CN104805181A - 一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒 - Google Patents

一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒，引物序列如SEQ1～SEQ18所示。通过引物组合，这些引物可以通过特异性扩增，快速准确的对人类CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因的多态性进行分型检测。依据本发明可以进行基因分型或制备分型试剂盒，用于检测中国人群相关药物代谢能力(他克莫司，环孢素A等)，为专业医生确定最佳药物剂量和个体化用药提供参考依据，降低用药风险。

Description

一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒。
背景技术
临床常用免疫抑制剂他克莫司、环孢素A和雷帕霉素等药物避免器官移植的排斥反应，但此类药物最适剂量范围窄，临床应用中剂量不足将导致移植物的免疫排斥导致移植失败；剂量过高将造成严重的肝肾毒性等不良反应。目前临床常规给药方法是先给不同患者相同剂量的药物，然后通过实时检测患者服药后的血药浓度检测来调整剂量，但这种方案还是不能解决给药前根据患者个体差异确定给药剂量，还会造成移植失败或造成肝肾毒性等不良反应，无法实现个体化用药。
随着移植技术的进步和移植手术数量逐年提升，他克莫司和环孢素A等免疫抑制剂药物的个体化用药问题越来约受到重视。研究发现，他克莫司和环孢素A代谢在个体间差异主要与CYP3A代谢酶和药物转运体P糖蛋白(P-gp)相关，CYP3A参与药物代谢，P-pg主要影响药物的生物转运。影响这些酶表达量及活性与编码这些的基因多态性有直接关系。细胞色素P450(CYP450)是一大类药物代谢酶，参与许多药物的代谢。50％以上临床常用药物的氧化还原反应都通过CYP3A4和CYP3A5催化来完成。研究表明CYP3A4*1G(rs2242480)是汉族人中最常见的基因变异，对他克莫司的血药浓度/剂量比(C/D)有一定的影响，携带此突变会提高CYP3A4酶活性，使他克莫司清除率升高，血浆药物浓度降低。*3CYP3A5*3突变是CYP3A5最常见的突变，会引起其前体mRNA可变性剪接，产生不稳定蛋白，*3/*3患者不表达CYP3A5代谢酶，他克莫司的C/D值显著高于携带*1的患者。P-pg是多药耐药基因(MDR1)编码的产物，MDR1的3435 C/T(rs1045642)突变改变了P-pg在十二指肠的表达，影响了底物的肠道吸收。研究表明突变型TT型受者C/D明显高于野生型CC受者，而杂合子受者C/D居中；研究还发现3435 C/T多态会影响外周单核细胞(PBMC)内的他克莫司浓度。
因此，为了更早的了解药物代谢能力，实现个体化用药及时给予合理的最佳药物剂量，避免药物剂量不足和毒副作用的发生，需要通过检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性，判断酶的活性，给予最适剂量的药物避免用药不良反应的发生。
现有技术中采用直接测序检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性，成本高、操作程序复杂、耗时；杂交芯片检测方法存在假阳性率高、退火温度要求精确，特异性不高的问题；Taqman法探针制备以及配套使用的仪器设备昂贵，准确性不高。上述方法的局限性限制了CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性检测在临床的应用，需要一种快速准确无需昂贵设备的检验方法应用于临床。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题与不足，提供一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物，针对CYP3A4 rs2242480 C/T、CYP3A5 rs776746C/T和MDR1 rs1045642 C/T三个SNP位点进行基因分型，所述针对每个SNP的序列改变而设计的特异性引物和共用下游引物，特异性引物于3’末端第二位或三位引入错配碱基(下划线标记碱基)，以此扩大特异性引物3’末端碱基与DNA模版上SNP位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，从而大幅提高检测的特异性和准确性，其中：
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 C/T的共用下游引物为：
SEQ1：5’-CCCAGTGTACCTCTGAATTGC-3’；
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ2：5’-TCCTCCCTCCTTCTCCATGTCT-3’；
SEQ3：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGCAT-3’；
SEQ4：5’-TCCTCCCTCCTTCTCCATGGAT-3’；
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ5：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGTCC-3’；
SEQ6：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGCAC-3’；
SEQ7：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGGAC-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 C/T的共用下游引物为：
SEQ8：5’-AGGCAACATGACTTAGTAGACAGATG-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ9：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGACAT-3’；
SEQ10：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGAGAT-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ11：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGATCC-3’；
SEQ12：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGAGAC-3’；
SEQ13：5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGACAC-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 C/T的共用下游引物为：
SEQ14：5’-CCAGTTCTCCTATCCCAGAAATGT-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ15：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGGTT-3’；
SEQ16：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGTTT-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ17：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGGTC-3’；
SEQ18：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGTTC-3’。
优选：
检测位点为CYP3A4 rs2242480 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1以及SEQ4；
检测位点为CYP3A4 rs2242480 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1以及SEQ7；
检测位点为CYP3A5 rs776746 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8以及SEQ9；
检测位点为CYP3A5 rs776746 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8以及SEQ13；
检测位点为MDR1 rs1045642 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14以及SEQ16；
检测位点为MDR1 rs1045642 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14以及SEQ18。
上述的一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物制备的CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因分型试剂盒。
本发明设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，具体有益效果如下：
1、回避了家族基因间序列相近区域，避免家族基因间序列的相近区域引起的非特异性扩增，此引物组的设计具有特异性强的优点。
2、引入的碱基错配，提高了引物对SNP的识别能力，使引物能有效识别一个碱基的差异，扩大了最适退火温度范围，避免了因退火温度要求精确所导致检测结果的假阳性发生，提高了检测准确性和可靠性。
3、检测方法简单，无需昂贵设备，仅需要PCR和电泳设备就能完成试验。
4、操作快速便捷，检测用时短，可在2小时内完成分型工作。
附图说明
图1是本发明试剂盒分型结果电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明依据ARMs-PCR原理，优选了15条特异性引物，包括针对rs2242480 T的三条特异性引物(SEQ2、SEQ3、SEQ4)；针对rs2242480 C的三条特异性引物这些引物(SEQ5、SEQ6、SEQ7)；针对rs776746 T的两条特异性引物(SEQ9、SEQ10)；针对rs776746 C的三条特异性引物(SEQ11、SEQ12、SEQ13)；针对rs1045642T的两条特异性引物(SEQ15、SEQ16)；针对rs1045642 C的两条特异性引物(SEQ17、SEQ18)。这15条特异性引物的3’端碱基与对应SNP位点的两种不同的碱基相互补，并在3’末端的第二位或第三位引入错配碱基，错配碱基的引入可以扩大特异性引物与互补的模版和非互补模版结合后的扩增效率差异，使特异性引物的最佳退火范围扩大，避免非特异性扩增的产生，提高了检测的准确性和特异性。经实验测试，这些引物可在55度～60度范围内进行退火，进行特异性扩增，最大可能的避免了假阳性的发生。
本发明还优选了3条共用下游引物，包括针对rs2242480的SEQ1；针对rs776746的SEQ 8；针对rs1045642的SEQ14。这3条引物通过在人类基因组数据库中检测，回避了家族基因间基因序列的一致的区域，避免与目的片段外模版序列的结合，提高了扩增的特异性。
本发明可选取针对同一检测位点的特异性引物中的任意一条和其对应的下游共用引物结合，组成此为点的检测引物组合，实现对检测位点的特异性扩增检测。检测位点为CYP3A4 rs2242480 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1，以及SEQ2、SEQ3、SEQ4三条特异性引物中任意一条；检测位点为CYP3A4rs2242480C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1，以及SEQ5、SEQ6、SEQ7三条特异性引物中任意一条；检测位点为CYP3A5rs776746 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8，以及SEQ9、SEQ10两条特异性引物中任意一条；检测位点为CYP3A5 rs776746 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8，以及SEQ11、SEQ12、SEQ13三条特异性引物中任意一条；检测位点为MDR1 rs1045642 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14，以及SEQ15、SEQ16两条特异性引物中任意一条；检测位点为MDR1 rs1045642 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14，以及SEQ17、SEQ18两条特异性引物中任意一条。
以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定
实施例1一种基于ARMs-PCR法的人类CYP 3A4，CYP 3A5，ABCB1基因分型检测试剂盒
试剂盒包含预分装引物的PCR管，扩增反应液。
扩增反应液为44ul，包含PCR buffer、dNTP、高密度试剂和热启动Taq聚合酶。
PCR反应管每人份7个，1～6号管为特异性反应管，7号管为阴性对照管，每管中预分装混合液7ul，包含示踪染料和各3×10-3nMol的引物，各管组份如下：
实施例2配合使用试剂盒对人类CYP 3A4，CYP 3A5，ABCB1基因分型检测的方法和操作步骤。
1提取受检者全血DNA，稀释成20～50ng/ul的DNA溶液；
2取出扩增反应液融化混匀后取8ul加入到7号反应管；
3剩余扩增反应液中加入20ulDNA溶液，混合均匀后向1～6号反应管内各加入8ul；
4 PCR仪上进行扩增，扩增程序为：
5反应结束后每孔取8ulPCR产物，加入到2％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL的EB或0.01％的GoodView II)的加样孔中，在10-15V/cm胶长的电压下电泳；
6在凝胶成像***中拍照，获得电泳结果图(见图1，左侧1～3排为28号标本3次分型结果，基因分型结果为CYP3A4 rs2242480 TT、CYP3A5 rs776746 TT和MDR1 rs1045642 CT；左侧4～6排为33号标本3次分型结果，基因分型结果为CYP3A4 rs2242480 CC、CYP3A5rs776746 CC和MDR1 rs1045642 CC；右侧1～3排为35号标本3次分型结果，基因分型结果为CYP3A4 rs2242480 CC、CYP3A5 rs776746 CC和MDR1 rs1045642 TT；右侧4～6排为36号标本3次分型结果，基因分型结果为CYP3A4 rs2242480 CT、CYP3A5 rs776746TT和MDR1 rs1045642 TT)，根据目的条带的有无，进行基因型分析，方法如下：
1)7号管为阴性对照管，用于判断反应试验环境是否存在DNA污染，当7号孔出现830bp产物带则此批实验结果无效，需清除环境污染因素后再进行实验。
2)1～6号反应管中，如无任何产物带，仅有引物二聚体带(小于100bp)，判断为扩增失败。
3)1～6号反应管中，如只出现830bp一条内参产物带，无目的产物，则判读为阴性，代表受检者不携带相应的检测位点。
4)1～6号反应管中，如出现300～350bp的目的产物带，则判读为阳性，代表受检者携带相应的检测位点，阳性反应的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶和反应原料的结果，可认定为阳性反应。
5)具体分型结果参加下表：
人类CYP 3A4，CYP 3A5，ABCB1基因分型试剂盒结果分型表
图1是4个不同基因型标本，使用此试剂盒三次重复实验的分型结果，根据上表28号标本CYP 3A4，CYP 3A5，ABCB1基因分型结果为：TT、TT、CT；33号标本分型结果为：CC、CC、CC；35号标本分型结果为：CC、CC、TT；36号标本分型结果为：CT、TT、TT，各标本三次重复实验检测结果一致。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物，其特征在于，针对CYP3A4 rs2242480 C/T、CYP3A5 rs776746 C/T和MDR1 rs1045642 C/T三个SNP位点进行基因分型，所述针对每个SNP的序列改变而设计的特异性引物和共用下游引物，特异性引物于3’末端第二位或三位引入错配碱基，以此扩大特异性引物3’末端碱基与DNA模版上SNP位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，提高检测的特异性和准确性，其中：
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 C/T的共用下游引物为：
SEQ1：5’-CCCAGTGTACCTCTGAATTGC-3’；
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ2：5’-TCCTCCCTCCTTCTCCATGTCT-3’；
SEQ3：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGCAT-3’；
SEQ4：5’-TCCTCCCTCCTTCTCCATGGAT-3’；
用于检测位点CYP3A4 rs2242480 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ5：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGTCC-3’；
SEQ6：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGCAC-3’；
SEQ7：5’-CCTCCCTCCTTCTCCATGGAC-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 C/T的共用下游引物为：
SEQ8：5’-AGGCAACATGACTTAGTAGACAGATG-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ9：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGACAT-3’；
SEQ10：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGAGAT-3’；
用于检测位点CYP3A5 rs776746 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ11：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGATCC-3’；
SEQ12：5’-TGGTCCAAACAGGGAAGAGAGAC-3’；
SEQ13：5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGACAC-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 C/T的共用下游引物为：
SEQ14：5’-CCAGTTCTCCTATCCCAGAAATGT-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 T的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ15：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGGTT-3’；
SEQ16：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGTTT-3’；
用于检测位点MDR1 rs1045642 C的特异性引物为下列核苷酸序列之一：
SEQ17：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGGTC-3’；
SEQ18：5’-GGTGGTGTCACAGGAAGAGTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物，其特征在于：
检测位点为CYP3A4 rs2242480 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1以及SEQ4；
检测位点为CYP3A4 rs2242480 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ1以及SEQ7；
检测位点为CYP3A5 rs776746 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8以及SEQ9；
检测位点为CYP3A5 rs776746 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ8以及SEQ13；
检测位点为MDR1 rs1045642 T时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14以及SEQ16；
检测位点为MDR1 rs1045642 C时，使用引物组合为共用下游引物SEQ14以及SEQ18。
3.如权利要求1所述的一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物制备的CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因分型试剂盒。
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