BRAF基因突变检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域,具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的BRAF基因突变的快速检测。
背景技术
世界卫生组织在2014年的世界癌症日到来之际发表《世界癌症报告》称,癌症已经成为全世界人类最大致死原因,发病率和死亡率均呈持续上升趋势。全球癌症发病率四年中升高11%,到2012年约有1410万病例,因癌症死亡人数高达820万。2012年的全球癌症新病例中有一半发生在亚洲,其中大部份发生在中国大陆。并预测未来20年内,世界癌症病例将增长75%,达到近2500万。中国肿瘤登记中心2013年初发布《2012中国肿瘤登记年报》显示,中国每年新发癌症病例约达312万,死亡病例超过200万,每分钟有6个人被确诊为癌症,每天有8550人成为癌症患者,每7到8人中就有一人因癌症而死。肺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌成为中国人患病最多的癌症,乳腺癌、结直肠癌等癌症患者亦呈明显上升趋势。随着环境恶化,水质污染、雾霾以及食品安全方面形势的逐步严峻,专家预测,中国每年的癌症新发病例总数到2020年将达到400万左右,每年病例总数将达到600万。
结直肠癌是世界第三大常见恶性肿瘤,每年导致近60万人死亡。中国近年来结直肠癌发病率及死亡率均快速上升,结直肠癌在肿瘤发病中排位第三,平均每1.5分钟就有1人被诊断为结直肠癌,随着城市化进程和人口老龄化,未来中国结直肠癌发病率预计还将继续升高。
BRAF是RAF基因家族(BRAF、ARAF1、RAF1)中的一员,编码一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,该激酶可以帮助信号从RAS转导至MEK1/2,是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号通路重要的转导因子,参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生物学事件.大约15%的结直肠癌中存在BRAF基因突变,该突变主要见于BRAF基因11和15外显子的激酶结构域内,80%以上的突变都是15外显子1799位核苷酸上的单碱基颠换(V600E),致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸,在599位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近***了一个负性调节残基,使BRAF基因与维持其失活态的ATP结合环活化区的联系中断,从而级联式激活,并通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化,最终导致肿瘤的形成。
BRAF突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关,如黑色素瘤、***状甲状腺、结直肠癌等。研究发现,约66%恶性黑色素瘤存在BRAF基因突变,其中约80-90%为V600E突变,针对BRAF基因突变所研发的新型靶向药物威罗菲尼(Vemurafenib)对BRAF基因V600E 突变的患者疗效显著。在结直肠癌中,KRAS野生型的患者有14%存在BRAF V600E突变。BRAF基因突变的患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药,因此,美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》(2013)建议,在使用爱必妥(Cetuximab)或帕尼单抗(PanitμMμMab)等靶向药物时,对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因状态。
目前肿瘤相关基因突变检测方法主要有直接测序法(DNA sequencing)、实时荧光定量法(qPCR,包括Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR等)、高分辨率熔解曲线(HRM)、PCR与质谱(mass spectrometry)及高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)联合检测法等。肿瘤相关基因表达水平的检测主要依赖于qPCR及基因芯片技术。直接测序法一直以来被认为是检测基因突变的金标准,该法费用较低,但操作耗时长,并且它有两个明显的缺点:一是灵敏度低,一般需要突变基因丰度达到20%以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理,容易出现污染导致结果不准确。荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR,qPCR)作为新一代分子生物学研究工具,已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台,广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。肿瘤的异质性决定了肿瘤标本绝大多数为混合标本,通常情况下,微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时,此时大量野生型模板优势扩增,导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此目前的qPCR和HRM技术最高也只能检测到1%的突变体。
随着近年来肿瘤基因组测序方面研究的发展,人们发现,几乎所有的癌症患者的肿瘤组织中都存在某些体细胞的变异,而这些变异在正常人中检测不到。有些基因突变不仅仅可以作为癌症早期检测的分子指标,还可以为分子靶向治疗提供用药指导,如EGFR、KRAS、BRAF基因等。
肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA,这些变异DNA也随之释放到外周血中,被称为循环肿瘤DNA(circμLating tμMor DNAs)。研究发现,ctDNAs在早期原位癌(primary cancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA的半衰期短,因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。
但是,由于外周血循环DNA含量很少,其中肿瘤特异性的突变DNA含量更是少之又少,尤其是早期癌症患者,在常规的核酸扩增体系中,微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时,大量野生型模板优势扩增,导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出BRAF基因突变的产品及方法,以便及时准确地获得BRAF基因突变的信息。
本发明拟公开一种人BRAF基因突变检测试剂盒的制备方法及其应用。所述的试剂盒采用 新型位点特异性扩增引物选择性放大BRAF基因突变DNA,新型封闭探针封阻野生型BRAF基因模板,进一步提高突变模板选择性放大的特异性。该试剂盒检测特异性高,灵敏度高,检测低丰度BRAF突变的敏感性可达0.01%~0.1%。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患B-Raf基因突变情况,为临床医生用药提供指导和依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、高灵敏的BRAF基因突变检测试剂盒。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大BRAF基因突变DNA,新型封闭探针封阻野生型BRAF基因模板,进一步提高突变模板选择性放大的特异性。其优势主要体现在将突变检测敏感度由目前市场上同类试剂盒检测BRAF基因突变的1%提高到0.01%~0.1%,检测特异性高,灵敏度高,可应用于除组织标本外的血清、血浆等标本的非创伤性检测。
本发明提供了一套用于检测BRAF基因突变的引物、探针及检测试剂盒,发明相关内容表述如下:
BRAF基因突变检测试剂盒,包括引物探针混合液(含用于突变特异性扩增BRAF基因靶向序列的上游突变特异性引物2条,可检测V600E、V600R、V600K、V600D四种突变、下游通用引物1条、野生序列封阻探针一条,TaqMan荧光探针1条,引物2.5μM,荧光探针1μM,封阻探针4μM),2×PCR反应液(含DNA聚合酶,dNTP,dUTP,UNG酶,Mg2+等),外参基因,阳性参比品、阴性参比品和无RNA酶和DNA酶的无菌水。
所述的引物包含BRAF基因第600密码子常见突变特异的上游突变引物2条、下游通用引物1条。
所述的上游突变引物特征是3’末端为突变碱基,该碱基锁核酸修饰。引物的Tm值在40℃~57℃,低于PCR反应复性温度5℃~10℃,以提高突变检测的特异性。
BEF:5’-gtgattttggtctagctacaga-3’Seq ID No.1
BKF:5’-gtgattttggtctagctacaa-3’Seq ID No.2
所述的下游通用引物为BRAF基因第600密码子下游50~500碱基对范围内的一段序列,该序列对突变没有选择性,可扩增所有的BRAF基因。
B1R1:5’-tttgtgaatactgggaacta-3’Seq ID No.3
所述的探针包括封阻探针一条,BRAF基因特异性TaqMan荧光探针1条和外参序列特异性TaqMan荧光探针1条。
所述的封阻探针与BRAF基因第600密码子野生型互补,其5’端锁核酸修饰,提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力;第600密码子至少1-2个碱基LNA 修饰,提高封阻探针的单碱基识别能力,前面有+的碱基为锁核酸碱基。
BBF:5’-+gctaca+g+tgaaatctcgatg-P04-3’Seq ID No.4
BRAF基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团,3’端标记荧光淬灭基团。
Bp:5’-ttttgtggatggtaagaattg-3’Seq ID No.5
所述的2×PCR反应液每10μL含:0.25~1U DNA聚合酶,100~300μM dATP,100~300μM dCTP,100~300μM dGTP,80~300μM dTTP,40~150μM dUTP,0.25~2U UNG酶,1~4mMMgCl2等。优选的:0.5U DNA聚合酶,150μM dATP,150μM dCTP,150μM dGTP,100μM dTTP,50μM dUTP,0.5U UNG酶,2mM MgCl2。
所述阳性参比品为BRAF突变阳性序列,可以为纯化PCR产物或者嵌入BRAF基因的人工质粒。
阴性参比品为BRAF野生型序列,可以为纯化PCR产物或者嵌入BRAF基因的人工质粒。
本发明提供了一套BRAF基因突变的检测方法,具体来说包括以下步骤:
[1]根据COSMIC数据公布的人类BRAF基因为野生型基因序列,针对BRAF的突变热点设计特异性引物和探针。
[2]提取检测样本中基因组DNA,检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、血浆等。
[3]配制实时荧光PCR扩增反应体系。
[4]根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测BRAF基因突变情况:Ct值为0或大于35判为阴性:Ct值小于等于35判为阳性。当阴性参比品Ct值为0或大于40,阳性参比品Ct值大于26小于29时结果可信。
本发明采用了特异性引物选择性扩增BRAF基因突变序列,用高效封阻探针封闭野生型DNA序列对引物对突变型序列进行信号放大时可能造成的干扰,该方法具有以下优势:
[1]灵敏度高,可以检出低至5-10拷贝的突变;
[2]特异性强,5~20ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号;
[3]检测速度快,检测过程只需要90分钟即可完成。
[4]稳定率高。通常肿瘤标本中突变的DNA模板序列的绝对数并不高,尤其是外周血循环血DNA,多数标本处于1%~10%之间,突变检测敏感度在1%左右的方法常常对其临界含量,也就是突变含量1%~5%的标本检测稳定性不佳。我们的方法可以检测低至0.01%~0.1%的突变,就大大保证了1%~10%之间标本的检测稳定性。
附图说明
图1为含封阻探针及不含封阻探针检测结果比价。
图2为BRAF基因突变检测试剂盒检测BRAF基因人工质粒。
A:DNA终浓度为1×104拷贝copies/μL
B:DNA终浓度为1×103拷贝copies/μL
具体实施方式
下面用具体的实施例来解释本发明的突出的特点和显著进步,但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1:本发明提供的试剂盒检测BRAF基因人工质粒
1、人工质粒DNA纯化
用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)试剂盒纯化BRAF野生型和V600E突变人工质粒,方法如下:
取1.5mL菌液,8000rpm离心3min收集菌体,加入将含有RNase A酶的P1缓冲液250μL混匀,再加入相同体积的P2缓冲液,上下混匀至溶液变清(不要将反应时间超过5min),加入350μLN3缓冲液,立刻混匀,13000rpm离心10min,上清液转移至QIAprep spin管中,13000rpm离心1min,弃液体;用0.5mL PB清洗一次,再加含无水乙醇的PE缓冲液0.75mL洗涤2次,将QIAprep spin移至新1.5mL离心管中,加50μL无菌水,静置1min,离心1min,收集滤液。
纯化后的质粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量,用TE缓冲液稀释到DNA终浓度分别为1×104拷贝copies/μL、1×103拷贝copies/μL,突变质粒含量分别是0.01%、。0.1%、1%、10%、100%。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置,同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。:
3、PCR反应及数据分析
反应条件为:95℃预变性10min,随后94℃15s,60℃20s,共15个循环;然后94℃15s,58℃20s检测FAM荧光信号,共35个循环。
图2是用PCR反应结果,DNA总量为5×103拷贝可以检测低至0.1%的突变,DNA总量为5×104拷贝可以检测低至0.01%的突变。
实施例2:本发明提供的试剂盒检测新鲜组织标本
1、组织标本中基因组DNA纯化
用QIAamp DNA Mini(Qiagen)试剂盒纯化新鲜组织标本中的基因组DNA(已确定KRAS突变阴性),方法如下:
取新鲜组织25mg以内用剪刀剪切样本至小碎片,放在1.5mL离心管中,加入180μL ATL,20μL蛋白酶K,混匀,56℃孵育1~3h至样本溶解,每小时振荡2~3次;加入200μL AL,振荡15秒,70℃孵育10min;然后加入200μL无水乙醇,振荡15秒,小心将液体(包括沉淀)移至试剂盒提供柱子中,不要污染管口,8000rpm离心1min后,将柱子新的2mL离心管中,小心加入500μL AW1缓冲液,8000rpm离心1min,弃滤液;小心加入500μL AW2缓冲液,13000rpm离心3min,柱子转移至新的1.5mL离心管中,全速离心1min,再将柱子转移至另一新的1.5mL离心管中,小心加入200μL AE或蒸馏水,室温静置1min,8000rpm离心1min,收集滤液。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量,DNA浓度在20ng/μL~200ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置,同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。:
3、PCR反应及数据分析
反应条件为:95℃预变性10min,随后94℃15s,60℃20s,共15个循环;然后94℃15s,58℃20s检测FAM荧光信号,共35个循环。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较,组织标本的试剂盒突变检出率与DNA测序结果相同。
实施例3:本发明提供的试剂盒检测血浆标本
1、血浆标本中基因组DNA纯化
收集80份结直肠癌患者外周血标本和20份健康人外周血标本各5mL,2500rpm离心10分钟,吸取上清2mL用于循环游离DNA纯化。
用QIAampDNABloodMidi(Qiagen)试剂盒纯化血浆标本中的循环游离DNA,方法如下:
2mL血清(或全血)加入200μL PK和2mL AL,彻底混匀15秒,56℃孵育10min;加入2mL无水乙醇,彻底混匀15秒,将液体转移到QIAamp Midi Spin Column中,8000rpm离心2min,弃滤液;再离心一次,将柱子转移到另一收集管中,加入5mLAW1缓冲液,8000rpm离心1min,弃滤液,加入5mLAW2缓冲液,13000rpm离心1min,弃滤液,13000rpm离心3min,将柱子转移到一干净收集管中,加入100μL AE,室温放置1min,8000rpm离心1min,收集滤液为DNA标本。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量,DNA浓度在6ng/μL~40ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置,同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。:
3、PCR反应及数据分析
反应条件为:95℃预变性10min,随后94℃15s,60℃20s,共15个循环;然后94℃15s,58℃20s检测FAM荧光信号,共35个循环。
图2是用PCR反应结果,DNA总量为5×103拷贝可以检测低至0.1%的突变,DNA总量为5×104拷贝可以检测低至0.01%的突变。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较,癌症患者中,试剂盒突变检出率高于DNA测序;正常人中没有检出突变,试剂盒与DNA测序结果相同。