实施步骤如下：以0.006‰接种量接种27L维氏硝化杆菌XY-01菌剂于4500m3南美白对虾养殖水体中，以增氧曝气机在大田中间曝气处理；分别于第2d、第5d、第10d、第15d、第25d取样，9000r/min离心取上清，按照《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(GB7493-87)》测定亚硝酸盐氮。结果如表2所示，由表可知，投加菌剂后池体中的亚硝酸盐氮浓度持续降低，自第5d起，停止使用化学增氧剂，直至第25d养殖结束均为出现对虾浮头现象。
表2.维氏硝化杆菌XY-01大田实验亚硝酸盐氮降解数据
天数 亚硝酸盐氮(mg/L) 备注
0 9.8 投加维氏硝化杆菌XY-01菌剂共计27L
2 7.5
5 5.1
10 4.97
15 4.85
25 3.62
上述参照实施例对该株维氏硝化杆菌XY-01及其培养方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01，其特征在于：其保藏号为CGMCC No.10171。
2.根据权利要求1所述的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01，其特征在于：由污水处理厂活性污泥中筛选出来，其菌落在培养平板上呈透明圆形细小颗粒状，革兰氏染色呈阴性，通过16SrDNA测序鉴定为维氏硝化杆菌，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种权利要求1-2任一所述维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01的培养方法，其特征在于：采用以下培养基对其进行培养：
培养基组方如下：每1L水中，
固态加1.5％的琼脂，
离子溶液组分：每1L水含FeSO4·7H2O 1g，EDTA 1g，水1L。
4.权利要求3所述的培养方法，其特征在于：采用分批补料方式进行培养，具体操作方法为：采用分光光度法测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于30mg/L时，补充40％的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L，培养至OD600达到0.3以上时结束培养。
5.权利要求1-2任一所述的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01在制备水体处理菌剂中的用途。
6.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1-2任一所述的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01。
7.一种菌剂的制备方法，该制备方法包括(1)保藏号为CGMCC No.10171的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01发酵液的浓缩；(2)加入稳定剂和保护剂。
8.权利要求1-2任一所述的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01或权利要求6所述的菌剂在降解水体中亚硝酸盐氮的应用。
9.一种水体处理方法，其特征在于，包括在水体中投放权利要求1-2任一所述的维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)XY-01或者权利要求6所述的菌剂。
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