CN112481374B - Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112481374B CN112481374B CN202110001191.3A CN202110001191A CN112481374B CN 112481374 B CN112481374 B CN 112481374B CN 202110001191 A CN202110001191 A CN 202110001191A CN 112481374 B CN112481374 B CN 112481374B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- probe
- concentration
- mol
- reaction solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种用于人类白细胞抗原B位点1502基因型（HLA‑B*1502）检测的试剂、其在制备指导卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪等抗癫痫药物用药的试剂盒中的用途、相应的试剂盒及其检测方法。HLA‑B*1502基因分型采用PCR‑荧光探针法进行3组MIX反应液的检测，通过扩增反应循环扩增靶核酸分子，使荧光发生基团与被扩增的靶核苷酸序列间接结合；测定荧光发生基团产生的荧光量，确定靶核苷酸的存在。检测试剂包括：3组MIX反应液的核酸扩增体系，均含有能与靶核苷酸结合的上游引物1和下游引物1、能与靶核苷酸结合的上游引物2和下游引物2；3组配合核酸扩增体系使用的荧光检测体系的探针1‑探针4。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种临床上用于卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪等抗癫痫治疗药物用药指导的人类白细胞抗原B位点1502基因(HLA-B*1502)检测的检测试剂、检测方法及试剂盒。本发明还包括上述检测试剂在制备用于癫痫患者服用卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪等抗癫痫治疗用药指导的试剂盒中的用途、相应的试剂盒及其使用方法。
背景技术
精神疾病已成为全球高发疾病。据统计，我国成年人中有超过17％的人深受精神***症、癫痫等精神疾病的困扰(Phillips.2009)。癫痫被世界卫生组织(WHO)和国际抗癫痫联盟(ILAE)定义为：由多种病因引起的一种慢性脑部疾病，主要特点是由于大脑神经元反复、过度的同步化放电并导致发作性、突然性、短暂性的脑功能紊乱，同时伴有临床各型癫痫发作和脑电图痫性波及其他的异常改变。
癫痫在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，但以儿童和青少年发病率较高。据WHO估计，全球大约有五千万癫痫患者。国内流行病学资料显示，我国癫痫的患病率在4‰-7‰之间。近年来，活动性癫痫的患病率更加被关注，我国活动性癫痫患病率为4.6‰，年发病率在30/10万左右。据此估算，我国约有600万左右的活动性癫痫患者，同时每年有40万左右新发癫痫患者。癫痫患者的死亡危险性为一般人群的2-3倍。癫痫对于个人、家庭和社会带来严重的负面影响，WHO已将癫痫列为重点防治的神经、精神疾病之一。癫痫发作给患者造成巨大的生理和心理上的痛苦，严重影响患者和家庭的生活质量；长期服用抗癫痫药物及其他诊治费用给家庭带来沉重的经济负担；同时，癫痫患者的保健、教育、就业、婚姻生育等问题，也是患者及其亲属和社会多部门关注的问题。
目前，传统的抗癫痫药物(AEDs)卡马西平(carbamazepine,CBZ)、奥卡西平(Oxcarbazepine)、苯妥英(Phenytoin)及拉莫三嗪(Lamotrigine)仍然是治疗癫痫的一线药物，市场份额占据很高的比重。然而，CBZ是窄治疗指数药物，其有效浓度与中毒浓度接近；偏离最佳剂量或浓度会导致治疗失败或严重毒性；临床应用中需要基于药动学指标进行治疗药物监测；具有中低程度的个体内变异。2007年12月12日，美国食品药品监督管理局(FDA)发布关于卡马西平的安全性信息称，CBZ会引起危险的甚至致命的皮肤反应(史蒂文斯-约翰逊综合征SJS和中毒性表皮坏死溶解症TEN)，尤其在含人类白细胞抗原等位基因HLA-B*1502的患者中更容易发生。
人类白细胞抗原(HLA)是人体重要的免疫遗传体系，也是人体最复杂的多态***。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，是器官移植产生排斥反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。近年的研究发现HLA的部分等位基因与某些药物引起的不良反应密切关联。卡马西平-药物超敏综合征(CBZ-HSS)关联性研究结果表明：HLA-B*0801、HLA-DR3和HLA-DQ2等位基因与CBZ-HSS具有相关性。
CBZ导致SJS/TEN的几率很低，在白种人国家进行的针对卡马西平导致SJS/TEN的发生率只有万分之一至万分之六。但根据WHO和CBZ制药商收到的上市药品不良事件报告显示，一些亚洲国家出现SJS/TEN的概率大约要高出10倍。研究显示，SJS/TEN风险的增加与HLA-B*1502有关。关于SJS/TEN的信息以及指导高危人群接受HLA-B*1502等位基因测试的信息已经添加入现有的黑框警告以及药品说明书的“警告”、“实验检验”和“不良反应”部分。FDA建议医生开具卡马西平(包括卡马西平同类药品)处方时应充分了解药品说明书和更新后的黑框警告中的信息。信息表明，在中国、泰国、马来西亚、印度尼西亚和菲律宾，10-15％或更多的患者可能携带HLA-B*1502，指出大部分亚洲血统患者服用CBZ前都应接受HLA-B*1502基因检测。
临床药物基因组学实施联盟(CPIC)指南表明HLA-B*1502位点和CBZ发生SJS强相关、用药之前建议进行基因检测，HLA-B*1502位点阳性不推荐使用卡马西平。目前，可用于HLA等位基因分型的技术很多，主要是基于核酸序列识别的方法，包括如序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)、聚合酶链反应-寡核苷酸探针斑点杂交法(PCR-SSOP)、聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)。PCR-SBT技术更是现今WHO推荐的HLA分型方法的“金标准”，此类方法具有准确性高，特异性强等优点。但是，拥有优点的同时也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂等缺点。特别是操作繁琐，耗时长等缺点已经不能满足临床医学检测需求，不能适应临床医学检验所要求的“快速、简便”的理念。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的HLA-B*1502等位基因检测的方法及其试剂盒。
本发明的另一个目的是提供上述方法、试剂和试剂盒的应用。
实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是在普通PCR基础上发展的核酸检测方法，以荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的起始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点，将FQ-PCR技术应用于HLA等位基因的分型检测是PCR技术领域的一项创新。TaqMan MGB探针技术是FQ-PCR技术中更具优势的一种。
但是，由于HLA-B*1502基因的特殊性，通过常规的TaqMan MGB探针技术很难获得准确的结果。为了检测HLA-B*1502基因，以往的思路是首先检测与HLA-B*1502基因关联的SNP，然后通过一系列的数据分析获得HLA-B*1502等位基因分型结果。步骤多，花费的时间长，测试结果的准确性也有待提高。本发明实现直接对HLA-B*1502等位基因进行3管联合检测，突破了荧光PCR技术应用于HLA-B*1502基因分型的常规理念，并在上述研究基础上完成本发明。
一方面，本发明提供了一种HLA-B*1502等位基因检测方法，以能更准确方便以及低成本、全面的、对HLA-B*1502位点的基因分型进行检测。
本发明提供了一种用于HLA-B*1502等位基因检测的检测方法，该方法包括如下步骤：
1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的MIX反应液；
2)通过核酸扩增体系扩增待测样品中的靶核苷酸核酸；
3)荧光检测体系中的探针与被扩增的靶核苷酸核酸序列结合；
4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶核苷酸核酸的存在。
所述核酸扩增体系，是由耐热DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、能与靶核苷酸核酸的第一链结合的上游引物(F)1、能与靶核苷酸核酸的第二链结合的下游引物(R)1、能与靶核苷酸核酸的第一链结合的上游引物(F)2、能与靶核苷酸核酸的第二链结合的下游引物(R)2；
所述荧光检测体系是能与靶核苷酸核酸结合并且两端分别含有荧光发生基团和荧光淬灭基团的TaqMan MGB特异性寡核苷酸探针(P)。
作为一种优选的技术方案，本发明所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组MIX反应液，其中：
MIX1反应液中用于靶核苷酸核酸扩增的上游引物1和下游引物1包括引物1和引物2，MIX1反应液的荧光检测体系中所使用的寡核苷酸探针包括探针1；
MIX2反应液中用于靶核苷酸核酸扩增的上游引物1和下游引物1包括引物3和引物4，MIX2反应液荧光检测体系中所使用的寡核苷酸探针包括探针2；
MIX3反应液中用于靶核苷酸核酸扩增的上游引物1和下游引物1包括引物5和引物6，MIX3反应液荧光检测体系中所使用的寡核苷酸探针包括探针3。
引物1-引物6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，来源于HLA-B位点的基因序列。
探针1-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.11所示，来源于HLA-B位点的基因序列。
所述MIX1、MIX2、MIX3反应液中还可以含有引物7、引物8和探针4；引物7、引物8用于扩增内参基因，探针4识别引物7、引物8扩增的内参基因。
引物7和引物8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，用于扩增来源于人类GAPDH基因的序列。探针4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，来源于人类GAPDH基因序列。
本发明提供的检测试剂，还具有这样的特征：其中，探针1、探针2及探针3中均分别包括：5’端FAM标记、3’端MGB标记；探针4，5’端VIC标记、3’端MGB标记。
本发明提供的检测试剂，还具有这样的特征，还包括：耐热DNA聚合酶；用于基因型检测过程中***误差校正的空白对照样本；用于基因型检测过程的PCR反应体系质控的阳性对照样本。
本发明提供的检测试剂，还具有这样的特征：其中，DNA聚合酶为GoldStar TaqManMixture、TaqPath ProAmp Master Mix、TaqMan GTXpress Master MIX中的一种或多种。
本发明提供的检测试剂，还具有这样的特征：其中，空白对照样本为ddH2O。
本发明提供的检测试剂，还具有这样的特征：其中，所述阳性对照样本为HLA-B*1502阳性的基因组DNA。在本发明的优选实施例中，所述基因组DNA的浓度为1ng/μL。
另一方面，本发明还提供一种检测试剂在制备用于癫痫患者用药指导的试剂盒中的用途，所述的检测试剂为上述的检测试剂。
本发明还提供一种检测用于卡马西平用药指导的HLA-B*1502基因型的试剂盒，包括上述的检测试剂。
本发明提供的试剂盒基于荧光定量PCR TaqMan MGB探针法检测HLA-B*1502的基因型。该试剂盒包括3组MIX反应液的引物和探针，浓度可以采用本领域的常规可接受浓度。较好的，引物和探针的浓度不大于2μmol/L，例如，引物的浓度为0.02-1.2μmol/L，探针的浓度为0.01-0.6μmol/L。更好的，引物的浓度为50-1000nmol/L，例如，50nmol/L、80nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、180nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L、350nmol/L、400nmol/L、450nmol/L、500nmol/L、550nmol/L、600nmol/L、700nmol/L、800nmol/L、900nmol/L，等等。探针的浓度可以为50-200nmol/L。例如，60nmol/L、80nmol/L、90nmol/L、100nmol/L、110nmol/L、120nmol/L、130nmol/L、140nmol/L、150nmol/L、160nmol/L、180nmol/L，等等。
本发明中，引物和探针的浓度可以根据不同的扩增体系调整，以获得更好的检测结果，提高准确度、灵敏度、分辨率，降低假阴性、假阳性的出现。例如，MIX1反应液中，含有的引物1和引物2的浓度均为0.2-0.7μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L；MIX2反应液中，含有的引物3和引物4的浓度均为0.3-0.6μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L；MIX3反应液中，含有的引物5和引物6的浓度均为0.2-0.8μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征：其中，试剂盒在使用中，MIX1反应液中，探针1浓度为0.09-0.12μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L；MIX2反应液中，探针2浓度为0.12-0.15μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L；MIX3反应液中，探针3浓度为0.14-0.20μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L。
本发明还提供一种试剂盒的用于非诊断治疗的使用方法，其中，试剂盒为上述的试剂盒，试剂盒基于荧光定量PCR TaqMan MGB探针法检测HLA-B*1502位点基因型。
本发明提供的使用方法还具有这样的特征：其中，试剂盒检测的待测样本为含基因组DNA的生物样本，例如，来自离体的全血或口腔粘膜脱落细胞。
较好的，本发明提供的使用方法中，扩增的循环数为38-45，检测效率和特异性总体较好，例如，38，39，40，41，42，43，44，45。更好的，进行PCR扩增反应的条件为：
(1)50℃UNG酶处理，5min，
(2)95℃预变性，10min，
(3)95℃变性15s，
(4)60℃延伸45s，
(3)-(4)共40个循环。
较好的，本发明提供的使用方法中，MIX(反应混合液，包括MIX1、MIX2、MIX3)反应液退火的温度为59-61℃时，特异性和敏感度总体较好，例如，退火温度为59℃、60℃、61℃。退火的时间为30-60秒范围内，能够提升特异性信号值，例如退火时间为30s、45s、60s。
本发明提供的使用方法，还具有这样的特征其中，结果判断如下：
当VIC、FAM通道Ct值≤38，扩增曲线有明显指数增长期，参照阳性对照结果判读为阳性；当VIC、FAM通道无Ct值或Ct值>38，参照空白对照结果判读为空白；当参照阳性对照结果为阳性，参照空白对照结果为空白，待测样本的基因分型结果判定如表7所示。
发明作用与效果：本发明提供了用于HLA-B*1502基因型别检测的检测试剂、检测试剂在制备用于癫痫患者用药指导的试剂盒中的用途、以及相应的试剂盒及其使用方法。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于HLA-B*1502等位基因的检测，指导临床上CBZ药物的使用，规避HLA-B*1502基因型患者在使用CBZ药物后可能引起SJS/TEN。由于本发明的检测试剂包括的引物群能特异性且精确地用于HLA-B*1502基因的分型进行检测，从而能用于癫痫患者用药指导的评估依据，以及相关药物的研发指导。
附图说明
图1为对比例1中组合1的结果展示。
图2为对比例1中组合2的结果展示。
图3为对比例1中组合3的结果展示。
图4为对比例2的组合1的结果展示。
图5为对比例2的组合1的另一次反应结果展示。
图6为对比例2的组合2的结果展示。
图7为对比例2的组合3的结果展示。
图8为对比例3的组合1的结果展示。
图9为对比例3的组合2的结果展示。
图10为对比例3的组合3的结果展示。
具体实施方式
以下说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例，具体说明可用于癫痫患者用药指导的基因群的相应的引物组和试剂盒等。
本实施例提供一种用于HLA-B*1502基因型别检测的检测试剂。
该检测试剂包括：核酸扩增体系，该试剂盒核酸扩增体系包括MIX1反应液及其用于扩增寡核苷酸核酸的引物1与引物2、引物7与引物8；MIX2反应液及其用于扩增寡核苷酸核酸的引物3与引物4、引物7与引物8；MIX3反应液及其用于扩增寡核苷酸核酸的引物5与引物6、引物7与引物8；其中，所示引物1-引物8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.8所示(表1)。
该检测试剂还包括：荧光检测体系，该试剂盒用于包括用于MIX1反应液的荧光检测探针1与探针4、MIX2反应液的荧光检测探针2与探针4、MIX3反应液的荧光检测探针3与探针4，其中，探针1、探针2、探针3均分别为：5’端FAM标记、3’端MGB标记；探针4为：5’端VIC标记、3’端MGB标记。探针1-4探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示(表2)。
其中，5’端VIC标记和5’端FAM标记分别指5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端MGB标记是指在3’端标记荧光基团淬灭。
本实施例的检测试剂，还包括DNA聚合酶、空白对照样本、阳性对照样本。其中，DNA聚合酶可以为GoldStar TaqMan Mixture、TaqPath ProAmp Master Mix、TaqMan GTXpressMaster MIX中的一种或多种。
空白对照样本用于HLA-B*1502位点基因型检测过程中***误差校正，也即检验反应体系是否存在污染，确保反应检测结果准确可靠，具体地，采用ddH2O作为空白对照样本。
阳性对照样本用于所述HLA-B*1502位点基因型检测过程的PCR反应体系质控，本实施例中，阳性对照样本为包含基因HLA-B*1502的基因组DNA，且所述基因组DNA的浓度为1ng/μL或者近似的浓度。
PCR反应体系质控也即为了起到质控目的，以监控检测反应体系是否正常可使用。
本实施例提供的检测试剂，可以应用在制备用于癫痫患者用药指导的试剂盒中，从而本实施例也提供一种检测用于癫痫用药指导的HLA-B*1502位点基因型的试剂盒。
本实施例提供的试剂盒基于荧光定量PCR TaqMan MGB探针法检测HLA-1502位点基因型，该试剂盒在使用中，MIX1反应液中，含有的引物1和引物2的浓度均为0.2-0.7μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L，优选地，引物1和引物2的浓度为0.4μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度为0.25μmol/L；MIX2反应液中，含有的引物3和引物4的浓度均为0.3-0.6μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L，优选地，引物3和引物4的浓度为0.4μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度为0.25μmol/L；MIX3反应液中，含有的引物5和引物6的浓度均为0.2-0.8μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L，优选地，引物1和引物2的浓度为0.7μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度为0.25μmol/L；并且，该试剂盒在使用中，MIX1反应液中，探针1浓度为0.09-0.12μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L，优选地，探针1浓度为0.11μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L；MIX2反应液中，探针2浓度为0.12-0.15μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L，优选地，探针2浓度为0.14μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L；MIX3反应液中，探针3浓度为0.14-0.20μmol/L，探针4浓度为0.1-0.5μmol/L，优选地，探针3浓度为0.18μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L。
其中，FQ-PCR(实时荧光定量PCR)工作原理是：本发明所用的探针为5’端VIC/FAM标记、3’端MGB标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。在探针完整时，即在随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光的存在。在FQ-PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan MGB探针发生杂交反应时，强耐受性DNA聚合酶的5’端外切酶活性也把TaqMan MGB探针的碱基逐个剪切，报告基团所释放出的荧光就可以被内置在PCR仪中的荧光计检测到。PCR经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数扩增的过程，荧光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。
本实施例中，上述试剂盒的使用方法如下：
基于荧光定量PCR TaqMan MGB探针法检测HLA-B*1502位点基因型，具体包括以下步骤：
步骤1，获取待测样本：待测样本为含基因组DNA的生物样本，生物样本来自全血或口腔粘膜脱落细胞，具体地，本实施例中，从全血或口腔粘膜脱落细胞中提取到基因组DNA作为模板DNA；
步骤2，DNA浓度及纯度的鉴定：采用紫外分光光度计进行鉴定，利用OD260nm/OD280nm比值计算DNA纯度，比值为1.7-2.0，优选地，将DNA用ddH2O稀释到5-15ng/μL；
步骤3，进行基因分型：应用TaqMan MGB探针法(Life,TaqPathTMProAmpTM MasterMix)对MIX1反应液、MIX2反应液、MIX3反应液三个体系进行基因分型，采用的引物群和探针群如上。
A、不同MIX反应液体系的配制，每个反应体系的终体积为25μL。
A1、针对MIX1反应液配制具体见表格3。
A2、针对MIX2反应液配制具体见表格4。
A3、针对MIX3反应液配制具体见表格5。
每个核酸扩增体系检测对应的模板分为：待测样本、空白对照样本以及阳性对照样本。针对每个MIX反应液的检测，添加如表3、表4和表5中相应的引物和探针，再分别添加不同的模板平行反应，分别得到参照阳性对照结果、参照空白对照结果和基因分型结果。其中，待测样本的添加浓度为5-15ng/μL，阳性对照样本的添加浓度为1ng/μL。
B、FQ-PCR反应扩增程序(表6)
C、结果判读：
当VIC、FAM通道Ct值≤38，表明扩增曲线有明显指数增长期，参照阳性对照结果判读为阳性；
当VIC、FAM通道无Ct值或Ct值>38，表明无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，参照空白对照结果判读为空白；
当参照阳性对照结果为阳性，参照空白对照结果为空白，待测样本的基因分型结果判定如表7：
注：“/”表示不考虑。
实施例2
本实施例通过对一些癫痫患者病例，分别采用以PCR-SBT试剂盒作为金标准的HLA-B*1502检测方法和采用实施例1提供的检测试剂、相应的试剂盒以及相应的方法，对病例采样、检测HLA-B*1502位点，基因分型检测结果见表8。
上述结果可以看出：采用实施例1的试剂盒得到的基因分型结果与PCR-SBT试剂盒检测得到的基因分型结果的一致性100％。
可见，采用实施例1的检测试剂、相应的试剂盒以及方法进行检测，对HLA-B*1502位点的检测结果可信度高，说明本实施例1的检测试剂以及相应的试剂盒和使用方法，能精确地对人类白细胞抗原B位点1502基因进行检测，所以能精确地用于癫痫患者作为卡马西平用药指导的评估依据、相应药物的研发等。
而且，采用实时荧光定量PCR的优点，与基因测序等基因分型的技术相比较，本发明用于HLA-B*1502位点基因分型的检测还具有如下优势：
1、特异性强：设计的引物对分别针对HLA-B*1502的特异性序列，能特异地扩增相应的基因组DNA；分别针对MIX反应液的扩增产物设计的探针，增加MGB能够十分有效地区分单碱基差异；
2、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性；
3、操作快速简单，从样本送检到得到结果可在3-4个小时内完成。而基因测序法检测步骤繁琐：送检标本→提取DNA→PCR扩增→验证PCR产物(电泳)→纯化PCR产物→基因测序→结果分析，其经过两个PCR产物的电泳过程，污染几率很大，不适合在医院大规模开展；
4、判读结果明确客观；
5、高通量，单次单板(96孔板)可检测30个样本；
6、安全，整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无害。
总之，与基因测序等基因分型的技术相比，实施例1提供的试剂盒用于HLA-B*1502位点基因分型，有特异性强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果精确，简便等优势，由此能解决现有基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。而且，实施例1的试剂盒中的引物和探针是经过反复优化和测试的，可以快速、准确、便宜、高通量给HLA-B*1502基因进行分型，其灵敏度高，特异性强，适用于常见样本比如血液、口腔粘膜脱落细胞等，能够快速、低廉、准确，高通量地检测人体血液或者其他组织细胞中HLA-B*1502基因位点的型别，对于分型技术而言，是目前性价比最好的方法，更便于临床或者健康检测大规模的推行。
实施例作用与效果
实施例1提供的用于HLA-B*1502位点基因型检测的检测试剂、检测试剂在制备用于癫痫患者用药指导的试剂盒中的用途、以及相应的试剂盒及其使用方法，由于检测试剂包括的引物探针能特异性且精确地用于HLA-B*1502位点的基因分型进行检测，从而能用于癫痫患者用药指导的评估依据，以及相关药物的研发指导。
另外，实施例1提供的试剂盒的使用方法，通过本发明设计的引物和探针，能选择操作简单快速、高通量、判读结果精确的实时荧光定量PCR检测，更便于临床或者健康检测大规模的推行。
对比例1
MIX1反应液采用不同引物探针组合的筛选，结果如表9。
引物探针序列信息如表10所示。
对比例2
MIX2反应液采用不同引物探针组合的筛选。结果见表11和图4-7。
引物探针序列信息如表12所示。
对比例3
MIX3反应液采用不同引物探针组合的筛选。结果见表13和图8-10。
引物探针序列信息如表14所示。
序列表
<110> 上海恩元生物科技有限公司
<120> HLA-B*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcctgctg ctctcggg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcgcccccg cctgcggt 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggagtatt gggaccggaa c 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtgacct gcgccccg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggggtct gggttttc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcccaggct gcgttagc 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgctttta actctggtaa agtg 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcactcacca tgtagttgag 20
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctcccgacc cgc 13
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acctgcgcgg ctac 14
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagcatcctc acag 14
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggatattgt tgccatcaa 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtgtctaga gaagccaatc agt 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggtctcggt cagggccagg gct 23
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccggactcag aatctcc 17
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cattactggg aagcagcatc ct 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caacaccaca accatcaagg c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgtgacaat gaaggacaga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggagtattg ggaccggaac 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtcgtgacc tgcgccccg 19
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctgcggaacc tgc 13
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggagtattgg gaccggaac 19
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgacctgcg ccccg 15
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cggaacctgc gcggc 15
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggtggggtct gggttttctt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacatgtgct gcacaaaaga 20
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cagcatcctc acagg 15
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgaggggtgg ggtctgggtt tt 22
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccttcattgt cacatgtgct gcac 24
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagcagcatc ctcacagg 18
Claims (11)
1.一种人类白细胞抗原B位点1502基因的检测试剂，其特征在于，
所述的检测试剂包括MIX1反应液、MIX2反应液、MIX3反应液；
所述的MIX1反应液含有能与寡核苷酸核酸结合的引物1、引物2；
所述的MIX2反应液含有能与寡核苷酸核酸结合的引物3、引物4；
所述的MIX3反应液含有能与寡核苷酸核酸结合的引物5、引物6；
配合MIX1反应液核酸扩增体系使用的荧光检测体系包括用于与核酸扩增体系的扩增产物杂交的探针1；
配合MIX2反应液核酸扩增体系使用的荧光检测体系包括用于与核酸扩增体系的扩增产物杂交的探针2；
配合MIX3反应液核酸扩增体系使用的荧光检测体系包括用于与核酸扩增体系的扩增产物杂交的探针3；
所述MIX1反应液中，所述的引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；含有的引物1和引物2的浓度均为0.2-0.7μmol/L；
所述MIX2反应液中，所述的引物3和引物4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；含有的引物3和引物4的浓度均为0.3-0.6μmol/L；
所述MIX3反应液中，所述的引物5和引物6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；含有的引物5和引物6的浓度均为0.2-0.8μmol/L；
所述探针1、探针2、探针3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示；探针1浓度为0.09-0.12μmol/L，探针2浓度为0.12-0.15μmol/L，探针3浓度为0.14-0.20μmol/L。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述MIX1反应液中，引物1和引物2的浓度为0.4μmol/L；所述MIX2反应液中，引物3和引物4的浓度为0.4μmol/L；所述MIX3反应液中，引物5和引物6的浓度为0.7μmol/L；探针1浓度为0.11μmol/L；探针2浓度为0.14μmol/L；探针3浓度为0.18μmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，
所述的检测试剂还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为GoldStar TaqMan Mixture、TaqPathProAmp Master Mix、TaqMan GTXpress Master MIX中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述MIX1、MIX2、MIX3反应液中还含有引物7、引物8和探针4；引物7、引物8用于扩增内参基因，探针4识别引物7、引物8扩增的内参基因。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的探针1、探针2、探针3和探针4的5’端标记有不同的荧光报告基团，探针1、探针2、探针3和探针4在3’端标记荧光淬灭基团。
6.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，引物7和引物8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；引物7和引物8的浓度均为0.2-1.2μmol/L；探针4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；探针4浓度为0.1-0.5μmol/L。
7.根据权利要求6所述的检测试剂，其特征在于，引物7和引物8的浓度为0.25μmol/L；探针4浓度为0.25μmol/L。
8.一种检测试剂在制备用于癫痫患者用药指导的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂为权利要求1-7中任意一项所述的检测试剂。
9.一种检测HLA-B*1502位点基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：权利要求1-7中任意一项所述的检测试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求6所述的检测试剂；该试剂盒中，MIX1反应液中，含有的引物1和引物2的浓度均为0.4μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.25μmol/L；MIX2反应液中，含有的引物3和引物4的浓度均为0.4μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.25μmol/L；MIX3反应液中，含有的引物5和引物6的浓度均为0.7μmol/L，含有的引物7和引物8的浓度均为0.25μmol/L。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求6所述的检测试剂；所述的试剂盒中，MIX1反应液荧光检测体系中，探针1浓度为0.11μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L；MIX2反应液荧光检测体系中，探针2浓度为0.14μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L；MIX3反应液荧光检测体系中，探针3浓度为0.18μmol/L，探针4浓度为0.25μmol/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110001191.3A CN112481374B (zh) | 2021-01-04 | 2021-01-04 | Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110001191.3A CN112481374B (zh) | 2021-01-04 | 2021-01-04 | Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112481374A CN112481374A (zh) | 2021-03-12 |
| CN112481374B true CN112481374B (zh) | 2022-09-16 |
Family
ID=74915996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110001191.3A Active CN112481374B (zh) | 2021-01-04 | 2021-01-04 | Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112481374B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114350786A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 常州先趋医疗科技有限公司 | 用于检测hla-b*15：02等位基因的引物组及其应用 |
| CN114317727B (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-15 | 上海恩元生物科技有限公司 | 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103114138B (zh) * | 2013-01-27 | 2014-12-03 | 复旦大学 | Pcr-ssp法定性检测hla-b*1502基因的方法及临床试剂盒 |
| CN104450914A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-03-25 | 苏州旷远生物分子技术有限公司 | 用于检测人hla-b*1502基因的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法 |
| CN106119362B (zh) * | 2016-06-30 | 2019-09-10 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种用于检测hla-b*1502等位基因的引物组及试剂盒 |
| CN111518887A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-11 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于检测hla-b*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法 |
-
2021
- 2021-01-04 CN CN202110001191.3A patent/CN112481374B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112481374A (zh) | 2021-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105506118B (zh) | 用于检测cyp2c19基因分型的引物对、荧光探针、试剂盒及方法 | |
| CN112481374B (zh) | Hla-b*1502基因的检测方法、检测试剂盒及其应用 | |
| US20140127685A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing autism | |
| CN110093413A (zh) | 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 | |
| Butler et al. | Currently recognized genes for schizophrenia: high‐resolution chromosome ideogram representation | |
| CN117070607B (zh) | 一种检测人脊髓性肌萎缩症smn1和smn2基因拷贝数的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN111321227A (zh) | 白血病mef2d基因及znf384基因的多重荧光rt-pcr检测方法 | |
| CN104830852A (zh) | 一种检测hla-b*15:02等位基因的多重实时荧光pcr方法 | |
| CN105506164A (zh) | 一种检测青春型精神***症易感性的试剂盒 | |
| CN111235268B (zh) | Snp位点基因型检测试剂及相应的试剂盒中的用途及试剂盒 | |
| CN113584147A (zh) | 一种用于指导精神病用药的基因多态性检测试剂盒 | |
| WO2021158760A2 (en) | Methods and systems for multiplex allele detection | |
| CN105950766B (zh) | 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒 | |
| CN101135665B (zh) | 基于线粒体dna t6680c单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 | |
| CN103820543A (zh) | Hla-b*15:02等位基因检测方法及其试剂盒 | |
| CN116144750A (zh) | 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用 | |
| CN114592054A (zh) | 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法 | |
| WO2014130364A1 (en) | Collection of probes for autistic spectrum disorders and their use | |
| US10731219B1 (en) | Method for preventing progression to metabolic syndrome | |
| CN106191299A (zh) | 用于检测scn1a基因5’端非编码区突变的引物、试剂盒和方法 | |
| CN113373211A (zh) | 一种用于指导焦虑症用药的相关基因检测试剂盒及应用 | |
| CN111575366A (zh) | 用于检测自闭症基因组拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒 | |
| US20230128191A1 (en) | Methods and kits for the detection of sars-cov-2 | |
| CN101135666B (zh) | 基于线粒体dna c3970t单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 | |
| JP2022520427A (ja) | 脳損傷の唾液バイオマーカー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |