CN113373211A - 一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用，其包括检测CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点的特异性引物和探针。本发明检测特异性好，灵敏度高，耗时短，且成本低：其采用ARMS引物设计，引物错配碱基提高扩增的特异性，灵敏度高，最低10ngDNA起始量，即可对人CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点进行准确分型；PCR反应只需要不足1h就可以完成扩增反应，耗时较短，在临床上可以进行快速检测；所需试剂耗材均为临床上常见的试剂，成本较低，便于临床的推广。

Description

一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用。
背景技术
焦虑症是一种精神疾病，全球大约12％的人口患有焦虑症，女性发病率约是男性的两倍。焦虑症主要通过认知行为疗法和药物进行治疗。目前常用的抗焦虑药物包括苯二氮
Figure BDA0003085849020000011
类药物、β受体阻断剂、丁螺环酮等。焦虑症患者在治疗过程中常面临选药周期长，治疗效果不佳或药物毒副作用的风险。
药物基因组学检测有助于医生在给患者初次诊疗时，发现存在不良反应和治疗失败风险的个体，从而帮助医生选择合适的药物并制定科学的起始剂量；并在治疗过程中，从基因的角度寻找发生不良反应和无应答或应答率低的原因，有助于及时调整治疗方案，改善治疗效果。根据已有的多个针对抗精神类用药基因检测的社会经济学评估数据，药物基因组学在节省医疗成本、降低就医次数、提高治疗效果具有极大的帮助。
目前主要的抗焦虑药物包括奥沙西泮、劳拉西泮、咪达***等，奥沙西泮为***的主要活性代谢产物；而奥沙西泮和劳拉西泮片主要适用于焦虑障碍的短期治疗；而咪达***具有典型的苯二氮卓类药理活性，可产生抗焦虑、镇静、催眠、抗惊厥及肌肉松弛作用。
依据《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》2015年版和药物基因相关数据库pharmgkb的描述，CYP3A5参与咪达***的药物代谢，CYP3A5基因第3内含子内第22893位存在c.6986A>G的突变(rs776746，CYP3A5*3)，该突变可导致CYP3A5 mRNA异常剪接，引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白，从而使其失去酶的活性，导致咪达***代谢降和清除率低，导致血药浓度升高，引起不良反应的发生。而UGT2B15基因则参与了奥沙西泮和劳拉西泮的药物代谢，与CC型基因相比，AA型基因患者奥沙西泮和劳拉西泮清除率降低，因此对在选用焦虑症用药时对基因及其多态性检测是有必要的。
目前常采用的基因多态性检测技术主要包括测序技术、基因芯片技术、荧光PCR技术。而无论是一代测序技术还是二代测序技术均存有程序繁杂、耗时较长、操作繁琐、成本高等因素，限制了其在临床实验室的快速准确筛查；而基因芯片技术对设备和人员的要求都比较高，不适应少量位点的快速准备检测；荧光PCR技术进行多态性检测主要有TaqMan探针法和溶解曲线法，而目前针对CYP3A5基因rs776746多态性和UGT2B15基因rs1902023多态性检测的产品和相关文献中均较少见。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明提供一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用，其可对CYP3A5基因rs776746多态性和UGT2B15基因rs1902023多态性进行高灵敏度地检测，且耗时短，成本低。
本发明提供的技术方案为：
一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测的试剂盒，其包括检测CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点的特异性引物和探针。
进一步地，所述试剂盒包括检测CYP3A5基因rs776746位点的两个正向引物及一个反向共用引物、检测UGT2B15基因rs1902023位点的两个正向引物及一个反向共用引物。
进一步地，所述检测CYP3A5基因rs776746位点的引物为：
正向野生型引物rs776746-Wt：5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGACAC-3’(SEQ ID NO.1)；
正向突变型引物rs776746-Mt：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGACAT-3’(SEQ ID NO.2)；
反向共用引物rs776746-R：5’-GCCTTCAATTTTTCACTGACCT-3’(SEQ ID NO.3)；
所述检测UGT2B15基因rs1902023位点的引物为：
正向野生型引物rs1902023-Wt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTA-3’(SEQ IDNO.4)；
正向突变型引物rs1902023-Mt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTC-3’(SEQ IDNO.5)
反向共用引物rs1902023-R：5’-AAGCATTGCATAAGACCAGGAT-3’(SEQ ID NO.6)。
进一步地，所述探针包括CYP3A5共用探针rs776746-P和UGT2B15共用探针rs1902023-P，所述探针rs776746-P和rs1902023-P均为荧光探针；
所述探针rs776746-P序列为：5’-FAM-TTCGTTAAGCTGGGTGGTACATACGTGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.7)；所述探针rs1902023-P序列为：5’-FAM-AAGCCGAAGATGTCAACACAGTCACCTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.8)。
进一步地，其还包括内参基因CFTR的特异性引物和内参基因探针。
进一步地，所述内参基因的特异性引物为：
正向内参基因CFTR引物CFTR-F：5’-CCCCTTTTGTAGGAAGTCACC-3’(SEQID NO.9)
反向内参基因CFTR引物CFTR-R：5’-GCTGGGTGTAGGAGCAGTGT-3’(SEQID NO.10)。
进一步地，所述内参基因探针CFTR-P为荧光探针，其序列为：
5’-VIC-TATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-BHQ1-3’(SEQID NO.11)。
进一步地，其还包括质控样本，所述质控样本包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为根据人参考基因组序列信息分别制备的相应基因的纯合质粒，所述质粒载体为大肠杆菌载体，所述阴性质控品为纯化的净水。
进一步地，上述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒的使用方法为：
1)取上述的特异性引物与探针组合；
2)采用DNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA；
3)配置PCR反应体系：每个样本的每个位点分两个管子分别加入目的基因野生型或突变型的正向引物0.4μl，其他包括目的基因反向引物0.4μl，目的基因探针0.2μl，内参基因正向引物0.2μl，内参基因反向引物0.2μl，内参基因探针0.1μl，2x Master Mix(包含有PCR缓冲液，Taq酶，UNG酶)10μl，待测样本DNA，dd水补充至20μl体积；
4)PCR反应：将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ABI 7500上进行扩增，PCR完成后，根据扩增曲线的有无判断待测样本的基因型，PCR扩增条件：37℃，2min；95℃，1min；(95℃，15sec；60℃，30sec)40个循环，在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号，检测通道为：FAM和VIC。
本发明还提供了上述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒的应用，其在用于制备指导人焦虑症用药的试剂中的应用。
进一步地，所述药物包括但不限于奥沙西泮、咪达***、劳拉西泮。
采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
本发明分别利用CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点的特异性两条正向特异性引物和共用的1条反向引物、荧光标记的特异探针，利用荧光PCR扩增技术对模板DNA进行特异性扩增，利用内参基因的特异引物和探针监测反应体系是否出现异常扩增或扩增抑制，对相应引物反应对应的荧光PCR反应扩增曲线进行分析即可得到CYP3A5基因rs776746多态性和UGT2B15基因rs1902023多态性结果，其检测特异性好，灵敏度高，耗时短，且成本低：其采用ARMS引物设计，引物错配碱基提高扩增的特异性，灵敏度高，最低10ng DNA起始量，即可对人CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点进行准确分型；PCR反应只需要不足1h就可以完成扩增反应，耗时较短，在临床上可以进行快速检测；所需试剂耗材均为临床上常见的试剂，成本较低，便于临床的推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的rs776746位点基因型为CC型的样本扩增结果；
图2为本发明实施例1的rs776746位点基因型为TT型的样本扩增结果；
图3为本发明实施例1的rs776746位点基因型为CT型的样本扩增结果；
图4为本发明实施例1的rs1902023位点基因型为AA型的样本扩增结果；
图5为本发明实施例1的rs1902023位点基因型为CC型的样本扩增结果；
图6为本发明实施例1的rs1902023位点基因型为AC型的样本扩增结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，“第一特征”、“第二特征”可以包括一个或者更多个该特征。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1：一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其包括检测CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点的特异性引物和探针。
进一步地，所述试剂盒包括检测CYP3A5基因rs776746位点的两个正向引物及一个反向共用引物、检测UGT2B15基因rs1902023位点的两个正向引物及一个反向共用引物。
进一步地，所述检测CYP3A5基因rs776746位点的引物为：
正向野生型引物rs776746-Wt：5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGACAC-3’(SEQ ID NO.1)；
正向突变型引物rs776746-Mt：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGACAT-3’(SEQ ID NO.2)；
反向共用引物rs776746-R：5’-GCCTTCAATTTTTCACTGACCT-3’(SEQ ID NO.3)；
所述检测UGT2B15基因rs1902023位点的引物为：
正向野生型引物rs1902023-Wt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTA-3’(SEQ IDNO.4)；
正向突变型引物rs1902023-Mt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTC-3’(SEQ IDNO.5)；
反向共用引物rs1902023-R：5’-AAGCATTGCATAAGACCAGGAT-3’(SEQ ID NO.6)。。
进一步地，所述探针包括CYP3A5共用探针rs776746-P和UGT2B15共用探针rs1902023-P，所述探针rs776746-P和rs1902023-P均为荧光探针；
所述探针rs776746-P序列为：5’-FAM-TTCGTTAAGCTGGGTGGTACATACGTGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.7)；所述探针rs1902023-P序列为：5’-FAM-AAGCCGAAGATGTCAACACAGTCACCTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.8)。
进一步地，其还包括内参基因CFTR的特异性引物和内参基因探针。
进一步地，所述内参基因的特异性引物为：
正向内参基因CFTR引物CFTR-F：5’-CCCCTTTTGTAGGAAGTCACC-3’(SEQ ID NO.9)
反向内参基因CFTR引物CFTR-R：5’-GCTGGGTGTAGGAGCAGTGT-3’(SEQ ID NO.10)。
进一步地，所述内参基因探针CFTR-P为荧光探针，其序列为：
5’-VIC-TATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.11)。
进一步地，其还包括质控样本，所述质控样本包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为根据人参考基因组序列信息分别制备的相应基因的纯合质粒，所述质粒为PUC57，所述阴性质控品为纯化的净水。
本实施中的试剂盒的检测操作过程如下：
1)样本DNA提取及稀释
推荐使用商业化的DNA提取试剂盒提取人类样本基因组DNA，样本为外周血样本，具体地推荐使用凯杰或天根的全血DNA提取试剂盒进行提取，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其OD260/OD280的值应在1.8-2.0范围内，样本DNA质量不合格不得用于检测，提取完成后根据DNA浓度信息将样本稀释至10-30ng/μl用于PCR检测。
2)反应体系制备(见表1)：
每个基因位点(CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点)分别配置两管的反应体系，两个反应体系中分别加入野生型和突变型的上游引物，其他内容包括模板DNA，下游引物，荧光探针，荧光PCR-mix，内参基因引物，内参基因探针等；同时配置相应位点的阳性对照和阴性对照反应体系，阳性对照为包含有目的基因片段的质粒，阴性对照为纯化的dd水。
表1：PCR反应体系制备
Figure BDA0003085849020000051
备注：体系中各项试剂由诺唯赞公司提供，也可以从公开的渠道获得。
3)PCR反应：
将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ABI 7500上进行扩增，PCR扩增条件：37℃，2min；95℃，1min；(95℃，15sec；60℃，30sec)40个循环，在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号，检测通道为：FAM和VIC。
实验结果见图1至图6，从图1中可以看出该样本中的内参基因CFTR均正常扩增，rs776746野生型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs776746突变型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为CC纯合型。
从图2中则可以看出在该样本中内参基因CFTR均正常扩增，rs776746突变型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs776746野生型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为TT纯合型。
从图3中可以看出该样本中内参基因CFTR均正常扩增，rs776746野生型和突变型反应体系中FAM通道均正常扩增，表明该样本基因型为CT杂合型。
从图4中可以看出该样本中内参基因CFTR均正常扩增，rs1902023野性型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs776746突变型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为AA纯合型。
从图5中可以看出该样本中内参基因CFTR均正常扩增，rs1902023突变型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs776746野生型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为CC纯合型。
从图6中可以看出该样本中内参基因CFTR均正常扩增，rs1902023突变型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs776746野生型反应体系中FAM通道扩增，表明该样本基因型为AC杂合型，从实验结果可以明显看出，本发明的试剂盒的特异性好，能够高灵敏度的对CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点进行检测。
实施例2：一致性对比实验
随机选取100例人DNA样本分别按照本试剂盒检测方法和一代测序进行CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点检测分型，将二种方法实验结果进行比对(见表2)，发现二者之间的阴、阳性符合率均为100％。
表2:100例人DNA样本一代测序结果和ARMS-PCR分型结果
Figure BDA0003085849020000061
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州大学
河南申友医学检验所有限公司
<120> 一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用
<130> 2021
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtccaaaca gggaagagac ac 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtccaaac agggaagaga cat 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttcaatt tttcactgac ct 22
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattttcag aagagaatct tccaagta 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattttcag aagagaatct tccaagtc 28
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcattgca taagaccagg at 22
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcgttaagc tgggtggtac atacgtgg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 8
aagccgaaga tgtcaacaca gtcacctc 28
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 9
ccccttttgt aggaagtcac c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 10
gctgggtgta ggagcagtgt 20
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪(Artificial Sequence)
<400> 11
tatgacccgg ataacaagga ggaacgc 27

Claims (10)

1.一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，其包括检测CYP3A5基因rs776746位点和UGT2B15基因rs1902023位点的特异性引物和探针。
2.根据权利要求1所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测CYP3A5基因rs776746位点的两个正向引物及一个反向共用引物、检测UGT2B15基因rs1902023位点的两个正向引物及一个反向共用引物。
3.根据权利要求3所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，
所述检测CYP3A5基因rs776746位点的引物为：
正向野生型引物rs776746-Wt：5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGACAC-3’(SEQ ID NO.1)；
正向突变型引物rs776746-Mt：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGACAT-3’(SEQ ID NO.2)；
反向共用引物rs776746-R：5’-GCCTTCAATTTTTCACTGACCT-3’(SEQ ID NO.3)；
所述检测UGT2B15基因rs1902023位点的引物为：
正向野生型引物rs1902023-Wt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTA-3’(SEQ IDNO.4)；
正向突变型引物rs1902023-Mt：5’-GAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAGTC-3’(SEQ IDNO.5)；
反向共用引物rs1902023-R：5’-AAGCATTGCATAAGACCAGGAT-3’(SEQ ID NO.6)。
4.根据权利要求1所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，
所述探针包括CYP3A5共用探针rs776746-P和UGT2B15共用探针rs1902023-P，所述探针rs776746-P和rs1902023-P均为荧光探针；
所述探针rs776746-P序列为：5’-FAM-TTCGTTAAGCTGGGTGGTACATACGTGG-BHQ1-3’(SEQID NO.7)；所述探针rs1902023-P序列为：5’-FAM-AAGCCGAAGATGTCAACACAGTCACCTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.8)。
5.根据权利要求1所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，其还包括内参基因CFTR的特异性引物和内参基因探针。
6.根据权利要求5所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因的特异性引物为：
正向内参基因CFTR引物CFTR-F：5’-CCCCTTTTGTAGGAAGTCACC-3’(SEQ ID NO.9)；
反向内参基因CFTR引物CFTR-R：5’-GCTGGGTGTAGGAGCAGTGT-3’(SEQ ID NO.10)。
7.根据权利要求5所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，
所述内参基因探针CFTR-P为荧光探针，其序列为：
5’-VIC-TATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.11)。
8.根据权利要求1所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，其还包括质控样本，所述质控样本包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为根据人参考基因组序列信息分别制备的相应基因的纯合质粒，所述质粒载体为大肠杆菌载体，所述阴性质控品为纯化的净水。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，其使用方法为：
1)取权利要求3-7所述的特异性引物与探针组合；
2)采用DNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA；
3)配置PCR反应体系：每个样本的每个位点分两个管子分别加入目的基因野生型或突变型的正向引物0.4μl，其他包括目的基因反向引物0.4μl，目的基因探针0.2μl，内参基因正向引物0.2μl，内参基因反向引物0.2μl，内参基因探针0.1μl，2x Master Mix(包含有PCR缓冲液，Taq酶，UNG酶)10μl，待测样本DNA，dd水补充至20μl体积；
4)PCR反应：将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ABI 7500上进行扩增，PCR完成后，根据扩增曲线的有无判断待测样本的基因型，PCR扩增条件：37℃，2min；95℃，1min；(95℃，15sec；60℃，30sec)40个循环，在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号，检测通道为：FAM和VIC。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒，其特征在于，其在用于制备指导人焦虑症用药的试剂中的应用。
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