CN108611299B - 一株产抑菌肽的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产抑菌肽的植物乳杆菌，该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLY‑1，其于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15429。本发明还公开了上述产抑菌肽的植物乳杆菌YLY‑1在抑制醉螺腐败菌方面的应用。本发明的植物乳杆菌YLY‑1具有良好的耐受性，在酸性条件下稳定，产生的抑菌肽对泥螺腐败菌具有良好的抑菌效果，其在食品防腐中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌，尤其涉及一株产抑菌肽的植物乳杆菌以及其在抑制醉螺腐败菌方面的应用，属于食品微生物技术领域。
技术背景
目前，大量的食品防腐剂已应用于食品行业中，以防止食品腐败，从而延长食品货架期。其中，人工合成的化学防腐剂由于成本低、使用方便且防腐效果良好，在我国食品行业占有主导地位，但是这些人工合成防腐剂在使用中会对食品的口感、风味产生负面影响，并且会随着食品一起被机体摄取吸收，对机体造成一定的毒害作用。而动物、植物与微生物源的天然防腐剂因具有安全、无毒副作用、抗菌性强等特点，吸引着众多学者的目光，其中，微生物源如乳酸菌防腐剂由于产生菌种类多，来源广泛，不受原料的限制，受到学者更大的关注。因此，探寻安全无毒、抑菌谱广、抗菌性强的微生物源天然食品防腐保鲜剂已成为食品领域研亢热点。
乳酸菌是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，具有许多对人和动物健康有益的生理功能，常应用于发酵食品中，为食品提供了意想不到的风味和特殊的质地结构；更重要的是在代谢过程中能够产生有机酸、过氧化氢和乳酸菌素等抗菌物质，其中乳酸菌素在食品防腐保鲜中起到重要作用。鉴于乳酸菌的益生性，乳酸菌是目前公认的一种具有潜在开发价值的微生物源天然生物性食品防腐剂的产生菌。
乳酸菌抑菌肽是乳酸菌在代谢过程中产生的具有抑制其他微生物生长的蛋白质或多肽类物质。它可以有效抑制食品中致病菌和腐败菌的生长。乳酸菌产生的抑菌肽具有以下的特点，使得其成为食品天然防腐剂开发对象。(1)细菌生长繁殖快，生产周期短，适合工业化生产；(2)具有较好的稳定性，适合食品加工处理，使用方便；(3)能被人体内的蛋白酶降解，不在体内蓄积，不会对肠道正常菌群有影响；(4)不会产生耐药性，不会诱发食品病原菌等微生物对治疗用抗生素的抗性。
目前乳酸菌从乳制品、泡菜、人和动物的肠道、粪便、土壤等中分离的报道很多，然而，从鱼、贝等水生动物中分离乳酸菌的报道还较少，长期生活在水中的动物，由于其特殊的环境，肠道内的微生物必演化出自己独特的代谢途径，并产生许多结构新颖、作用独特并有别于陆源微生物的代谢产物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株产抑菌肽的植物乳杆菌YLY-1，该菌株从鲈鱼肠道中筛选出来，发酵产生的抑菌肽可以有效的抑制醉螺腐败菌的生长，具有安全无毒、抗菌性强、抑菌普广的特点。
本发明还要解决的技术问题是提供上述产抑菌肽的植物乳杆菌YLY-1在抑制醉螺腐败菌方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
本发明是以从南京市上海路副食品中心市场采集的鲈鱼肠道中分离筛选的乳酸菌为研亢对象，从中筛选出具有抑制食源性腐败菌与致病菌活性的产抑菌肽的乳酸菌。
本发明菌株分离自鲈鱼肠道，经MRS接种培养、分离纯化后获得的一株乳酸菌株，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLY-1，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该微生物保藏编号为CGMCC NO.15429，保藏日期为2018年3月8日。
该菌株的生物学性质如下：本发明植物乳杆菌YLY-1菌株来源于鲈鱼肠道，在MRS培养基中、 37℃厌氧条件下生长良好，菌落成圆形，直径大小0.8-1.5mm，白色菌落，不透明，表面光滑湿润，革兰氏染色呈阳性，显微镜观察下细胞形状为短杆状。
本发明产抑菌肽的乳酸菌菌株，经16s rDNA测序，采用BLAST分析法，将本发明植物乳杆菌 YLY-1的16s rDNA全序列与NCBI注册的植物乳杆菌的16s rDNA的基因序列比较，同源性为100％，得到植物乳杆菌。
上述植物乳杆菌的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1，乳酸菌的分离纯化：用MRS培养基从鲈鱼粪便中筛选分离出乳酸菌菌株，通过平板划线法纯化乳酸菌菌株，对纯化后菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，选取革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的菌株；
步骤2，产抑菌肽乳酸菌的筛选：将步骤1完全纯化的乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24小时，得到菌株发酵液，发酵液在4℃、10000r/min条件下，离心10分钟，保留上清液，用打孔器打孔法进行抑菌实验，实验过程中进行酸作用和过氧化氢作用的排除；最后筛选出排除酸作用和过氧化氢作用后仍有抑菌活性的产抑菌肽乳酸菌。
其中，步骤1中，从鲈鱼粪便中筛选分离出乳酸菌菌株采用平板稀释法，将稀释后的样品菌悬液涂布于添加溴甲酚紫的MRS固体平板上，在37℃条件下培养48h，选取培养基平板上成淡黄色的菌落进行四区划线。
上述产抑菌肽的植物乳杆菌YLY-1在抑制食物腐败菌方面的应用。
其中，所述食物腐败菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。
上述产抑菌肽的植物乳杆菌YLY-1在抑制醉螺腐败菌方面的应用。
其中，所述醉螺腐败菌为肠膜明串珠菌。
有益效果：本发明的植物乳杆菌YLY-1具有良好的耐受性，在酸性条件下稳定，产生的抑菌肽对泥螺腐败菌具有良好的抑菌效果，其在食品防腐中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明植物乳杆菌YLY-1在MRS固体培养基上的菌落形态；
图2为本发明植物乳杆菌YLY-1的革兰氏染色图片I；
图3为本发明植物乳杆菌YLY-1的革兰氏染色图片II；
图4为本发明植物乳杆菌YLY-1的16s rDNA全序列与NCBI注册的植物乳杆菌的16srDNA 基因序列比对结果；
图5为本发明植物乳杆菌YLY-1对泥螺腐败菌的抑菌效果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1：乳酸菌的分离纯化
取出鲈鱼粪便，称取1g置于盛有9mL无菌生理盐水的试管中，用涡旋混合器混匀；在无菌条件下，进行梯度稀释，分别从10-3、10-4、10-5三个稀释度的样品菌悬液中吸取0.1mL稀释液，分别涂布于添加溴甲酚紫的MRS固体平板上，在37℃条件下培养48h，选取培养基平板上成淡黄色的菌落进行四区划线，置于37℃条件下培养24～48h，重复划线2-3次，得到纯化后的菌株；对纯化后菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，选取革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶实验为阴性的菌株。
实施例2：产抑菌肽乳酸菌的筛选
(一)发酵上清液的制备
将实施例1得到的完全纯化的菌株接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24小时，得到菌株发酵液，发酵液在4℃、10000r/min条件下，离心10分钟，保留上清液。
(二)抑菌性乳酸菌的筛选
针对常见的引起食品腐败变质的腐败菌，选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。用步骤(一)所得发酵上清液通过打孔器打孔法进行抑菌实验，筛选出有抑菌活性的菌株。本发明菌株YLY-1在抑菌性乳酸菌筛选过程中具体结果见表1。
表1植物乳杆菌YLY-1发酵上清液对三种指示菌的体外抑菌性实验初筛结果
(三)酸抑制作用的排除
发酵上清液对指示菌的抑制很可能是代谢产物中的乳酸、乙酸和其它有机酸的作用结果，为排除这种可能，把待测乳酸菌发酵上清液的pH用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl调至5，用打孔器打孔法进行排酸实验，保留在排除酸作用后仍有抑菌圈的菌株。
(四)过氧化氢作用的排除
取2.0mL排除酸作用后仍有抑菌效果的菌株发酵液，将其pH调为7.0，加入20mg过氧化氢酶，轻轻摇晃至溶解，置于37℃保温2h，再将pH调为排除酸作用时所确定的对照pH，以未经过氧化氢酶处理的排酸发酵液作为对照，用打孔器打孔法进行抑菌实验。若菌株发酵液在排除酸、过氧化氢作用后仍有抑菌圈，抑菌作用就是该菌株所产生的抑菌肽的作用。
(五)蛋白酶酶解实验
取4份2.0mL排除酸、过氧化氢作用后仍有抑菌活性的菌株发酵液，调节pH值为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶各自作用的最适pH值(别为7.4、7.4、6.0和2.0)，按终浓度 1.0mg/mL的量加入各酶液，在适宜温度下反应4h后调回原始pH值，测定酶处理后与处理前的抑菌活性。
实验结果表明，本发明植物乳杆菌YLY-1能产生抑菌肽且抑菌作用良好，具体结果见表2。
表2为植物乳杆菌YLY-1发酵上清液对三种指示菌的体外抑菌性实验复筛结果
通过表2可以看出，对菌株进行蛋白酶酶解，酶解后的菌株发酵上清液对三种指示菌失去抑菌作用。
实施例3：产抑菌肽乳酸菌菌株的鉴定
将筛选出的一株产抑菌肽乳酸菌菌株YLY-1培养至对数生长期，提取其基因组DNA。利用引物(正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增出它的16s rDNA片段，送至生工生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为1505bp(见序列表，SEQ ID NO，1)。通过序列比对，证明为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)YLY-1。
实施例4：植物乳杆菌YLY-1抑菌肽对醉螺腐败菌的应用
(一)抑菌肽粗制品的制备
将植物乳杆菌YLY-1接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24小时，得到菌株发酵液，发酵液在4℃、10000r/min条件下，离心10分钟，保留上清液。将发酵上清液冷冻成粉末，得到粉末状抑菌肽，储存于4℃冰箱中。
(二)抑菌肽粗制品对醉螺中肠膜明串珠菌的抑菌效果
用10mL ddH2O回溶抑菌肽粉末作抑菌剂，用肠膜明串珠菌作指示菌，用打孔器打孔法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径。
实验结果表明，本发明的植物乳杆菌YLY-1产生的抑菌肽对醉螺腐败菌有良好的抑制作用，抑菌圈直径为17.36mm。具体结果如图5所示。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLY-1产生的抑菌肽对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的生长均有良好的抑制作用，具有良好的稳定性，并且可以被多种蛋白酶水解。本发明的植物乳杆菌YLY-1发酵上清液，经冷冻干燥后可以得到抑菌肽粗制品；该植物乳杆菌YLY-1产生的抑菌肽抑菌效果良好，具有较广的抑菌谱，并且安全无毒，可广泛用于食品的防腐保鲜，从而延长食品的货架期。
本发明植物乳杆菌菌株的保藏名称：YLY-1；
保藏号：CGMCCNO.15429；
保藏日期：2018-3-8；
保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一株产抑菌肽的植物乳杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1505
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
aggcttagct ccttgttcga cttcacccta atcatctgtc ccaccttagg cggctggttc 60
ctaaaaggtt accccaccga ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt 120
gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg 180
acttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aatggcttta agagattagc 240
ttactctcgc gagttcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt 300
cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc 360
tcaccagagt gcccaactta atgctggcaa ctgataataa gggttgcgct cgttgcggga 420
cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tatccatgtc 480
cccgaaggga acgtctaatc tcttagattt gcatagtatg tcaagacctg gtaaggttct 540
tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 600
ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt tagctgcagc 660
actgaagggc ggaaaccctc caacacttag cattcatcgt ttacggtatg gactaccagg 720
gtatctaatc ctgtttgcta cccatacttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaca 780
gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggagt 840
tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga tgcacttctt cggttgagcc 900
gaaggctttc acatcagact taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg 960
gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc 1020
tggttaaata ccgtcaatac ctgaacagtt actctcagat atgttcttct ttaacaacag 1080
agttttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag actttcgtcc 1140
attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc tcagtcccaa 1200
tgtggccgat taccctctca ggtcggctac gtatcattgc catggtgagc cgttacccca 1260
ccatctagct aatacgccgc gggaccatcc aaaagtgata gccgaagcca tctttcaagc 1320
tcggaccatg cggtccaagt tgttatgcgg tattagcatc tgtttccagg tgttatcccc 1380
cgcttctggg caggtttccc acgtgttact caccagttcg ccactcactc aaatgtaaat 1440
catgatgcaa gcaccaatca ataccagagt tcgttcgact gcatgtatag cacccgccat 1500
gccaa 1505
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggaggtga tccagccgca 20
Claims (3)
1.一株产抑菌肽的植物乳杆菌，其特征在于：该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) YLY-1，其于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15429。
2.权利要求1所述的产抑菌肽的植物乳杆菌在抑制食品中食物腐败菌方面的应用，其特征在于：所述食物腐败菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。
3.权利要求1所述的产抑菌肽的植物乳杆菌在抑制食品中醉螺腐败菌方面的应用，其特征在于：所述醉螺腐败菌为肠膜明串珠菌。
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