CN113366022A - 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了涉及免疫特异性结合粘蛋白‑16(MUC16)表位的抗粘蛋白‑16(MUC16)剂的组合物、方法和用途。本文还提供用于管理、治疗或预防诸如癌症的障碍和与阳性MUC16表达相关的疾病的用途和方法。

Description

针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月16日提交的美国临时申请号62/768,730的权益和优先权，所述临时申请的公开文本内容通过引用以其整体并入本文。
政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的CA190174下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
粘蛋白是用于细胞稳态并保护上皮表面的重要生物分子。癌症诸如卵巢癌中粘蛋白表达的改变可用作用于诊断、预后和治疗的生物标记物(Singh AP等人,Lancet Oncol2008；9(11):1076-85)。MUC16是在大多数卵巢癌细胞上过表达的粘蛋白并且是已确立的用于检测卵巢癌进展的替代血清标记物(CA-125)(Badgwell D等人,Dis Markers 23(5-6):397410(2007)；Bast RC,Jr等人,Int J Gynecol Cancer 15Suppl 3:274-81(2005)；Fritsche HA等人,Clin Chem 44(7):1379-80(1998)；以及Krivak TC等人,Gynecol Oncol115(1):81-5(2009))。
MUC16是高度糖基化粘蛋白，其由被切割并释放的大细胞外结构域(CA-125)以及保留结构域(MUC-CD)构成(图1)。MUC-CD包含切割位点附近的非重复细胞外结构域(MUC16胞外域)、跨膜结构域和具有潜在磷酸化位点的细胞质尾区。在切割位点远端，释放的细胞外结构域(CA-125)含有16-20个具有156个氨基酸的串联重复，其各自具有许多潜在的糖基化位点(O'Brien TJ等人,Tumor Biol 22(6):348-66(2001))。由于MUC16抗原另外在子宫、子宫内膜、输卵管、卵巢以及腹腔和胸腔的浆膜的正常组织中仅以低水平表达，所以MUC16是用于基于免疫的疗法(包括靶向并治疗癌症)的潜在有吸引力的靶标。
MUC16的细胞外结构域的大部分被切割并分泌(即，CA-125)，其限制了MUC16的此部分用作卵巢癌上的靶抗原的实用性。许多报告的MUC16单克隆抗体结合至呈现于糖蛋白的大分泌CA-125部分上的表位，并且不结合至保留的MUC16胞外域(Bellone S Am JObstet Gynecol 200(1):75el-10(2009)；Berek JS.Expert Opin Biol Ther.4(7):1159-65(2004)；O'Brien TJ等人,Int J Biol Markers 13(4):188-95(1998))。因此，需要生成针对MUC16的未脱落的区域的新抗体用于诊断和治疗目的。
发明内容
本文提供了抗粘蛋白16(MUC16)构建体的组合物、方法和用途，所述构建体包含免疫特异性结合至粘蛋白16(MUC16)的抗体部分，并且调节MUC16的表达和/或其用于管理或治疗MUC16介导的障碍诸如癌症的活性。
在某些实施方案中，本文提供了抗粘蛋白16(MUC16)构建体，其包含免疫特异性识别粘蛋白16(MUC16)多肽的抗体部分，其中所述抗体部分包含(a)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:2的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和(ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:3的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3；或者(b)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和(ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:11的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分免疫特异性识别人MUC16。在一些实施方案中，所述MUC16被糖基化。在一些实施方案中，所述MUC16在Asnl800或Asn1806处被糖基化。
在一些实施方案中，本文所提供的抗粘蛋白16(MUC16)构建体的抗体部分包含：(a)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的重链互补决定区((HC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；以及(ii)可变轻(VL)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的轻链互补决定区(LC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3；或者(b)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1；含有氨基酸序列SEQID NO:13的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；以及(ii)可变轻(VL)链，其包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的LC-CDR3。
在一些实施方案中，本文所提供的抗粘蛋白16(MUC16)构建体的抗体部分免疫特异性结合至MUC16的胞外域。在一些实施方案中，抗体部分是全长抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、或单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，VH链和VL链是人VH链和VL链。在一些实施方案中，所述抗体部分是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分免疫特异性结合至包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的MUC16 c114多肽。
在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体在Matrigel侵袭测定中抑制表达MUC16的体外侵袭。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是卵巢肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本文所提供的抗粘蛋白16(MUC16)构建体的抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VH。在一些实施方案中，所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL。在一些实施方案中，所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH。在一些实施方案中，所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL。在一些实施方案中，所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VH和含有氨基酸序列SEQ IDNO:3的VL。在一些实施方案中，所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL。在一些实施方案中，所述抗体部分包含人来源的重链和轻链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区具有选自以下的同种型：γl、γ2、γ3和γ4。在一些实施方案中，轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，所述抗体部分是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG。
在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是单特异性的。在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是多特异性的。在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是双特异性的。在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体、F(ab′)2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异多聚体抗体或异缀合物抗体。在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是包含通过肽接头连接的两个scFv的串联scFv。在一些实施方案中，免疫特异性识别MUC16的抗体部分是第一抗体部分，并且其中所述抗MUC16构建体进一步包含免疫特异性识别第二抗原的第二抗体部分。在一些实施方案中，第二抗原是T细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二抗原是CD3。在一些实施方案中，第二抗原选自CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。在一些实施方案中，第二抗原是CD3ε。
在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD3 zeta(ζ)链细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16构建体进一步缀合至肽剂、检测剂、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
在某些实施方案中，本文还提供了多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2-17中的一个或多个的氨基酸序列或本文所提供的抗MUC16构建体的氨基酸。
在某些实施方案中，本文还提供了包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码含有SEQ ID NO:2-17中的一个或多个的氨基酸序列或本文所提供的抗MUC16构建体的氨基酸的一种或多种多肽。在某些实施方案中，本文还提供了载体，所述载体包含可操作地连接至启动子的本文所提供的多核苷酸。
在某些实施方案中，本文还提供了包含本文所提供的抗MUC16构建体、本文所提供的多肽、本文所提供的多核苷酸或本文所提供的载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞或B细胞。
在某些实施方案中，本文还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文所提供的抗MUC16构建体、本文所提供的多肽、本文所提供的多核苷酸或本文所提供的载体；和药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，本文还提供了治疗有需要的患者的MUC16相关疾病或障碍的方法，其包括向所述患者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本文所提供的抗MUC16构建体、本文所提供的多肽、本文所提供的多核苷酸或本文所提供的载体。在一些实施方案中，所述MUC16相关疾病或障碍是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌或原发性腹膜癌。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述药物组合物抑制患者中的转移。在一些实施方案中，所述患者是人患者。
在某些实施方案中，本文还提供了用于产生效应细胞的方法，其包括用编码本文所提供的抗MUC16构建体的一种或多种核酸对细胞进行遗传修饰。
在某些实施方案中，本文还提供了包括以下的方法：将编码本文所提供的抗MUC16构建体的一种或多种核酸引入从患者分离的一种或多种原代细胞中，并且向所述患者施用包含所述一种或多种核酸的细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括扩增所述细胞，之后向所述患者施用所述细胞。在一些实施方案中，所述原代细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述原代细胞是T细胞。
在一些实施方案中，本文所提供的治疗方法进一步包括向所述患者施用治疗有效量的另一种治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是抗癌剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是化学治疗剂。
在某些实施方案中，本文还提供了检测样品中的MUC16的方法，其包括：(a)使所述样品与本文所提供的抗MUC16构建体接触；并且(b)直接或间接检测在抗MUC16构建体与存在于样品中的MUC16之间的结合。在一些实施方案中，所述抗MUC16构建体缀合至可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记是发色剂、酶剂、放射性同位素、同位素、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是通过检测可检测标记来直接检测的。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是使用二抗间接检测的。
在某些实施方案中，本文还提供了诊断疑似患有MUC16相关疾病或障碍的个体的方法，其包括：a)向所述个体施用有效量的本文所提供的抗MUC16构建体；并且b)直接或间接确定在所述抗MUC16构建体与所述个体中的任何MUC16之间的结合水平，其中结合水平高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍。在一些实施方案中，所述抗MUC16构建体缀合至可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记是发色剂、酶剂、放射性同位素、同位素、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是通过检测可检测标记来直接检测的。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是使用二抗间接检测的。
一种诊断疑似患有MUC16相关疾病或障碍的个体的方法，包括a)使包含源自所述个体的细胞的样品与本文所提供的抗MUC16构建体接触；并且b)确定所述样品中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目，其中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目的值高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍。在一些实施方案中，所述抗MUC16构建体缀合至可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记是发色剂、酶剂、放射性同位素、同位素、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是通过检测可检测标记来直接检测的。在一些实施方案中，在抗MUC16构建体与样品中的任何MUC16之间的结合是使用二抗间接检测的。
在某些实施方案中，本文还提供了生成免疫特异性结合至人MUC16多肽的抗MUC16构建体的方法，其包括从人scFv抗体噬菌体展示文库中选择对人MUC16具有特异性的人scFv。在一些实施方案中，选择对人MUC16具有特异性的人scFv包括使所述人scFv抗体噬菌体展示文库与表达重组MUC16多肽的细胞接触。在一些实施方案中，所述重组MUC16多肽包含SEQ ID NO:25的序列。
在某些实施方案中，本文还提供了本文所提供的抗MUC16构建体、抗MUC16多肽、编码抗MUC16构建体或抗MUC16多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、或包含任何所述多肽和其多核苷酸的细胞用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途。在一些实施方案中，所述与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍是癌症。
在某些实施方案中，本文还提供了本文所提供的抗MUC16构建体、抗MUC16多肽、编码抗MUC16构建体或抗MUC16多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、或包含任何所述多肽和其多核苷酸的细胞在制造用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的药剂中的用途。在一些实施方案中，所述与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍是癌症。
在某些实施方案中，本文还提供了本文所提供的抗MUC16构建体、抗MUC16多肽、编码抗MUC16构建体或抗MUC16多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体或包含任何所述多肽和其多核苷酸的细胞用于诊断与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途。在一些实施方案中，与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍是癌症。
附图说明
图1A示出了MUC16的结构的示意图。图1B示出了MUC16的截短形式(称为MUC16c114)的示意图和氨基酸序列(SEQ ID NO:25)，其包含58个氨基酸的胞外域、25个氨基酸的跨膜结构域和31个氨基酸的细胞质尾区。图中的编号是基于鉴定Muc16的初始出版物Yin和Lloyd(2001)J Biol Chem 276:27371-27375。
图2示出了野生型MUC16-C114(SEQ ID NO:25)与N30突变体MUC16-C114(SEQ IDNO:31)胞外域之间的氨基酸比对。
图3示出了在表达野生型MUC16-C114(HEK293-MUC16WT)或N30突变体MUC16-C114(HEK293-MUC16mut)的HEK293稳定细胞系中GFP表达的荧光活化细胞分选(FACS)分析。示出对照HEK293细胞用于比较。
图4示出了对于所有三种细胞系，与阴性噬菌体对照孵育和未与噬菌体对照孵育的野生型MUC16-C114(HEK293-MUC16WT)或N30突变体MUC16-C114(HEK293-MUC16mut)细胞的FACS分析的结果。
图5示出了与两种示例性抗体噬菌体克隆克隆8和克隆12孵育的野生型MUC16-C114(HEK293-MUC16WT)或N30突变体MUC16-C114(HEK293-MUC16mut)细胞的FACS分析的示例性结果。选择与野生型MUC16-C114结合但不与N30突变体MUC16-C114结合的抗体克隆，以用于进行测序和进一步显影。
图6示出了克隆8双特异性抗体(BsAb)与MUC16+OVCAR3细胞系而非对照MUC16-SKOV3细胞系的结合，所述克隆8双特异性抗体(BsAb)包含在N末端的抗MUC16 scFv和在C末端的小鼠单克隆抗体的抗人CD3εscFv。
图7示出了使用与MUC16+OVCAR3细胞系(与MUC16-SKOV3细胞系相比)一起孵育的所选择的抗MUC16 BsAb(包括抗MUC16克隆8BsAb和抗MUC16克隆12BsAb)进行细胞毒性测定的示例性结果。与MUC16-SKOV3细胞系相比，克隆8和克隆12BsAb能够诱导MUC16+OVCAR3细胞系的靶标特异性细胞裂解。
图8示出了使用与MUC16+OVCAR3细胞系、MUC16+SKOV8细胞系和MUC16+OVCA432细胞系(与MUC16-SKOV3细胞系相比)一起孵育的所选择的抗MUC16 BsAb(包括抗MUC16克隆8BsAb和抗MUC16克隆12BsAb)进行细胞毒性测定的示例性结果。抗MUC16克隆8BsAb能够诱导MUC16+OVCAR3、SKOV8和OVCA432细胞系的靶标特异性细胞裂解。抗MUC16克隆12BsAb还诱导MUC16+的细胞裂解，但其程度较低。
图9A示出了使用表达MUC16的SKOV3-MUC-CD修饰细胞的注射建立肿瘤并使用抗MUC16克隆8BsAb的注射进行治疗的卵巢异种移植研究的示例性实验方案。图9B示出了显示肿瘤的建立和治疗的示例性可视化数据。图9C示出了用于异种移植实验的示例性存活曲线数据。图9D示出了显示在用抗MUC16克隆8BsAb治疗荷瘤小鼠后细胞因子IL-2和IFN-γ的诱导的示例性数据。
具体实施方式
本申请在一个方面提供了抗MUC16抗体剂，诸如抗MUC16构建体，其包含特异性识别MUC16的表位(诸如MUC16的保留细胞外结构域(MUC16胞外域)的表位)的抗体部分。
使用噬菌体展示技术，鉴定对人MUC16的保留细胞外结构域具有特异性的scFv。流式细胞术测定证实，这些抗体识别表达MUC16的癌细胞系。本申请因此提供了抗MUC16抗体剂，诸如包含免疫特异性结合MUC16的抗体部分的抗MUC16构建体。抗MUC16抗体剂包括例如抗MUC16抗体(例如全长抗MUC16抗体及其抗原结合片段)、抗MUC16 scFv、抗MUC16抗体融合蛋白(例如抗MUC16 Fc融合蛋白和嵌合抗原受体(CAR))、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其抗MUC16抗体缀合物(即，抗MUC16免疫缀合物)。
在另一个方面，提供了编码抗MUC16抗体剂的核酸，所述抗MUC16抗体剂诸如抗MUC16抗体(例如全长抗MUC16抗体及其抗原结合片段)、抗MUC16 scFv、抗MUC16抗体融合蛋白(例如抗MUC16 Fc融合蛋白和嵌合抗原受体(CAR))、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其抗MUC16抗体缀合物(即，抗MUC16免疫缀合物)。
在另一方面，提供了包含抗MUC16抗体剂的组合物，诸如药物组合物，所述抗MUC16抗体剂诸如全长抗MUC16抗体及其抗原结合片段、抗MUC16 scFv、抗MUC16抗体融合蛋白(例如抗MUC16 Fc融合蛋白和嵌合抗原受体(CAR))、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其抗MUC16抗体缀合物(即，抗MUC16免疫缀合物)。
本文还提供了制备和使用抗MUC16抗体剂和抗体(诸如用于治疗癌症)的方法，以及可用于此类方法的试剂盒和制品。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中所用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本公开文本。
如本文所用，术语“MUC 16”或“MUC 16多肽”或“MUC 16肽”是指如Yin BW和LloydKO,2001,J Biol Chem.276(29):27371-5中所述的MUC 16连接的粘蛋白。GenBankTM登录号NP_078966.2(SEQ ID NO:1)提供了示例性人MUC 16核酸序列。GenBankTM登录号NP078966.2(SEQ ID NO:1)提供了示例性人MUC16氨基酸序列。天然MUC 16包含细胞内结构域、跨膜结构域、假定切割位点附近的胞外域和具有12-20个重复(每个重复为156个氨基酸长)的大的高度糖基化区域(图1A)。“不成熟”MUC16是指SEQ ID NO:1，其包含MUC16信号序列(SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-60)。“成熟MUC 16”是指在细胞表面上表达的天然MUC 16，即其中信号序列通过细胞加工去除，例如SEQ ID NO:32，其中SEQ ID NO:1的前60个氨基酸残基已被去除(即，SEQ ID NO:1是MUC16的“不成熟”形式)。
由SEQ ID NO:25的氨基酸序列表示的多肽在本文中称为MUC16 C114，并且由成熟MUC16(SEQ ID NO:32是成熟MUC16的序列)的C末端114个氨基酸残基组成。MUC16 C114包含58个氨基酸的胞外域、25个氨基酸的跨膜结构域和31个氨基酸的细胞质尾区(图1B)。MUC16c114能够在SEQ ID NO:25的位置1、24和30处的天冬酰胺氨基酸残基(根据初始MUC16出版物Yin BW和Lloyd KO,2001,J Biol Chem.276(29):27371-5，也称为氨基酸位置Asnl777、Asnl800和Asnl806)处被N糖基化。
如本文所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
如本文所用，术语“约”当用于修饰数值或数值范围时表示高于所述值或范围5％至10％和低于所述值或范围5％至10％的偏差仍在所述值或范围的预期含义内。
如本文所用，术语向受试者“施用”药剂包括将药剂引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，所述途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下和如本文描述的其他合适途径。施用包括自我施用和由另一个人施用。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸)以及焦赖氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合)的试剂，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(诸如正亮氨酸)或经修饰的肽主链但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在一些实施方案中，形成多肽的氨基酸呈D形式。在一些实施方案中，形成多肽的氨基酸呈L形式。在一些实施方案中，第一多个形成多肽的氨基酸呈D形式，并且第二多个形成多肽的氨基酸呈L形式。
氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸由其通常接受的单字母代码表示。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。例如，在实验的目的是确定治疗剂对治疗特定类型的疾病的功效的相关性的情况下，典型地使用阳性对照(已知展现出所希望的治疗作用的组合物)和阴性对照(不接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现所希望的治疗作用的药剂的量。在治疗应用的背景下，向受试者施用的治疗肽的量可以取决于感染的类型和严重性以及个体的特征，诸如总体健康状况、年龄、性别、体重以及药物耐受性。它还取决于疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。
如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果所述多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平。在一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与来自对照或参考样品的所述基因的表达水平进行比较。在另一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与施用本文公开的组合物后来自相同样品的所述基因的表达水平进行比较。术语“表达”还是指以下事件中的一种或多种：(1)在细胞内由DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)在细胞内加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端形成)；(3)在细胞内将RNA序列翻译成多肽或蛋白质；(4)在细胞内对多肽或蛋白质的翻译后修饰；(5)将多肽或蛋白质呈递在细胞表面上；以及(6)从细胞分泌或呈递或释放多肽或蛋白质。
术语“接头”是指接连或连接两个序列(例如，连接两个多肽结构域)的合成序列(例如，氨基酸序列)。在一些实施方案中，接头含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸序列。
如本文所用，术语“抗体”不仅意指完整抗体分子，而且还意指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。此类片段在本领域中也是众所周知的，并且通常既体外使用，也体内使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅意指完整的免疫球蛋白分子，而且还意指众所周知的活性片段F(ab')2和Fab。缺少完整抗体的Fc片段的F(ab')2和Fab片段从循环中清除得更快，并且可以小于完整抗体的非特异性组织结合(Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。本发明的抗体包括整个天然抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、驼源化(camelised)抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、单结构域抗体(例如，纳米抗体和单结构域骆驼科抗体)、VNAR片段、双特异性T细胞衔接器抗体、微抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、和抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、融合多肽、非常规抗体和以上任何抗体的抗原结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的。
在某些实施方案中，抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区(CH)构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区CL构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区域可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Cl q)。如本文所用，可互换地，术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合片段”或“抗原结合区”是指抗体的结合抗原并赋予抗体抗原特异性的区域或部分；抗原结合蛋白(例如抗体)的片段包括抗体的保留特异性结合抗原(例如，肽/HLA复合物)的能力的一种或多种片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗体片段”内涵盖的抗原结合部分的例子包括：Fab片段，即由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，即包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CHI结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)；和分离的互补决定区(CDR)。
抗体和抗体片段可以全部或部分地源自哺乳动物(例如，人、非人灵长类、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠、兔子和绵羊)或非哺乳动物类产生抗体的动物(例如，鸡、鸭、鹅、蛇、有尾目两栖动物)。抗体和抗体片段可以在动物中产生或在动物外产生，诸如从酵母或噬菌体产生(例如，作为单抗体或抗体片段或作为抗体文库的一部分)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头能够使它们被制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中VL和VH区配对形成单价分子。这些称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,Science242:423-426(1988)；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883(1988)。这些抗体片段是使用本领域普通技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。
“分离的抗体”或“分离的抗原结合蛋白”是已经被鉴定并且从其天然环境的组分分离和/或回收的抗体或抗原结合蛋白。“合成抗体”或“重组抗体”通常使用重组技术或使用本领域技术人员已知的肽合成技术来产生。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)(共价连接以形成VH:VL异二聚体)的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽编码接头(例如，约10、15、20、25个氨基酸)连接，所述肽编码接头将VH的N末端与VL的C末端连接或者将VH的C末端与VL的N末端连接。接头通常富含用于灵活性的甘氨酸以及富含用于溶解度的丝氨酸或苏氨酸。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。
尽管除去了恒定区并且引入了接头，但是scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可由包含VH编码序列和VL编码序列的核酸表达，如通过Huston,等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988))所述。还参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公布号20050196754和20050196754。已描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见例如Zhao等人,Hybridoma(Larchmt)27(6):455-51(2008)；Peter等人,J Cachexia Sarcopenia Muscle(2012)；Shieh等人,J Imunol 183(4):2277-85(2009)；Giomarelli等人,Thromb Haemost 97(6):955-63(2007)；Fife等人,J ClinInvst 116(8):2252-61(2006)；Brocks等人,Immunotechnology 3(3):173-84(1997)；Moosmayer等人,Ther Immunol 2(10):31-40(1995)。已描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见例如Peter等人,J Biol Chem 25278(38):36740-7(2003)；Xie等人,Nat Biotech 15(8):768-71(1997)；Ledbetter等人,Crit Rev Immunol 17(5-6):427-55(1997)；Ho等人,Bio Chim Biophys Acta1638(3):257-66(2003))。
如本文所用，“F(ab)”是指与抗原结合但是单价的并且没有Fc部分的抗体结构片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个F(ab)片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
如本文所用，“F(ab')2”是指通过对整个IgG抗体进行胃蛋白酶消化而产生的抗体片段，其中此片段具有两个抗原结合(ab1)(二价)区，其中每个(ab1)区包含两个单独的氨基酸链(用于结合抗原的通过S-S键连接的H链的一部分和轻(L)链)并且其中其余的H链部分连接在一起。可以将“F(ab')2”片段分为两个单独的Fab'片段。
如本文所用，“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其作为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参加例如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,4th U.S.Department of Health and Human Services,National Institutesof Health(1987)。通常，抗体在可变区中包含三个重链和三个轻链CDR或CDR区。CDR提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方案中，使用Kabat***描绘CDR区(Kabat,E.A.,等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(1991))。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有本领域中常见的含义。恒定区是未直接参与抗体与抗原的结合但可展现出各种效应子功能(诸如与Fc受体的相互作用)的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域更保守的氨基酸序列。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语并且可以是指抗体可以免疫特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如由一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域一起形成(构象、非线性、不连续或非连续表位)。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子。特别地，配体结合另一细胞上的受体，从而允许细胞与细胞间的识别和/或相互作用。
如本文所用，术语“亲和力(affinity)”意指对结合强度的度量。不受理论的束缚，亲和力取决于在抗体的结合位点与抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密度、它们之间的接触区域的尺寸、和带电荷和疏水基团的分布。亲和力也包括术语“亲合力(avidity)”，亲合力是指在形成可逆复合物(例如，单价或多价的)后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能测定(例如，流式细胞术测定)中的抗体活性也反映了抗体亲和力。可以使用功能测定(例如，流式细胞术测定)在表型上表征和比较抗体和亲和力。当前公开的主题中有用的核酸分子包括编码多肽或其片段的任何核酸分子。在某些实施方案中，当前公开的主题中有用的核酸分子包括编码抗体或其抗原结合部分的核酸分子。此类核酸分子不必与内源核酸序列100％相同，但是将典型地展现出显著的同一性。相对于内源性序列具有“显著的同源性”或“显著的同一性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间配对以形成双链分子。(参见例如Wahl,G.M.和S.L.Berger,Methods Enzymol.152:399(1987)；Kimmel,A.R.,Methods Enzymol.152:507(1987))。
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”是抗体背景下的类似术语并且是指经由抗原结合位点结合抗原(例如表位或免疫复合物)的抗体及其抗原结合片段，如本领域技术人员理解的，并且不排除抗体或抗原结合片段与其他抗原的交叉反应性。
术语“基本上同源的”或“基本上相同的”意指展现出相对于参考氨基酸序列(例如，本文描述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任何一种核酸序列)至少50％或更大同源性或同一性的多肽或核酸分子。例如，相对于用于比较的序列(例如，野生型或天然序列)，此类序列在氨基酸水平或核酸上是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％同源或相同的。在一些实施方案中，相对于用于比较的序列，基本上同源或基本上相同的多肽含有一个或多个氨基酸的氨基酸取代、***、或缺失。在一些实施方案中，基本上同源或基本上相同的多肽含有一个或多个非天然氨基酸或氨基酸类似物(包括D-氨基酸和逆反氨基酸)以替代同源序列。
典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(大学大道1710，麦迪逊，威斯康星州53705)遗传计算组的序列分析软件包(Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin BiotechnologyCenter)，BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同源性或序列同一性。此类软件通过对不同的取代、缺失和/或其他修饰分配同源性程度而将相似的序列进行匹配。在确定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程序，其中在e-3与e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
如本文所用，术语“类似物”是指具有参考多肽或核酸分子的功能的结构相关的多肽或核酸分子。
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变当前公开的包含氨基酸序列的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入当前公开的抗MUC16抗体或其抗原结合片段的人scFv中。氨基酸可以根据其理化特性(诸如电荷和极性)分为若干组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相同基团的氨基酸残基替代的取代。例如氨基酸可以通过电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。另外，氨基酸可以通过极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被同一组中的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能(即，在上面(c)至(1)中列出的功能)。在某些实施方案中，改变指定序列或CDR区中不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基。
如本文所用，术语“异源核酸分子或多肽”是指通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。这种核酸可来自另一种生物体，或者它可以是例如在细胞或样品中通常不表达的mRNA分子。
如本文所用，术语“调节”是指正或负改变。示例性的调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、或约100％的变化。
如本文所用，术语“增加”是指正改变至少约5％，包括但不限于正改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。
如本文所用，术语“减少”是指负改变至少约5％，包括但不限于负改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源(例如在小鼠或人体内)的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)在通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，语言“基本上不含”包括具有少于约15％、10％、5％、2％)、1％)、0.5％)或0.1％)的其他材料(例如，细胞材料、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学品)的多核苷酸或核酸分子的制剂。
如本文所用，术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。
“有效量”(或“治疗有效量”)是在治疗时足以影响有益或希望的临床结果的量。可以将有效量以一个或多个剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病(例如，瘤形成)的进展或在其他方面减轻疾病(例如，瘤形成)的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况来确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。在确定实现有效量的适当剂量时，通常考虑若干个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重性以及所施用的工程化免疫细胞的形式和有效浓度。
如本文所用，术语“瘤形成”是指以细胞或组织的病理增生及其随后向其他组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。瘤形成的生长典型地是不受控制和进行性的，并且在不会引起或不会导致正常细胞增殖停止的条件下发生。瘤形成可以影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、结肠、骨、脑、***、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、***、神经组织、卵巢、胸膜、胰腺、***、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和***、或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，诸如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
如在此使用的，“治疗(treating或treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病历程的临床干预，并且可以进行用于预防或在临床病理学历程期间进行。治疗的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态、以及缓解或改善预后。通过预防疾病或障碍的进展，治疗可以防止在受影响或诊断的受试者或怀疑患有障碍的受试者中由于所述障碍引起的恶化，而且治疗还可以预防处于所述障碍风险中或怀疑患有所述障碍的受试者的障碍的发作或障碍的症状。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、啮齿动物等(例如，有待成为特定治疗的接受者或从其中收获细胞)。
抗MUC16抗体剂
本文提供了免疫特异性结合MUC16的抗MUC16抗体剂。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂免疫特异性结合MUC16的保留细胞外结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是包含免疫特异性结合MUC16的抗体部分的抗MUC16构建体。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是抗MUC16抗体(例如，全长抗MUC16抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂结合表达MUC16的细胞(例如表达MUC16的癌细胞)。
抗MUC16抗体剂诸如抗MUC16抗体或其抗原结合片段可以包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体(BsAb))、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scFv)、驼源化抗体、亲和体(affybody)和二硫键连接的Fv(dsFv)、Fc融合蛋白、免疫缀合物或其片段。此类抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的方法制成。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是特异性结合MUC16的全长抗体(例如，全长IgG)或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，对免疫特异性结合MUC16的抗体剂的提及意指抗体剂与MUC16结合的亲和力是其对非靶标的结合亲和力的至少约10倍(包括例如至少约10、102、103、104、105、106或107倍中的任一者)。在一些实施方案中，非靶标是并非MUC16的抗原。结合亲和力可以通过本领域已知的方法诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)来确定。Kd可以通过本领域已知的方法诸如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)测定或利用例如Sapidyne仪器的动力排斥测定(KinExA)来确定。
尽管本文深入地讨论了含有人序列(例如，包含人CDR序列的人重链和轻链可变结构域序列)的抗MUC16抗体剂，还考虑非人抗MUC16抗体剂。在一些实施方案中，非人抗MUC16抗体剂包含来自如本文所述的抗MUC16抗体剂的人CDR序列和非人框架序列。在一些实施方案中，非人框架序列包括可用于使用一种或多种如本文所述的人CDR序列生成合成重链和/或轻链可变结构域的任何序列，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、猕猴)等。在一些实施方案中，非人抗MUC16抗体剂包括通过将一种或多种如本文所述的人CDR序列接枝到非人框架序列(例如，小鼠或鸡框架序列)上来生成的抗MUC16抗体剂。
示例性人MUC16的完整氨基酸序列包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂特异性识别人MUC16内的表位。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂特异性识别人MUC16的保留细胞外结构域内的表位。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂免疫特异性结合MUC16胞外域(图1)。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂免疫特异性结合表达人MUC16的细胞。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂免疫特异性结合表达重组MUC16多肽的细胞。在一些实施方案中，MUC16多肽是具有SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列的MUC16-c344。在一些实施方案中，MUC16多肽是具有SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列的MUC16-c114。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与来自除人以外的物种的MUC16多肽交叉反应。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂对人MUC16具有完全特异性并且并未展现出物种或其他类型的非人交叉反应性。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂特异性识别在癌细胞(诸如实体瘤)的细胞表面上表达的MUC16。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂特异性识别在以下中的一种或多种细胞的细胞表面上表达的MUC16：卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、输卵管癌细胞、子宫(例如子宫内膜)癌细胞、原发性腹膜癌细胞或表达MUC16的任何其他组织的癌细胞。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂特异性识别在癌细胞系诸如卵巢癌细胞系(诸如OVCAR3、OVCA-432、OVCA-433和CAOV3)的细胞表面上表达的MUC16。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与MUC16蛋白或其片段的至少一种等位基因变体交叉反应。在一些实施方案中，当与天然存在的MUC16或其片段相比时，等位基因变体具有多至约30个(诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30中的任一者)氨基酸取代，诸如保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂不与MUC16蛋白或其片段的任何等位基因变体交叉反应。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与MUC16蛋白的至少一种物种间变体交叉反应。在一些实施方案中，例如，MUC16蛋白或其片段是人MUC16并且MUC16蛋白的物种间变体或其片段是其小鼠或大鼠变体。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂不与MUC16蛋白的任何物种间变体交叉反应。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何抗MUC16抗体剂，抗MUC16抗体剂包含特异性结合MUC16的抗MUC16抗体部分。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含IgG3重链恒定区。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，IgG4重链恒定区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含λ轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:2的一个、两个或三个HC-CDR的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:2的重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有分别在SEQ ID NO:4、5和6中列出的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:2的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:2中列出的重链可变结构域。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:3的一个、两个或三个LC-CDR的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:3的轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有分别在SEQ ID NO:7、8和9中列出的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:3中列出的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:2的重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:3的轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含分别在SEQ ID NO:4、5和6中列出的重链可变结构域和含有分别在SEQ ID NO:7、8和9中列出的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:2的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:2中列出的重链可变结构域和SEQ ID NO:3中列出的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体重链可变结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其含有多至5(诸如约1、2、3、4或5中任一者)个氨基酸取代或与SEQ ID NO:2具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，轻链可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其含有多至5(诸如约1、2、3、4或5中任一者)个氨基酸取代或与SEQ ID NO:3具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:10的一个、两个或三个HC-CDR的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:10的重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有分别在SEQ ID NO:12、13和14中列出的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:10的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:10中列出的重链可变结构域。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:11的一个、两个或三个LC-CDR的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有SEQ ID NO:11的轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含：含有分别在SEQ ID NO:15、16和17中列出的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:11的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:11中列出的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:10的重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:11的轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含分别在SEQ ID NO:12、13和14中列出的重链可变结构域和含有分别在SEQ ID NO:15、16和17中列出的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含含有SEQ ID NO:10的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:11的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分包含SEQ ID NO:10中列出的重链可变结构域和SEQ ID NO:11中列出的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其含有多至5(诸如约1、2、3、4或5中任一者)个氨基酸取代或与SEQ ID NO:10具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其含有多至5(诸如约1、2、3、4或5中任一者)个氨基酸取代或与SEQ ID NO:11具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体。
示例性抗体序列示出在下表中。表2中的示例性CDR序列是使用IgBLAST算法预测的。参见例如Ye J.等人,Nucleic Acids Research41:W34-W40(2013)，所述文献的披露内容通过引用以其整体并入本文。本领域技术人员将认识到，已知许多算法用于预测抗体重链和轻链可变区中的CDR位置，并且包含来自本文所述的抗体的CDR的但基于除IgBLAST以外的预测算法的抗体剂在本发明的范围内。
示例性抗体重链和轻链可变区序列根据INTERNATIONAL IMMUNOGENETICSINFORMATION
Figure BDA0003154402680000243
(IMGT)来界定。参见例如Lefranc,M.-P.等人,Nucleic AcidsRes.,43:D413-422(2015)，所述文献的披露内容通过引用以其整体并入本文。本领域技术人员将认识到，包含来自本文所述的抗体的VH或VL序列但基于除IMGT以外的算法的抗体剂在本发明的范围内。
表2.示例性抗MUC16抗体CDR序列。
Figure BDA0003154402680000241
表3.示例性抗MUC16抗体VH和VL结构域序列。
Figure BDA0003154402680000242
全长抗MUC16抗体
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是全长抗MUC16抗体。
在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体包含IgG恒定结构域，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中任一者的恒定结构域，包括其变体。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体是全长人抗MUC16抗体。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体包含小鼠免疫球蛋白的Fc序列。在一些实施方案中，全长抗MUC16抗体包含已被改变或以其他方式改变使得其具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应子功能的Fc序列。
因此，例如，在一些实施方案中，提供了一种全长抗MUC16抗体，其包含IgG1或IgG4恒定结构域，其中抗MUC16抗体特异性结合肿瘤细胞上的MUC16。在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。在一些实施方案中，IgG1是人IgG4。在一些实施方案中，抗MUC16重链恒定区包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗MUC16轻链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗MUC16重链恒定区包含SEQID NO:28或29的氨基酸序列或由其组成，并且抗MUC16轻链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗MUC16抗体与表达MUC16的细胞(例如表达MUC16的癌细胞)的结合抑制了肿瘤生长或肿瘤转移或诱导肿瘤的消退。在一些实施方案中，抗MUC16抗体与表达MUC16的细胞(例如表达MUC16的癌细胞)的结合抑制了表达MUC16的细胞的体内Matrigel侵袭。
在一些实施方案中，提供了一种全长抗MUC16抗体，其包含IgG1或IgG4恒定区，其中所述抗MUC16抗体包含：a)重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQID NO:8的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3。在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。在一些实施方案中，IgG4是人IgG4。在一些实施方案中，抗MUC16重链恒定区包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗MUC16轻链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，提供了一种全长抗MUC16抗体，其包含IgG1或IgG4恒定区，其中所述抗MUC16抗体包含：a)重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的LC-CDR3。在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。在一些实施方案中，IgG4是人IgG4。在一些实施方案中，抗MUC16重链恒定区包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗MUC16轻链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成。
嵌合抗MUC16构建体
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是免疫特异性结合MUC16的抗MUC16嵌合抗原受体(CAR)或其变体。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是抗MUC16 CAR。CAR是本领域熟知的，并且抗MUC16抗体剂可以是根据本领域已知的任何CAR的CAR，诸如Sadelain等人,Nature545:423-431(2017)中所述的，所述文献的公开内容明确并入本文中以用于本发明并且可能包含在本文的一条或多条权利要求中。在一些实施方案中，抗MUC16 CAR包含根据本文所述的任何抗MUC16抗体部分的抗MUC16抗体部分。例如，在一些实施方案中，提供了包含抗MUC16抗体部分的抗MUC16 CAR。在一些实施方案中，抗MUC16 CAR的抗MUC16抗体部分包含：a)抗体重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3。在一些实施方案中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16 CAR的抗MUC16抗体部分包含：a)重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:17的LC-CDR3。在一些实施方案中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是包含T细胞受体(TCR)跨膜结构域的抗MUC16嵌合受体。例如，在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是如PCT专利申请公布号WO2017070608中所述的抗体-T细胞受体(abTCR)，所述专利的披露内容明确并入本文中以用于本发明并且可能包含在本文中的一条或多条权利要求中。在一些实施方案中，抗MUC16abTCR包含根据本文所述的任何抗MUC16抗体部分的抗MUC16抗体部分。例如，在一些实施方案中，提供了包含抗MUC16抗体部分的抗MUC16 abTCR。
在一些实施方案中，抗MUC16 abTCR的抗MUC16抗体部分包含：a)抗体重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3。在一些实施方案中，抗MUC16 abTCR的重链可变结构域包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16 abTCR的抗MUC16抗体部分包含：a)重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQID NO:17的LC-CDR3。在一些实施方案中，抗MUC16 abTCR的重链可变结构域包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是包含特异性结合MUC16的抗MUC16抗体部分和共刺激信号传导结构域的嵌合共刺激受体。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体能够刺激免疫细胞，其在所述免疫细胞的表面上在结合MUC16后功能性表达。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体包含含有抗MUC16抗体部分、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的单一多肽链。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链一起形成抗MUC16抗体部分、跨膜模块和包含共刺激信号传导结构域的共刺激信号传导模块。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链是单独的多肽链，并且抗MUC16嵌合共刺激受体是多聚体，诸如二聚体。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链共价连接，诸如通过肽键、或通过另一种化学键，诸如二硫键。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施方案中，抗MUC16抗体部分是Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、或单链Fv(scFv)。
用于本发明的抗MUC16嵌合共刺激受体中的共刺激免疫细胞信号传导结构域的例子包括T细胞受体(TCR)的共受体的细胞质序列(其可以与嵌合受体(例如CAR或abTCR)协同作用以在嵌合受体接合之后起始信号转导)，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
已知通过单独的TCR生成的信号不足以完全活化R细胞并且还需要第二或共刺激信号。因此，T细胞活化被认为通过两种不同类别的细胞内信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些(在本文中称为“初级免疫细胞信号传导序列”)和以抗原独立性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(在本文中称为“共刺激免疫细胞信号传导序列”)。
以刺激方式起作用的初级免疫细胞信号传导序列可以含有称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级免疫细胞信号传导序列的例子包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。“功能性”初级免疫细胞信号传导序列是当可操作地偶合至适当的受体时能够转导免疫细胞活化信号的序列。“非功能性”初级免疫细胞信号传导序列可包含初级免疫细胞信号传导序列的片段或变体，不能转导免疫细胞活化信号。本文所述的抗MUC16嵌合共刺激受体缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列，诸如包含ITAM的功能性信号传导序列。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
共刺激免疫细胞信号传导序列可以是共刺激分子的细胞内结构域的一部分，所述共刺激分子包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。
在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体的抗MUC16抗体部分包含：a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3。在一些实施方案中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体的抗MUC16抗体部分包含：a)重链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；和b)轻链可变结构域，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的LC-CDR3。在一些实施方案中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其具有至少约95％(例如至少约96％、97％、98％或99％中任一者)序列同一性的变体，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其具有至少约95％序列同一性的变体。
在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体在免疫细胞中表达。在一些实施方案中，抗MUC16嵌合共刺激受体在表达另一种嵌合受体的免疫细胞中表达。在一些实施方案中，其他嵌合受体是CAR或abTCR。在一些实施方案中，其他嵌合受体结合MUC16。在一些实施方案中，其他嵌合受体不结合MUC16。在一些实施方案中，其他嵌合受体结合与特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症相关的抗原。在一些实施方案中，其他嵌合受体结合与本文所述的任何癌症(诸如肾癌、***、***癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌或***癌)相关的抗原。在一些实施方案中，其他嵌合受体结合与肾癌相关的抗原。在一些实施方案中，肾癌是肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，RCC是转移性RCC。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞中抗MUC16嵌合共刺激受体的表达是可诱导的。在一些实施方案中，免疫细胞中抗MUC16嵌合共刺激受体的表达是在通过其他嵌合受体进行信号传导后可诱导的。
结合亲和力
结合亲和力可由Kd、Koff、Kon或Ka表示。如本文所用，术语“Koff”旨在是指抗体剂从抗体剂/抗原复合物解离的解离速率常数，如由动力学选择设置所确定。如本文所用，术语“Kon”旨在是指由抗体剂与抗原缔合以形成抗体剂/抗原复合物的结合速率常数。如本文所用，术语平衡解离常数“Kd”是指特定抗体剂-抗原相互作用的解离常数，并且描述了在平衡时抗原占据存在于抗体剂分子溶液中的所有抗体结合结构域的一半所需要的浓度，并且等于Koff/Kon。Kd的测量假定所有结合剂均处于溶液中。在抗体剂连接至例如酵母表达***中的细胞壁的情况下，相应的平衡速率常数表示为EC50，其给出了Kd的良好近似值。亲和力常数Ka是解离常数Kd的倒数。
解离常数(Kd)用作显示抗体部分与抗原的亲和力的指示。例如，可以通过Scatchard方法使用以多种标记剂标记的抗体剂以及根据使用者手册和所附试剂盒通过使用Biacore(由Amersham Biosciences制造)即通过表面等离子体共振分析生物分子相互作用来进行简易分析。可使用这些方法推导的Kd值以单位M(摩尔)表示。特异性结合靶标的抗体剂的Kd可为例如≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、≤10-12M或≤10-13M。
抗体剂的结合特异性可以经实验方式通过本领域已知的方法来确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIAcore测试和肽扫描。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂的结合亲和力通过测试抗MUC16抗体剂与在表面上表达MUC16的细胞(例如HepG2细胞)的结合亲和力来测量。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂特异性结合靶标MUC16(例如，nMUC16)的Kd为约10-7M至约10-13M(诸如约10-7M至约10-13M、约10-9M至约10-13M或约10-10M至约10-12M)。因此，在一些实施方案中，抗nMUC16抗体剂与nMUC16之间的结合的Kd、抗sMUC16抗体剂与sMUC16之间的结合的Kd、或抗MUC16抗体剂与MUC16(任何形式)之间的结合的Kd是约10-7M至约10- 13M、约1×10-7M至约5×10-13M、约10-7M至约10-12M、约10-7M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-7M至约10-9M、约10-8M至约10-13M、约1×10-8M至约5×10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-8M至约10-11M、约10-8M至约10-10M、约10-8M至约10-9M、约5×10-9M至约1×10-13M、约5×10-9M至约1×10-12M、约5×10-9M至约1×10-11M、约5×10-9M至约1×10-10M、约10-9M至约10-13M、约10-9M至约10-12M、约10-9M至约10-11M、约10-9M至约10-10M、约5×10-10M至约1×10-13M、约5×10-10M至约1×10-12M、约5×10-10M至约1×10-11M、约10-10M至约10-13M、约1×10-10M至约5×10-13M、约1×10-10M至约1×10-12M、约1×10-10M至约5×10-12M、约1×10-10M至约1×10-11M、约10-11M至约10-13M、约1×10-11M至约5×10-13M、约10-11M至约10-12M或约10-12M至约10-13M。在一些实施方案中，抗nMUC16抗体剂与nMUC16之间的结合的Kd是约10-7M至约10-13M。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与非靶标之间的结合的Kd大于抗MUC16抗体剂与靶标之间的结合的Kd，并且在本文中在一些实施方案中称为抗MUC16抗体剂与靶标(例如细胞表面结合的MUC16)的结合亲和力高于与非靶标的结合亲和力。在一些实施方案中，非靶标是并非MUC16的抗原。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂(针对nMUC16)与非MUC16靶标之间的结合的Kd可以是抗MUC16抗体剂与靶标MUC16之间的结合的Kd的至少约10倍，诸如约10-100倍、约100-1000倍、约103-104倍、约104-105倍、约105-106倍、约106-107倍、约107-108倍、约108-109倍、约109-1010倍、约1010-1011倍或约1011-1012倍。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与非靶标结合的Kd为约10-1M至约10-6M(诸如约10-1M至约10-6M、约10-1M至约10-5M或约10-2M至约10-4M)。在一些实施方案中，非靶标是并非MUC16的抗原。因此，在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂与非MUC16靶标之间的结合的Kd是约10-1M至约10-6M、约1×10-1M至约5×10-6M、约10-1M至约10-5M、约1×10-1M至约5×10-5M、约10-1M至约10-4M、约1×10-1M至约5×10-4M、约10-1M至约10-3M、约1×10-1M至约5×10-3M、约10-1M至约10-2M、约10-2M至约10-6M、约1×10-2M至约5×10-6M、约10-2M至约10-5M、约1×10-2M至约5×10-5M、约10-2M至约10-4M、约1×10-2M至约5×10-4M、约10-2M至约10-3M、约10-3M至约10- 6M、约1×10-3M至约5×10-6M、约10-3M至约10-5M、约1×10-3M至约5×10-5M、约10-3M至约10-4M、约10-4M至约10-6M、约1×10-4M至约5×10-6M、约10-4M至约10-5M或约10-5M至约10-6M。
在一些实施方案中，当提及抗MUC16抗体剂以高结合亲和力特异性识别靶标MUC16(例如，细胞表面结合的MUC16)并且以低结合亲和力结合非靶标时，抗MUC16抗体剂将以约10-7M至约10-13M(诸如约10-7M至约10-13M、约10-9M至约10-13M或约10-10M至约10-12M)的Kd结合靶标MUC16(例如，细胞表面结合的MUC16)，并且将以约10-1M至约10-6M(诸如约10-1M至约10- 6M、约10-1M至约10-5M或约10-2M至约10-4M)的Kd结合非靶标。
在一些实施方案中，当提及抗MUC16抗体剂特异性识别细胞表面结合的MUC16时，将抗MUC16抗体剂的结合亲和力与对照抗MUC16抗体剂相比较。在一些实施方案中，对照抗MUC16抗体剂与细胞表面结合的MUC16之间的结合的Kd可以是本文所述的抗nMUC16抗体剂与细胞表面结合的MUC16之间的结合的Kd的至少约2倍，诸如约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约10-100倍、约100-1000倍、约103-104倍、约104-105倍、约105-106倍、约106-107倍、约107-108倍、约108-109倍、约109-1010倍、约1010-1011倍或约1011-1012倍。
抗Muc16抗体剂的功能活性
在某些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段抑制以重组方式表达MUC16多肽的细胞的体外Matrigel侵袭。在一些实施方案中，MUC16包含SEQ ID NO:25(MUC16 c114)。在某些实施方案中，以重组方式表达糖基化MUC16 c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，MUC16多肽被糖基化。在某些实施方案中，MUC16多肽的糖基化形式是在氨基酸残基Asn30(对应于成熟MUC16(SEQ ID NO:1)的Asnl806)处被N糖基化。在某些实施方案中，MUC16多肽在氨基酸残基Asn24和Asn30(分别对应于成熟MUC16(SEQ ID NO:1)的Asnl800和Asnl806)处被N糖基化。在某些实施方案中，MUC16多肽在SEQ ID NO:25的氨基酸残基Asnl、Asn24和Asn30(在Yin和Lloyd(2001)J Biol Chem 276:27371-27375中，也分别称为Asn1777、Asn1800和Asn1806)处被N糖基化。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的几丁二糖。在某些实施方案中，糖基化由N连接的几丁二糖组成。在某些实施方案中，Matrigel侵袭与用对照抗体(例如不靶向MUC16的抗体)处理细胞的细胞的体外Matrigel侵袭相比受到至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍抑制。在某些实施方案中，Matrigel侵袭与用对照抗体(例如不靶向MUC16的抗体)处理细胞的细胞体外Matrigel侵袭相比受到约1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍抑制。
用以确定MUC16抗MUC16抗体剂或抗原结合片段介导的对Matrigel侵袭的抑制的测定是本领域技术人员已知的。例如，BD BioCoatTM MatrigelTM侵袭***物或腔室(目录号354480，24孔板)和对照***物(目录号354578，24孔板)可以购自BD Biosciences,MA。Matrigel侵袭测定可以根据制造商方案来执行。简言之，使24孔板中的Matrigel腔室(保存在-20℃下)和对照***物(保存在4℃下)达到室温。在37℃5％CO2湿润孵育器中将两种***物用在24孔板的***物以及外孔中的0.5mL无血清培养基再水合2小时。将培养的SKOV3细胞用胰蛋白酶处理并且用培养基洗涤。将一百万个细胞分到另一个离心管中并且用无血清培养基洗涤3次。随后调节这些细胞，以给出0.5mL无血清培养基中的5,000个细胞。去除再水合***物中的培养基，并且将***物转移到具有0.75mL的含有10％胎牛血清(FBS)的培养基的新24孔板中，所述培养基在孔中用作化学引诱物。立即，将0.5mL无血清培养基中的细胞(5,000个细胞)添加到***物中。适当注意在***物和外孔中没有气泡截留。将24孔板在37℃5％C02湿润孵育器中孵育48h。在孵育后，将非侵袭细胞通过以下方式从膜的外面去除：将棉签拭子***Matrigel或对照***物中来进行“擦拭”，并且轻轻施加压力，同时在膜表面上移动拭子尖端。使用以培养基润湿的第二拭子重复擦拭。然后，在含有0.5mL的在蒸馏水中的0.5％结晶紫染料的新24孔板中将***物染色30分钟。在染色后，将***物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以去除过量染料。将***物在新24孔板中风干。在倒置显微镜下在200x倍放大率下手动计数被侵袭的细胞。对三次重复的膜的若干视野进行计数并且记录在图中。
在某些实施方案中，在小鼠模型研究中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段能够抑制或减少转移、抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退。例如，可以将肿瘤细胞系引入到无胸腺的裸鼠中，并且可以向无胸腺小鼠施用一次或多次本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段，并且可以在数周和/或数月时间段内监测注射的肿瘤细胞的肿瘤进展。在一些情况下，向无胸腺的裸鼠施用抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段可以在引入肿瘤细胞系之前进行。在某一实施方案中，对于本文所述的小鼠异种移植模型，利用表达MUC16 c114的SKOV3细胞。
在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在小鼠模型中与模拟物处理的小鼠相比抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在小鼠模型中与模拟物处理的小鼠相比抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约25％或35％)，任选地至约75％，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在小鼠模型中与模拟物处理的小鼠相比抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。模拟物处理的小鼠可以例如用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如抗IgG抗体)处理。
确定肿瘤生长抑制或肿瘤消退可以例如通过监测一定时间段内的肿瘤尺寸(诸如通过对可触摸肿瘤进行物理测量)或其他目视检测方法来评估。例如，肿瘤细胞系可以被生成来重组表达可视化剂，诸如绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶，然后GFP的体内可视化可以通过显微镜进行，并且萤光素酶的体内可视化可以通过向异种移植小鼠施用萤光素酶底物并检测由于萤光素酶加工萤光素酶底物而产生的冷光来进行。GFP或萤光素酶的检测程度或水平与异种移植小鼠中肿瘤的尺寸相关。
在某些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段可以在肿瘤异种移植模型中与模拟物处理的小鼠相比增加动物的存活。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在肿瘤异种移植模型中与模拟物处理的小鼠相比使小鼠存活增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在肿瘤异种移植模型中与在肿瘤异种移植模型中模拟物处理的小鼠相比使小鼠存活增加至少约25％或35％，任选地至约75％)，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。在一些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在肿瘤异种移植模型中与在肿瘤异种移植模型中模拟物处理的小鼠相比使小鼠存活增加至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所述或本领域技术人员已知的方法评估。存活可以例如通过对存活小鼠数目相对于在肿瘤细胞系注射之后的时间(例如天数或周数)绘制存活曲线来确定。模拟物处理的小鼠可以例如用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如抗IgG抗体)处理。
在某些实施方案中，在使细胞与抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段接触后，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段内化到表达MUC16多肽的细胞中。“内化(Internalized或internalization)”当参考由细胞内化的分子时是指与细胞膜的细胞外表面接触的分子跨越细胞膜至细胞膜的细胞内表面和/或细胞质中的行程。在某些实施方案中，以重组方式表达糖基化MUC16 c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施方案中，MUC16c114的糖基化形式例如在SEQ ID NO:25的Asnl、Asn24和Asn30(在Yin和Lloyd(2001)JBiol Chem 276:27371-27375中，也分别称为Asn1777、Asn1800和Asn1806)处被N糖基化。在某些实施方案中，糖基化包含N连接的几丁二糖。在某些实施方案中，糖基化由N连接的几丁二糖组成。
例如使用放射性标记的抗体确定本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段内化到细胞中的测定是本领域技术人员已知的。例如，在表达MUC16 c114的SKOV3细胞上研究89Zr-标记的抗体的内化。简言之，将大约1x105个细胞接种在12孔板中并且在37℃5％CO2孵育器中孵育过夜。将一定体积的放射性标记的抗体添加到每个孔并且将板在37℃和4℃下孵育1、5、12和24小时。在每个孵育时间段之后，收集培养基并且将细胞用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。通过在4℃下用1mL具有100mM甘氨酸的100mM乙酸(1:1，pH 3.5)洗涤细胞来收集表面结合的活性。然后用1mL 1M NaOH裂解粘附细胞。收集每次的洗涤液并且针对活性进行计数。使用最终洗涤的活性与所有洗涤的总活性的比率来确定内化％。在某些实施方案中，在37℃下进行测定。在某些实施方案中，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段被内化到与抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段一起孵育的至少1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％、9％或10％细胞中。在某些实施方案中，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段被内化到与抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段一起孵育的约1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％、9％或10％细胞中。在某些实施方案中，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在使细胞与抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段接触1、2、3、4、8、12、16、20或24小时内被内化。
核酸
还考虑编码抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)的核酸分子。在一些实施方案中，提供了一种核酸(或一组核酸)，其编码全长抗MUC16抗体(包括任何本文所述的全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，编码本文所述的抗MUC16抗体剂的核酸(或一组核酸)可进一步包含编码肽标签(诸如蛋白质纯化标签，例如His-标签、HA标签)的核酸序列。
在此还考虑了分离的宿主细胞，其包含本文所述的抗MUC16抗体剂、编码抗MUC16抗体剂的多肽组分的分离的核酸或包含编码抗MUC16抗体剂的多肽组分的核酸的载体。
本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包含在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的抗MUC16抗体剂(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)、其抗原结合片段或抗MUC16抗体部分的核酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明还提供了载体，其中***了本发明的核酸。
在发明内容中，由编码抗MUC16抗体剂的天然或合成核酸表达抗MUC16抗体剂(例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段可以通过将核酸***到适当表达载体，使得核酸可操作地连接至5’和3’调节元件(包括例如启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR))来实现。载体可适用于在真核宿主细胞中复制和整合。典型克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列的表达的启动子。
本发明的核酸也可以用于使用标准基因递送方案进行的核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域中已知的。参见美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本发明提供了一种基因疗法载体。
核酸可以克隆到许多类型的载体中。例如，核酸可以克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，表达载体可以按病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Green和Sambrook(2013,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记物(参见例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已开发许多基于病毒的***用于向哺乳动物细胞中进行基因转移。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送***的便利平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因***载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并且在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒***是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是适用于实现长期基因转移的工具，因为它们允许长期稳定整合转基因并使其在子代细胞中传播。慢病毒载体具有相对于源自致癌逆转录病毒诸如鼠类白血病病毒的载体增加的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的增加的优点。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp区域内，但最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，使得当元件相对于彼此反转或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。
合适启动子的一个例子是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸高水平表达的强组成型启动子序列。合适启动子的另一个例子是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明应不限于使用组成型启动子。还考虑诱导型启动子作为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭所述表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂的表达是诱导型的。在一些实施方案中，编码抗MUC16抗体剂的核酸可操作地连接至诱导型启动子，包括本文所述的任何诱导型启动子。
诱导型启动子
使用诱导型启动子提供分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭所述表达。用于真核细胞中的示例性诱导型启动子***包括但不限于激素调节元件(参见例如Mader,S.和White,J.H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607(1993))、合成配体调节元件(参见例如Spencer,D.M等人1993)Science 262:1019-1024)和电离辐射调节元件(参见例如Manome,Y.等人,Biochemistry 32:10607-10613(1993)；Datta,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1014-10153(1992))。用于体外或体内哺乳动物***中的其他示例性诱导型启动子***综述于Gingrich等人,Annual Rev.Neurosci 21:377-405(1998)中。在一些实施方案中，用于表达抗MUC16抗体剂的诱导型启动子***是Tet***。在一些实施方案中，用于表达抗MUC16抗体剂的诱导型启动子***是来自大肠杆菌的lac阻遏物***。
用于本发明的示例性诱导型启动子***是Tet***。此类***基于由Gossen等人,(1993)所述的Tet***。在一个示例性实施方案中，目的多核苷酸是处于包含一个或多个Tet操纵子(TetO)位点的启动子的控制下。在无活性状态下，Tet阻遏物(TetR)将结合TetO位点并且阻遏来自启动子的转录。在活性状态下，例如在诱导剂诸如四环素(Tc)、无水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的存在下，诱导剂引起TetR从TetO释放，从而允许发生转录。多西环素是四环素抗生素家族的成员，具有化学名1-二甲基氨基-2,4a,5,7,12-五羟基-11-甲基-4,6-二氧代-1,4a,11,11a,12,12a-六氢并四苯-3-甲酰胺。
在一个实施方案中，TetR经密码子优化以用于在哺乳动物细胞例如鼠类细胞或人细胞中表达。由于遗传密码的简并性，大部分氨基酸由超过一个密码子编码，从而允许给定核酸的核苷酸序列中的大量变化，而不存在由核酸编码的氨基酸序列的任何改变。然而，许多生物体在密码子使用方面表现出差异，这称为“密码子偏向”(即，对于给定氨基酸偏向使用一种或多种特定密码子)。密码子偏向通常与特定密码子的主要tRNA种类的存在相关，这进而增加mRNA翻译的效率。因此，源自特定生物体(例如原核生物)的编码序列可以通过密码子优化进行定制以用于改进在不同生物体(例如真核生物)中的表达。
Tet***的其他特异性变化包括以下“Tet-Off”和“Tet-On”***。在Tet-Off***中，转录在Tc或Dox的存在下无活性。在该***中，四环素控制的反式活化因子蛋白(tTA)由与来自单纯疱疹病毒的VP16的强反式活化结构域融合的TetR构成，调节在四环素响应性启动子元件(TRE)的转录控制下的靶核酸的表达。TRE由与启动子(通常为源自人巨细胞病毒(hCMV)即刻早期启动子的微小启动子序列)融合的TetO序列多联体构成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA结合TRE并活化靶基因的转录。在Tc或Dox的存在下，tTA不能结合TRE，并且来自靶基因的表达保持无活性。
相反，在Tet-Off***中，转录在Tc或Dox的存在下有活性。Tet-On***基于四环素控制的反式活化因子rtTA。与tTA一样，rtTA是由TetR阻遏物和VP16反式活化结构域构成的融合蛋白。然而，TetR DNA结合部分中的四个氨基酸变化改变了rtTA的结合特征，使得其可仅在Dox的存在下识别靶转基因的TRE中的tetO序列。因此，在Tet-On***中，TRE调节的靶基因的转录仅在Dox的存在下由rtTA刺激。
另一种诱导型启动子***是来自大肠杆菌的lac阻遏物***(参见Brown等人,Cell 49:603-612(1987))。lac阻遏物***通过调节可操作地连接至包含lac操纵子(lacO)的启动子的目的多核苷酸的转录来起作用。lac阻遏物(lacR)结合LacO，从而预防目的多核苷酸的转录。目的多核苷酸的表达由合适诱导剂例如异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或二者，以便于从寻求通过病毒载体被转染或感染的细胞群中鉴定并选择表达细胞。在其他方面，选择标记物可以携带在一片单独的DNA上并且用于共转染程序。选择标记物和报告基因二者可以侧接适当的调节序列以在宿主细胞中实现表达。有用的选择标记物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因用于鉴定潜在感染的细胞并用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因：在接受者生物体或组织中不存在或不表达，并且编码如下多肽：其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。在已将DNA引入到接受者细胞中之后合适的时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tel等人,2000FEBSLetters479:79-82)。合适的表达***是熟知的并且可使用已知技术制备或在商业上获得。通常，将具有最小5’侧接区域且显示报告基因的最高表达水平的构建体鉴定为启动子。此类启动子区域可以连接至报告基因，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中，提供了核酸，其编码根据任何本文所述的全长抗MUC16抗体的全长抗MUC16抗体。在一些实施方案中，核酸包含编码全长抗MUC16抗体的重链和轻链的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列各自包含在单独的载体中。在一些实施方案中，核酸序列中的至少一些包含在同一载体中。在一些实施方案中，所有核酸序列均包含在同一载体中。载体可以选自例如哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的那些)。
将基因引入细胞并将其在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域中熟知的。参见例如Green和Sambrook(2013,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。在一些实施方案中，将多核苷酸引入宿主细胞中是通过磷酸钙转染进行的。
将目的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因***哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散***，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒、和基于脂质的***(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体***是脂质体(例如，人造膜囊)。
在利用非病毒递送***的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质配制品以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一方面，核酸可以与脂质关联。与脂质关联的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体关联的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的测定以鉴定属于本发明范围内的药剂。
抗MUC16抗体剂和抗MUC16抗体部分的制备
在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是单克隆抗体或源自单克隆抗体。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂包含来自单克隆抗体的VH和VL结构域或其变体。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂进一步包含来自单克隆抗体的CH1和CL结构域或其变体。单克隆抗体可以例如使用本领域已知的方法来制备，所述方法包括杂交瘤方法、噬菌体展示方法或使用重组DNA方法。另外，在本文中和以下实施例中描述了示例性噬菌体展示方法。
在杂交瘤方法中，通常将仓鼠、小鼠或其他适当宿主动物用免疫剂进行免疫，以引发产生或能够产生将特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可在体外进行免疫。免疫剂可以包括目的蛋白质的多肽或融合蛋白。一般而言，如果需要人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或***细胞。然后使用适宜融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是经转化哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可将杂交瘤细胞在适宜培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，其防止HGPRT缺陷型细胞生长。
在一些实施方案中，永生化细胞系有效融合，支持所选抗体产生细胞中抗体的稳定高水平表达，并且对诸如HAT培养基等培养基敏感。在一些实施方案中，永生化细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，其可以例如从加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center)和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。也已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对所述多肽的单克隆抗体的存在。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。此类技术和测定是本领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定所需的杂交瘤细胞后，可以将克隆通过有限稀释程序进行亚克隆，并且通过标准方法生长。Goding,同上。用于这个目的的合适培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基和RPMI-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以作为哺乳动物中的腹水在体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水液体分离或纯化，所述纯化程序如例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何抗MUC16抗体剂，抗MUC16抗体剂包含来自选自抗体文库(诸如呈现scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。克隆可以通过针对具有一种或多种所需活性的抗体片段筛选组合文库来鉴定。例如，用于产生噬菌体展示文库并且针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的多种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑,Human Press,Totowa,N.J.,2001)并且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,编辑,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库(repertoire)，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述的针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库。噬菌体通常展示作为scFv片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫源的文库在不需要构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。可替代地，可以克隆天然库(例如，从人)以在不进行任何免疫的情况下提供针对多种非自身和自身抗原的单一来源的抗体，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并且完成体外重排合成地制备天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开案包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
抗MUC16抗体剂可以使用噬菌体展示针对对靶标MUC16(例如nMUC16)具有特异性的抗MUC16抗体部分筛选文库来制备。文库可以是人scFv噬菌体展示文库，其具有至少1x109(诸如至少约1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011中任一者)个独特的人抗体片段。在一些实施方案中，文库是由从来自健康供体的人PMBC和脾脏提取的DNA构建的原初人文库，涵盖所有人重链和轻链亚家族。在一些实施方案中，文库是由从自患有各种疾病的患者诸如患有自身免疫性疾病的患者、癌症患者和患有感染性疾病的患者分离的PBMC提取的DNA构建的原初人文库。在一些实施方案中，文库是半合***库，其中重链CDR3被完全随机化，其中所有氨基酸(除了半胱氨酸)同等可能地存在于任何给定位置(参见例如Hoet,R.M.等人,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施方案中，半合***库的重链CDR3的长度为约5至约24(诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中任一者)个氨基酸。在一些实施方案中，文库是完全合成噬菌体展示文库。在一些实施方案中，文库是非人噬菌体展示文库。
以高亲和力结合靶标MUC16(例如nMUC16)的噬菌体克隆可以通过使噬菌体迭代结合靶标MUC16(其结合至固体支持物(例如像用于溶液淘选的珠粒或用于细胞淘选的哺乳动物细胞))、随后去除未结合噬菌体并洗脱特异性结合的噬菌体来选择。然后洗脱结合的噬菌体克隆并将其用于感染适当的宿主细胞，诸如大肠杆菌XL1-Blue，以用于表达和纯化。在细胞淘选的例子中，将在细胞表面上过度表达MUC16的HEK293细胞与噬菌体文库混合，之后收集细胞并洗脱结合的克隆并将其用于感染适当的宿主细胞以用于表达和纯化(参见所有实施例)。可以使用溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(诸如约2、3、4、5、6或更多轮中任一者)淘选，以富集特异性结合靶标MUC16的噬菌体克隆。可以通过本领域已知的任何方法(包括例如ELISA和FACS)测试富集的噬菌体克隆与靶标MUC16的特异性结合。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法来制备，所述方法诸如美国专利号4,816,567中所述的那些。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。如上文所述的杂交瘤细胞或本发明的MUC16特异性噬菌体克隆可以用作此DNA来源。一旦分离出，就可以将DNA放入表达载体中，然后将所述表达载体转染到原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。还可以例如通过以下方式修饰所述DNA：用人重链和轻链恒定结构域和/或框架区的编码序列取代同源非人序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,同上)或将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价接合至免疫球蛋白编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体剂的恒定结构域，或者可以取代本发明的抗体剂的一个抗原组合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体剂。
所述抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。重链通常在Fc区的任一点处截短，以便预防重链交联。可替代地，相关半胱氨酸残基用另一个氨基酸残基取代或缺失以预防交联。
体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的任何方法来完成抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段。
具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域可以融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。融合物优选地具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分。在一些实施方案中，含有轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA***到分开的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。
人和人源化抗体
抗MUC16抗体剂(例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段可以是人源化抗体剂或人抗体剂。非人(例如鼠类)抗体部分的人源化形式是通常含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体部分包含人免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔等的非人物种(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体部分还可以包含既未发现于接受者抗体中也未发现于输入CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体可以基本上包含至少一个(并且通常是两个)可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。
总体上，人源化抗体剂具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。根据一些实施方案，人源化可以基本上根据Winter和同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体部分是如下抗体部分(美国专利号4,816,567)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体部分通常是人抗体部分，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。
作为人源化的替代方案，可以生成人抗体部分。例如，现在有可能产生在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下能够在免疫后产生人抗体完整组库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原激发后产生人抗体。参见例如Jakobovits等人,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669；5,545,807；以及WO 97/17852。可替代地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中来制成，所述动物例如为其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全灭活的小鼠。在激发后，观察到人抗体产生，这密切类似于在人中在所有方面看到的情况，包括基因重排、组装和抗体组库。此方法描述于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，以及Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
人抗体剂也可以通过体外活化B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
抗MUC16抗体剂变体
在一些实施方案中，考虑本文所提供的抗MUC16抗体剂(例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善所述抗体剂的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体剂的氨基酸序列变体可以通过在编码所述抗体剂的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如所述抗体剂的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需的特征(例如，抗原结合)。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗MUC16抗体剂。用于取代性诱变的目的位点包括HVR和FR。可以将氨基酸取代引入目的抗体剂中，并针对所需活性筛选产物，所述所需活性例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
保守取代示出于下表4中。
表4：保守取代
Figure BDA0003154402680000471
Figure BDA0003154402680000481
氨基酸可以根据常见的侧链特性分成不同类别：疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；酸性：Asp、Glu；碱性：His、Lys、Arg；影响链取向的残基：Gly、Pro；以及芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别。
示例性取代变体是亲和力成熟的抗体剂，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术便利地产生。简言之，突变一个或多个CDR残基并在噬菌体上展示变体抗体部分，并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。可以在HVR中进行改变(例如，取代)，以例如改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或特异性决定残基(SDR)中进行，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑,HumanPress,托托瓦,新泽西州,(2001))中已描述了通过构建和从二级文库中重新选择进行的亲和力成熟。
在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的诱变)，将多样性引入选择进行成熟的可变基因中。然后建立二级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体剂变体。用以引入多样性的另一种方法涉及HVR引导的方法，其中随机化几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定抗原结合中所涉及的HVR残基。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，取代、***或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上不降低抗体剂结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以位于HVR“热点”或SDR的外部。在上文所提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个HVR不发生改变或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体剂残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体剂与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，可以确定抗原-抗体剂复合物的晶体结构以鉴定抗体剂与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需特性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***物的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体剂。所述抗体剂分子的其他***变体包括将所述抗体剂的N末端或C末端与酶(例如，用于ADEPT)或增加所述抗体剂的血清半衰期的多肽融合。
Fc区变体
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体剂(例如全长抗MUC16抗体或抗MUC16 Fc融合物)的Fc区中，从而生成Fc区变体。在一些实施方案中，Fc区变体具有增强的ADCC效应子功能，通常与和Fc受体(FcR)的结合相关。在一些实施方案中，Fc区变体具有降低的ADCC效应子功能。有许多可改变效应子功能的Fc序列的变化或突变的例子。例如，WO 00/42072和Shields等人,J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述了具有改进或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些出版物的内容通过引用特别地并入本文。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是治疗性抗体针对肿瘤细胞的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，因此免疫***的效应细胞主动裂解靶细胞(例如癌细胞)，所述靶细胞的膜表面抗原已由特异性抗体(例如抗MUC16抗体)结合。典型ADCC涉及由抗体活化NK细胞。NK细胞表达Fc受体CD16。此受体识别并结合至与靶细胞的表面结合的抗体的Fc部分。NK细胞表面上最常见的Fc受体称为CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体的Fc区的结合导致NK细胞活化、细胞溶解颗粒释放和后续靶细胞凋亡。可以使用特定测试测量ADCC对肿瘤细胞杀伤的贡献，所述测试使用已用高亲和力FcR转染的NK-92细胞。将结果与不表达FcR的野生型NK-92细胞相比较。
在一些实施方案中，本发明考虑一种抗MUC16抗体剂变体(诸如全长抗MUC16抗体变体)，其包含具有一些但并非所有效应子功能的Fc区，这使所述抗体剂变体成为用于如下应用的所需候选物，在所述应用中抗MUC16抗体剂的体内半衰期是重要的而某些效应子功能(诸如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体剂缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和CytoTox96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)中公开的动物模型)评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实抗体剂不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297的至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改进或减弱的与FcR的结合的某些抗体剂变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，提供一种抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体，其包含含有改进ADCC的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区。在一些实施方案中，变体Fc区包含改进ADCC的一个或多个氨基酸取代，其中所述取代是在变体Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂(例如全长抗MUC16抗体)变体在其变体Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施方案中，在Fc区中做出导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改进或减弱)的改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施方案中，提供一种抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体，其包含含有增加半衰期和/或改进与新生Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区。具有增加的半衰期和改善的与FcRn的结合的抗体描述于US 2005/0014934 A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述一个或多个取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个残基处具有取代的那些Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
考虑了包含本文所述的任何Fc变体的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其组合。
糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文所提供的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段以增加或降低抗MUC16抗体剂被糖基化的程度。通过改变抗MUC16抗体剂或其多肽部分的氨基酸序列可以便利地完成糖基化位点在抗MUC16抗体剂中的添加或缺失，使得产生或去除一个或多个糖基化位点。
在抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段包含Fc区时，可以改变与其附接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链、二天线寡糖，其通常通过N键附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及附接至二天线寡糖结构的“茎”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗MUC16抗体剂中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的特性的抗MUC16抗体剂变体。
附接至Fc的CH2结构域的N-聚糖是异质的。在CHO细胞中生成的抗体或Fc融合蛋白通过岩藻糖基转移酶活性进行岩藻糖基化。参见Shoji-Hosaka等人,J.Biochem.140:777-83(2006)。通常，在人血清中可检测到小百分比的天然存在的去岩藻糖化IgG。Fc的N糖基化对于与FcγR的结合十分重要；并且N-聚糖的去岩藻糖基化增加了Fc结合FcγRIIIa的能力。增加的FcγRIIIa结合可以增强ADCC，其在需要细胞毒性的某些抗体剂治疗性应用中可以是有利的。
在一些实施方案中，当Fc介导的细胞毒性是不期望的时候，增强的效应子功能可能是有害的。在一些实施方案中，Fc片段或CH2结构域是未糖基化的。在一些实施方案中，使CH2结构域中的N-糖基化位点突变以预防糖基化。
在一些实施方案中，提供包含Fc区的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体，其中附接至Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，其可改进ADCC功能。确切地说，本文中考虑了相对于在野生型CHO细胞中产生的相同抗MUC16抗体剂上岩藻糖的量，具有降低的岩藻糖的抗MUC16抗体剂。即，其特征在于岩藻糖的量比原本由天然CHO细胞(例如产生天然糖基化样式的CHO细胞，诸如含有天然FUT8基因的CH O细胞)产生的其他情况下所具有的量要低。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是一种如下抗体剂，其中所述抗体剂上少于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的N-连接的聚糖包含岩藻糖。例如，这种抗MUC16抗体剂中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂是一种如下抗体剂，其中所述抗体剂上N连接的聚糖均不包含岩藻糖，即其中所述抗MUC16抗体剂完全没有岩藻糖或没有岩藻糖或是去岩藻糖基化的。如通过MALDI-TOF质谱测量的，例如如描述于WO 2008/077546中的，通过相对于附接至Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位与第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“缺乏岩藻糖的”抗体剂变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Pr esta,L；以及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biot echnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有分叉寡糖的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体，例如其中附接至抗MUC16抗体剂的Fc区的二天线寡糖被GlcNAc分叉。此类抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体剂变体的例子描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；US 2005/0123546(Umana等人)，以及Ferrara等人,Biotechnology and Bioengineering,93(5):851-861(2006)。还提供了在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体。此类抗MUC16抗体剂变体可具有改进的CDC功能。此类抗体剂变体描述在例如WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在一些实施方案中，包含Fc区的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体能够结合FcγRIII。在一些实施方案中，包含Fc区的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)变体与在其他方面相同的包含人野生型IgG1Fc区的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)相比，在人效应细胞(例如T细胞)的存在下具有ADCC活性或者在人效应细胞的存在下具有增加的ADCC活性。
半胱氨酸工程化变体
在一些实施方案中，可能希望形成半胱氨酸工程化抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段，其中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中，取代的残基出现于抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此将反应性硫醇基定位于抗MUC16抗体剂的可及位点处，并且可以用于将抗MUC16抗体剂缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生抗MUC16免疫缀合物，如本文中进一步所述。可生成半胱氨酸工程化抗MUC16抗体剂(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)，如例如美国专利号7,521,541中所述。
衍生物
在一些实施方案中，本文所提供的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段可以进一步被修饰为含有本领域已知并且容易获得的其他非蛋白质性部分。适于将抗MUC16抗体剂衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在制造中具有优势。所述聚合物可以具有任何分子量，并且可以有支链或无支链。附接至抗MUC16抗体剂的聚合物的数目可以变化，并且如果附接超过一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于以下的考虑因素来确定：要改善的抗MUC16抗体剂的特定特性或功能、抗MUC16抗体剂衍生物是否将要用于在确定条件下的疗法中等。
在一些实施方案中，提供了抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段与可通过暴露于辐射而被选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至一定温度的波长，在所述温度下能够杀死抗MUC16抗体剂-非蛋白质部分附近的细胞。
抗体缀合物
在某些实施方案中，本文提供了抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段缀合物，其中所述抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段缀合至一种或多种药剂，例如显像剂或细胞毒性剂。本文还提供双特异性抗体缀合物，其中所述双特异性抗体缀合至一种或多种药剂，例如显像剂或细胞毒性剂。本文还提供抗体重链缀合物，其中所述抗体重链缀合至一种或多种药剂，例如显像剂或细胞毒性剂。本文还提供抗体轻链缀合物，其中所述抗体轻链缀合至一种或多种药剂，例如显像剂或细胞毒性剂。本文还提供融合蛋白缀合物，其中所述融合蛋白缀合至药剂，例如显像剂或细胞毒性剂。在某些实施方案中，所述药剂共价或非共价缀合。
在某些实施方案中，显像剂是可检测标记，诸如发色剂、酶促剂、放射性同位素、同位素、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂或其他标记。
合适的发色标记的非限制性例子包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-甲酸。
合适的酶标记的非限制性例子包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素为本领域技术人员已熟知的并且包括β发射体、γ发射体、正电子发射体和x射线发射体。合适的放射性同位素标记的非限制性例子包括3H、18F、111In、125I、131I、32P、33P、35S、11C、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、223Ra、223Ra、89Zr、177Lu和109Pd。在某些实施方案中，111In是用于体内成像的优选同位素，因为它避免了125I或131I-标记的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段在肝脏内脱溴化的问题。此外，111In具有对于成像更有利的伽马发射能量(Perkins等人,Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等人,J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织(特别是肝脏)中显示出很少的吸收，并因此增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。
合适的非放射性同位素标记的非限制性例子包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的非限制性例子包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸盐标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。
化学发光标记的非限制性例子包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯(acridinium ester)标记、咪唑标记、吖啶盐(acridinium salt)标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记。
核磁共振造影剂的非限制性例子包括重金属核，如Gd、Mn和铁。
本领域普通技术人员已知的用于将上文所述的标记缀合至所述抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链和融合蛋白的技术描述于例如Kennedy等人,Clin.CMm.Acta 70:1-31(1976)和Schurs等人,Clin.CMm.Acta 81:1-40(1977)中。后一文献中提及的偶合技术是戊二醛方法、高碘酸盐方法、二马来酰亚胺方法、m-马来酰亚胺苄基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯方法，所有所述方法均通过引用并入本文中。
细胞毒性剂的非限制性例子包括细胞抑制剂或杀细胞剂、放射性金属离子(例如α发射体)和毒素(例如假单胞菌外毒素A、相思豆毒蛋白、霍乱毒素、蓖麻毒素A和白喉毒素。
在某些实施方案中，所述药剂是诊断剂。诊断剂是可用于通过定位含有所述抗原的细胞来诊断或检测疾病的药剂。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如采用生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁性离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且通过引用以其整体并入。优选地，诊断剂选自放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了使抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段负载放射性金属或顺磁性离子，可能需要使所述抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段与具有长尾部的试剂发生反应，所述长尾部附接有多种用于结合离子的螯合基团。这种尾部可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化或可衍生的链，所述聚合物具有可与螯合基团结合的侧基，所述螯合基团是例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。螯合物使用标准化学偶联至抗体。螯合物通常通过如下基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的情况下与分子形成键，其他更不常见的用于将螯合物缀合至抗体的方法和试剂披露于在1989年4月25日发布的Hawthorne的题为“Antibody Conjugates”的美国专利号4,824,659中，所述专利的披露内容通过引用以其整体并入本文中。特别有用的金属-螯合物组合包括与诊断性同位素一起用于放射成像的2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物。在与非放射性金属(如锰、铁和钆)复合时，在与本文所提供的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段一起使用时，相同螯合物可用于MRI。
大环螯合物如NOTA、DOTA和TETA分别与多种金属和放射性金属(最具体地与镓、钇和铜的放射性核素)一起使用。可以通过使环的大小适合目的金属来使此类金属-螯合物复合物非常稳定。本文涵盖对于稳定结合核素(如用于RAIT的223Ra)感兴趣的其他环型螯合物，如大环聚醚。
药物组合物
本文还提供了包含抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段的组合物(诸如药物组合物，在本文中也称为配制品)、编码所述抗体剂的核酸、包含编码所述抗体剂的核酸的载体、或包含所述核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗MUC16抗体剂和任选的药学上可接受的载剂。
抗MUC16抗体剂(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段的合适配制品是通过将具有所需纯度的抗MUC16抗体剂与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合以冻干配制品或水溶液形式来获得的(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980))。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性配制品描述于WO 98/56418中，所述专利通过引用明确并入本文。适于皮下施用的冻干配制品描述于WO97/04801中。可以使用合适稀释剂将此类冻干配制品重构至高蛋白质浓度，并且可将重构的配制品向本文中待治疗的个体皮下施用。Lipofectin或脂质体可以用于将本发明的抗MUC16抗体剂递送到细胞中。
本文中的配制品可以除了含有抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段以外还含有如正治疗的特定适应症所必需的一种或多种活性化合物，优选地是具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些化合物。例如，除了抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段以外，可能希望进一步提供一种抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗MUC16抗体剂的量、疾病或障碍或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些药剂通常以相同剂量并使用如本文所述的施用路径或约1％至99％迄今采用的剂量使用。
抗MUC16抗体剂(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包埋在粗乳液中。可以制备缓释制剂。
可以制备抗MUC16抗体剂(诸如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段的缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有所述抗体剂(或其片段)的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，某些水凝胶在更短时间段内释放蛋白质。当包封的抗体剂长时间保持在体内时，它们可由于暴露于37℃的湿度下而变性或聚集，从而导致生物活性丧失和可能的免疫原性改变。可以设计合理策略来根据所涉及的机制稳定抗MUC16抗体剂。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换进行的分子间S-S键形成，则可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度含量、使用适当添加剂并使特定聚合物基质组合物展开来实现稳定。
在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段配制于包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween 80)或前述任何组合的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含约10mM至约50mM琥珀酸盐的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于具有约5.1与5.6之间的pH的缓冲液中。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段配制于包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中所述配制品处于pH 5.5。
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这可以通过例如经无菌过滤膜进行过滤容易地实现。
使用抗MUC16抗体剂的治疗方法
在某些实施方案中，本文提供了用于治疗受试者的癌症(具体地是受试者的MUC16阳性癌症)的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段以治疗有效剂量诸如本文所述的剂量施用。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段根据如本文所述的方法来施用。在一些实施方案中，将抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段与一种或多种另外药物活性剂组合施用。
对于在特定物种的受试者使用抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段，使用结合该特定物种的MUC16的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段。例如，为了治疗人，使用结合人MUC16的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段是免疫球蛋白。
另外，对于在特定物种的受试者中使用抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段，抗MUC16抗体剂(优选地，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的恒定区)源自该特定物种。例如，为了治疗人，抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段可包含作为免疫球蛋白的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白包含人恒定区。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，MUC16阳性癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫癌(例如子宫内膜癌)、原发性腹膜癌或表达MUC16受体的任何其他组织的癌症。
在一些实施方案中，治疗可以用于实现有益的或所需的临床结果，包括但不限于症状减轻、疾病程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测的。在一个具体的实施方案中，“治疗”还可以用于与如果没有接受治疗的预期存活相比，延长存活。在一些实施方案中，向患有癌症(例如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫癌(例如子宫内膜癌)、原发性腹膜癌或表达MUC16受体的任何其他组织的癌症)的受试者施用本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段或本文所述的药物组合物实现了以下作用中的至少一种、两种、三种、四种或更多种：(i)减轻或缓解癌症一种或多种症状的严重性；(ii)减少与癌症相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)预防与癌症相关的症状的复发；(iv)减少受试者的住院治疗；(v)减少住院治疗时间长度；(vi)增加受试者的存活；(vii)增强或改善另一种疗法的治疗作用；(viii)抑制与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(ix)减少与癌症相关的症状的数目；(x)改善如通过本领域熟知的方法评估的生活质量；(x)抑制肿瘤的复发；(xi)使肿瘤和/或与肿瘤相关的一种或多种症状消退；(xii)抑制肿瘤和/或与肿瘤相关的一种或多种症状的进展；(xiii)减少肿瘤生长；(xiv)减小肿瘤尺寸(例如体积或直径)；(xv)减少新形成的肿瘤的形成；(xvi)预防、根除、去除或控制原发性、区域性和/或转移性肿瘤；(xvii)减小转移的数目或尺寸；(xviii)减少死亡率；(xix)增加无复发存活；(xx)保持肿瘤尺寸并且使其不增加或使其增加小于在施用标准疗法之后肿瘤的增加，如通过本领域技术人员可用的常规方法测量，所述方法诸如磁共振成像(MRI)、动态对比增强MRI(DCE-MRI)、X-射线和计算机断层摄影(CT)扫描或正电子发射断层摄影(PET)扫描；和/或(xxi)增加患者缓解时间长度。治疗可以实现前述一种或多种。
诊断用途
在某些实施方案中，本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段可用于诊断目的以检测、诊断或监测本文所述的病症(例如涉及MUC16阳性癌细胞的病症)。在某些实施方案中，标记用于诊断目的的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供了用于检测本文所述的病症的方法，其包括(a)使用一种或多种本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段测定受试者的细胞或组织样品中MUC16或其片段的表达；并且(b)比较MUC16或其片段表达水平与对照水平，例如正常组织样品(例如来自未患有本文所述的病症的受试者或来自在病症发作前的同一位患者)中的水平，由此与MUC16或其片段表达的对照水平相比MUC16或其片段表达的测定水平的增加或减少指示本文所述的病症。
本文所述的抗体可以用于使用如本文所述或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样品中MUC16或其片段的水平(参见例如Jalkanen等人,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；和Jalkanen等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，诸如鲁米诺；和荧光标记，诸如荧光素和罗丹明，以及生物素。在一些实施方案中，将测定标记缀合至本文所提供的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段以用于直接检测。在一些实施方案中，将测定标记缀合至结合本文所提供的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的二抗。根据一抗的类别(例如IgG或IgM)、来源宿主和优选的标记的种类来选择二抗类型。在一些实施方案中，二抗是一种类别或同种型的特异性抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgE或IgG)。在一些实施方案中，二抗是一种亚类的特异性抗体(例如IgG1、IgG2、IgG2、IgG4、IgA1或IgA2)。在一些实施方案中，二抗结合一种或多种类别或亚类的抗体。在一些实施方案中，二抗结合一抗的重链。在一些实施方案中，二抗结合一抗的轻链。在一些实施方案中，二抗结合一抗的κ轻链。在一些实施方案中，二抗结合一抗的λ轻链。在一些实施方案中，二抗是抗Fc或抗F(ab)或抗(Fab')2片段抗体。在一些实施方案中，二抗是兔、小鼠、山羊、驴或鸡抗体。
在某些实施方案中，通过在初始诊断后一段时间内重复用于诊断的方法来监测本文所述的病症(例如MUC16阳性癌症)。
使用本领域已知的用于体内扫描的方法检测受试者(即体内)中标记的分子的存在。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可用于本发明的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描诸如正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波扫描。
可以将如本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段、或本文所述的含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物、或表达所述抗体或其抗原结合片段的细胞通过多种路径递送至受试者。这些路径包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜和皮下路径。也可以例如通过使用吸入器或雾化器并用气雾剂配制以用作喷雾剂来采用肺部施用。在一个实施方案中，向受试者肠胃外施用本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段或组合物。在一些实施方案中，所述肠胃外施用是静脉内、肌内或皮下。
抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段或组合物将有效于治疗和/或预防病症的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
待用于组合物中的精确剂量还将取决于施用路径以及癌症的类型，并且应当根据从业者的判断和每名受试者的情况决定。例如，有效剂量也可以根据施用手段、靶位点、患者的生理学状况(包括年龄、体重和健康)、患者是人还是动物、所施用的其他药物、或治疗是预防性还是治疗性的来改变。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
在某些实施方案中，采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。可以从源自体外或动物模型测试***的剂量反应曲线外推有效剂量。
对于抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段，剂量可在约0.0001至100mg/kg患者体重且更通常在0.01至15mg/kg患者体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重、10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，或换言之，对于70kg患者，可以分别是70mg或700mg或在70-700mg范围内。通常，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期长于来自其他物种的抗体。因此，较低剂量的人抗体和较少施用频率通常是可能的。
在某些实施方案中，诸如在表达所述抗体或其抗原结合片段或CAR的工程化细胞的施用中，以约100万至约1000亿个细胞的范围(像例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围之间的任何值施用于受试者。在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或单独细胞亚群的剂量在或约104与在或约109个细胞/公斤(kg)体重之间的范围内，如在105与106个细胞/kg体重之间，例如，在或约1x105个细胞/kg、1.5x105个细胞/kg、2x105个细胞/kg、或1x106个细胞/kg、2x106个细胞/kg、5x106个细胞/kg、或10x106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，将细胞以在或约104与在或约109个T细胞/公斤(kg)体重之间、诸如105与107个T细胞/kg体重之间或在其一定误差范围内施用。
可以在多种情况下施用抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段。单次剂量之间的间隔可以是1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年或2年。
组合疗法
在一些实施方案中，本文所提供的用于治疗受试者的癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫癌(例如子宫内膜癌)或原发性腹膜癌)的方法包括向有需要的受试者施用包含本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的药物组合物，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂用于治疗受试者的癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫癌(例如子宫内膜癌)或原发性腹膜癌)。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂用于治疗使用本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段进行的治疗的任何副作用。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗卵巢癌的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗胰腺癌的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗肺癌的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗乳腺癌的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗输卵管癌的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗子宫癌(例如子宫内膜癌)的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是用于治疗原发性腹膜癌的药剂。
本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段可以与另外的治疗剂同时或依序(之前和/或之后)施用。可以将抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂以相同或不同的组合物并通过相同或不同的施用路径施用。可以将第一疗法(其为本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段或另外的治疗剂)在向患有癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫癌(例如子宫内膜癌)或原发性腹膜癌)的受试者施用第二疗法(本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段或另外的治疗剂)之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。在某些实施方案中，将另外的治疗剂与本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段组合向受试者施用是以同一组合物(药物组合物)施用。在其他实施方案中，与本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段组合施用的另外的治疗剂是以不同于本文所述的抗MUC16抗体剂或其抗原结合片段的组合物向受试者施用的(例如使用两种或更多种药物组合物)。
示例性患者群体
根据本文提供的方法治疗的受试者可以是任何哺乳动物，诸如啮齿动物、猫、犬、马、牛、猪、猴、灵长类动物或人等。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是犬。如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。
在某些实施方案中，根据本文所提供的方法治疗的受试者已被诊断为患有MUC16阳性癌症，包括但不限于卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、或原发性腹膜癌、或表达MUC16的任何其他组织的癌症。
制品和试剂盒
在本发明的一些实施方案中，提供了含有可用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)或可用于将抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)递送至在细胞表面上表达MUC16的细胞的材料的制品。所述制品可以包含容器以及在所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。通常，所述容器容纳有对治疗本文所述的疾病或障碍有效的组合物，并且可以具有无菌的进入孔(例如所述容器可以是具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗MUC16抗体剂。标签或包装说明书指示所述组合物用于治疗特定病症。标签或包装说明书将进一步包括用于将抗MUC16抗体剂组合物施用于患者的说明书。还考虑了包含本文所述的组合疗法的制品和试剂盒。
包装说明书是指在治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在一些实施方案中，包装说明书指示所述组合物用于治疗癌症(诸如HCC、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、神经母细胞瘤、肝母细胞癌、肾母细胞瘤、睾丸非***性生殖细胞瘤、胃癌或脂肪肉瘤)。
另外，所述制品可以进一步包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者的角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供了可用于各种目的的试剂盒，任选地与制品组合，所述目的例如用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)或用于将抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)递送至在细胞表面上表达MUC16的细胞。本发明的试剂盒包括含有抗MUC16抗体剂组合物(或单位剂型和/或制品)的一个或多个容器，并且在一些实施方案中，进一步包括根据本文所述的任何方法使用的另一种药剂(诸如本文所述的药剂)和/或说明书。试剂盒可进一步包括对适用于治疗的个体的选择的描述。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装说明书(例如，试剂盒中包括的纸页)上的书面说明书，但机器可读的说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
例如，在一些实施方案中，试剂盒包括含有抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)的组合物。在一些实施方案中，试剂盒包括a)包含抗MUC16抗体剂的组合物，和b)有效量的至少一种其他药剂，其中所述其他药剂增强抗MUC16抗体剂的作用(例如治疗作用，检测作用)。在一些实施方案中，试剂盒包括a)含有抗MUC16抗体剂的组合物，和b)用于向个体施用抗MUC16抗体剂组合物以用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括a)含有抗MUC16抗体剂的组合物；b)有效量的至少一种其他药剂，其中所述其他药剂增强抗MUC16抗体剂的作用(例如治疗作用，检测作用)；和c)用于向个体施用抗MUC16抗体剂组合物和所述一种或多种其他药剂以用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)的说明书。抗MUC16抗体剂和所述一种或多种其他药剂可以存在于分开的容器中或单一容器中。例如，试剂盒可包括一种不同的组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包含抗MUC16抗体剂而另一种组合物包含另一种药剂。
在一些实施方案中，试剂盒包括编码抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，试剂盒包括a)编码抗MUC16抗体剂的核酸(或一组核酸)和b)用于表达所述核酸(或一组核酸)的宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括a)编码抗MUC16抗体剂的核酸(或一组核酸)和b)用于以下的说明书：i)在宿主细胞中表达抗MUC16抗体剂，ii)制备包含抗MUC16抗体剂的组合物，和iii)向个体施用包含抗MUC16抗体剂的组合物以用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)。在一些实施方案中，试剂盒包括a)编码抗MUC16抗体剂的核酸(或一组核酸)；b)用于表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞；和c)用于以下的说明书：i)在宿主细胞中表达抗MUC16抗体剂，ii)制备包含抗MUC16抗体剂的组合物，和iii)向个体施用包含抗MUC16抗体剂的组合物以用于治疗特征在于高MUC16表达和/或高有氧糖酵解的癌症(例如肾癌、***或***癌)。
本发明的试剂盒是处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供另外的组分，诸如缓冲液和解释信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
与抗MUC16抗体剂组合物的使用相关的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药时间表和施用路径的信息。容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可以提供含有足够剂量的如本文所公开的抗MUC16抗体剂(诸如全长抗MUC16抗体)的试剂盒，以提供个体的有效治疗持续延长的时间段，诸如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间中的任一者。试剂盒还可以包括多个单位剂量的抗MUC16抗体剂和药物组合物和使用说明书，并且其包装量足以在药房(例如，医院药房和复合药房)中存储和使用。
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有若干种实施方案。现在将通过引用以下非限制性实施例更加详细地描述本发明。以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应该解释为以任何方式限制其范围。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术，不应将所述实施例视为以任何方式加以限制。以下实施例展现了本技术的说明性抗MUC16抗体的制备、表征和用途。以下实施例展现了本技术的人抗体和双特异性抗体的产生以及对它们的结合特异性和体内生物活性的表征。
实施例1：对人MUC16具有特异性的scFv的选择和表征
此实施例展现了从人scFv抗体噬菌体展示文库的集合中对于对人MUC16(hMUC16)具有特异性的人scFv的选择和表征。具体地说，此实施例展现了对特异性结合呈天然形式(即细胞表面结合的MUC16)的hMUC16(MUC16-C114)的胞外域的人scFv的选择。此实施例还展现了对靶向MUC16胞外域上的决定性N糖基化位点(c114中的N30或全长成熟MUC16蛋白中的N1806)以抑制MUC16对转移和侵袭的糖基化依赖性作用的人scFv的进一步选择。天然MUC16和截短的MUC16-C114的结构图示连同其氨基酸序列示出在图1中。通过针对细胞表面结合的MUC16-C114进行淘选来基于对人MUC16的高选择性来选择scFv。这些人抗MUC16scFv提供了用于构建各种形式的抗MUC16抗体剂的抗体组分的有价值来源，所述形式例如全长IgG、双特异性抗MUC16抗体、多特异性抗MUC16抗体等。
产生两种表达MUC16蛋白的HEK293稳定细胞系以用于MUC16的膜结合表达，以用于选择并表征特异性靶向MUC16胞外域上的N30 N糖基化的scFv。产生一种细胞系以表达野生型MUC16-C114-GFP融合蛋白(HEK293-MUC16WT)，并且产生一种细胞系以表达N30突变体MUC16-C114-GFP融合蛋白(HEK293-MUC16mut)。野生型MUC16-C114与N30突变体MUC16-C114胞外域之间的比对示出在图2中。如图2所示，N30突变体MUC16-C114具有N30A取代。通过经由荧光活化细胞分选(FACS)测量GFP表达来确认HEK293-MUC16WT和HEK293-MUC16mut细胞的MUC16表达。亲本HEK293细胞系未显示GFP信号。相比之下，HEK293-MUC16WT和HEK293-MUC16mut细胞系展现出GFP表达，但HEK293-MUC16WT的GFP信号强于HEK293-MUC16mut细胞系(图3)。HEK293-MUC16WT细胞显示170x平均荧光强度(MFI)增加的GFP信号，而MUC16mut细胞显示26x MFI增加。
将通过Eureka Therapeutics(以
Figure BDA0003154402680000691
噬菌体文库作为商标)构建的人scFv抗体噬菌体展示文库(超过10×1010的分异度)的集合用于选择对hMUC16具有特异性的人scFv。
将
Figure BDA0003154402680000692
scFv噬菌体文库通过将其与阴性对照亲本HEK293细胞和表达MUC16-C114-GFP融合蛋白的HEK293细胞(HEK293-MUC16WT)共同孵育来针对hMUC16筛选(淘选)。在用PBS延长洗涤后，将具有结合的scFv抗体噬菌体的HEK293-MUC16WT细胞离心。然后将结合的克隆洗脱并用于进行2-3轮另外的淘选以富集特异性结合MUC16的scFv噬菌体克隆。然后洗脱结合的克隆并将其用于感染大肠杆菌XL1-Blue细胞。然后纯化在细胞中表达的噬菌体克隆。
然后通过对与HEK293-MUC16WT细胞的结合进行FACS分析来测试由细胞淘选鉴定的540个噬菌体克隆。简言之，将20万个细胞(在PBS+5％FBS+0.05％NaN3中)在4℃下与50μl在PBS中的约1.0x1011pfu/mL噬菌体一起孵育2h。使用一抗小鼠抗M13 mAb(Thermo#MA1-12900)和二抗PE抗小鼠IgG(Vectors Lab#EI-2007)进行FACS。鉴定53个独特克隆并且40个克隆证实对HEK293-MUC16 WT细胞的特异性结合。
测试40个MUC16特异性克隆与HEK293-MUC16WT、HEK293-MUC16mut和亲本HEK293细胞的结合。图4示出对于所有三个细胞系使用阴性噬菌体对照和无噬菌体对照进行的FACS分析的结果。使用40个克隆中的每个克隆进行FACS分析显示所有40个克隆均显示针对HEK293-MUC16WT的结合，而40个克隆中的16个克隆显示针对HEK293-MUC16mut的最小结合。因此，这些克隆对于N糖基化位点(N30)具有特异性。图5示出两个示例性克隆即克隆8和克隆12的结果。
然后测试16个克隆中前9个克隆与MUC16+癌细胞系OVCAR3、SKOV8和OVCA432的结合。抗MUC16克隆8和12最具特异性地结合MUC16+癌细胞系，但不结合MUC16-癌细胞系SKOV3(图8)。若干其他克隆也特异性结合MUC16+癌细胞系，但是以较低特异性(图7)。
实施例2：抗MUC16双特异性抗体的产生
所述实施例描述了由在实施例1中鉴定的抗MUC16 scFv生成抗MUC16双特异性抗体(BsAb)。在此实施例中，产生单链BsAb，其包含在N末端的抗MUC16 scFv和在C末端的小鼠单克隆抗体的抗人CD3εscFv。通过使用标准DNA技术将编码抗MUC16 scFv和源自亲本克隆L2K的抗人CD3εscFv抗体的DNA片段克隆到表达载体中来产生抗MUC16克隆8BsAb和抗MUC16克隆12BsAb。在抗MUC16 BsAb下游C末端***六组氨酸(His)标签，以用于抗体纯化和检测。
将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用抗MUC16 BsAb表达载体转染，并且通过用甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(基于谷氨酰胺合成酶(GS)的方法)进行标准药物选择来实现稳定表达(Fan等人,Biotechnology Bioengineering.109(4),1007-1005(2012))。收集含有分泌的抗MUC16 BsAb分子的CHO细胞上清液。通过FPLC AKTA***使用HisTrap HP柱(GEhealthcare)纯化抗MUC16 BsAb。简言之，将CHO细胞培养物澄清并且以低咪唑浓度(20mM)上样到柱上，并且然后使用等度高咪唑浓度洗脱缓冲液(500mM)洗脱结合的抗MUC16双特异性抗体蛋白。通过SDS-PAGE观察到约50kDa的克隆8BsAb和克隆12BsAb的主要条带，这指示成功纯化BsAb。
实施例3：抗MUC16 BsAb-MUC16+细胞特异性
在此实施例中，评估抗MUC16 BsAb与表达MUC16的癌细胞结合的特异性。在一种研究中，采用两种靶细胞系MUC16+OVCAR3细胞系和MUC16-SKOV3细胞系。通过美国典型培养物保藏中心(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州)获得OVCAR3和SKOV3细胞系并且根据ATCC文献保持培养。对于抗MUC16抗体与两种靶细胞系的结合进行FACS分析以确认仅在MUC16+OVCAR3细胞系的情况下观察到抗体结合。将SKOV3或OVCAR3细胞系与抗MUC16 Ab、然后与二抗一起孵育，或仅与二抗一起孵育作为对照。抗MUC16克隆8BsAb的数据示出在图6中。MUC16+OVCAR3细胞系显示相对于对照细胞结合增加了约300x MFI，而SKOV3仅展现出最少信号。
实施例4：抗MUC16 BsAb-引导的细胞毒性
在此实施例中，评估抗MUC16 BsAb诱导MUC16特异性细胞毒性的能力。将抗MUC16克隆8BsAb和抗MUC16克隆12BsAb以0.2μg/ml的浓度与MUC16+OVCAR3靶细胞系或MUC16-SKOV3靶细胞系和人活化T细胞以5:1的效应物:靶标(E:T)比率一起孵育16小时。通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定测量细胞毒性。如图7所示，克隆8和克隆12BsAb能够诱导OVCAR3细胞分别以约90％和65％的水平进行细胞裂解，而SKOV3的细胞裂解最少，这指示MUC16+靶标特异性是T细胞活化所需要的。因此，克隆8BsAb和克隆12BsAb诱导MUC16+癌细胞系的强效特异性杀灭。
在单独的研究中，采用四种靶细胞系MUC16+OVCAR3细胞系、MUC16-SKOV3细胞系、MUC16+SKOV8细胞系和MUC16+OVCA432细胞系。将抗MUC16克隆8BsAb和抗MUC16克隆12BsAb以0.2μg/ml的浓度与靶细胞系和人活化T细胞以3:1的效应物:靶标(E:T)比率一起孵育16小时。通过LDH释放测定测量细胞毒性。在3:1的较低E:T比率下(图8)与5:1的E:T比率相比，观察到MUC16+细胞系的更低细胞裂解百分比。在此研究中MUC16-SKOV3的细胞裂解也最少，这进一步支持BsAb的MUC16+靶标特异性是T细胞活化所必需的。
实施例5：NSG小鼠中人MUC16+转移性卵巢癌的疗法
在此实施例中，评估转移性卵巢癌的小鼠异种移植模型中抗MUC16 BsAb的体内治疗功效。在第0天(D0)向6-8周龄的雌性NSG小鼠腹膜内(i.p.)注射3x106个被修饰为表达MUC16-C114和GFP-LUC的SKOV3-MUC-CD肿瘤细胞。然后在第7天(D7)用1x107个人T细胞静脉内(i.v.)处理这些小鼠并且用5μg抗MUC16克隆8BsAb腹膜内处理。在D9、D11、D14、D16和D18，腹膜内施用以5μg BsAb进行的额外处理，总计六次BsAb处理。在D14、D21、D28和D42对动物进行成像。SKOV3-MUC-CD和BsAb注射的实验方案示出在图9A中。
用抗MUC16克隆8BsAb处理的动物与未处理小鼠或用单独的T细胞处理的小鼠相比表现出延迟的疾病进展(图9B)。图9C示出荷瘤小鼠的存活曲线。与T细胞疗法或无处理相比，在荷瘤小鼠中用抗MUC16克隆8BsAb的处理显著延长存活。用T细胞和抗MUC16 BsAb处理的荷瘤小鼠在治疗后7天也显示出显著升高的全身性IL-2和IFN-γ水平，这指示诱导抗肿瘤免疫应答(图9D)。这些结果证明在MUC16+转移性卵巢癌的异种移植模型中施用抗MUC16BsAb延迟了疾病进展并且改善存活。
实施例6：产生全长人IgG抗MUC16抗体
例如在HEK293和CHO细胞系中产生所选择的噬菌体克隆的全长人IgG1，如(Tomimatsu,K.等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.73(7):1465-1469,2009)所述。简言之，将来自噬菌体克隆的抗体可变区亚克隆到哺乳动物表达载体中，其中匹配人λ轻链恒定区(SEQ ID NO:31)和人IgG1恒定区(SEQ ID NO:28)序列(参见表5)。可以在还原条件和非还原条件两者下通过电泳测量纯化的全长IgG1抗体的分子量。可以对纯化的IgG1抗体进行SDS-PAGE以确定蛋白质纯度。
表5
噬菌体克隆 HC可变 HC恒定 LC可变 LC恒定
8 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:31
12 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:31
实施例7：表征全长人IgG抗MUC16抗体
通过流式细胞术测试抗MUC16 IgG抗体与表达MUC16的细胞诸如HEK293-MUC16wt细胞或MUC16+细胞系诸如OVCAR3、SKOV8细胞系或OVCA432细胞系的结合。测试结合的剂量依赖性。简言之，将表达MUC16的细胞与不同量的例如10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.041、0.014或0μg/ml的抗人MUC16 IgG抗体一起在冰上孵育1小时。通过剂量依赖性曲线(MFI与抗体浓度)的EC50来评价抗MUC16 IgG抗体针对表达MUC16的细胞的亲和力。另外，基于EC50值确定表观KD。可以例如通过ForteBio确定抗MUC16 IgG抗体的结合亲和力。
实施例8：表征全长人IgG抗MUC16抗体
评价抗MUC16克隆8和抗MUC16克隆12抑制Matrigel侵袭的能力。使用抗MUC16单克隆抗体4H11作为阴性对照。通过在4H11、克隆8或克隆12存在或不存在的情况下孵育细胞，用表达phrGFP或phr-GFP-MUC16-C114的SKOV3卵巢癌稳定细胞系进行Matrigel侵袭测定。克隆8和克隆12抑制M UC16-C114诱导的Matrigel侵袭。相比之下，单克隆抗MUC16抗体4H11不会抑制MUC16-C114诱导的Matrigel侵袭。这些数据证明与单克隆抗体4H11相比之下，克隆8和克隆12阻断Matrigel侵袭。
表6：序列表
Figure BDA0003154402680000731
Figure BDA0003154402680000741
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Figure BDA0003154402680000881
可以根据以下非限制性实施方案描述本公开文本。
实施方案1：一种抗粘蛋白16(MUC16)构建体，其包含免疫特异性识别粘蛋白16(MUC16)多肽的抗体部分，其中所述抗体部分包含(a)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:2的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和(ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:3的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3；或者(b)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:11的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案2：根据实施方案1所述的抗粘蛋白16(MUC16)构建体，其中所述抗体部分包含：(a)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的重链互补决定区((HC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；以及(ii)可变轻(VL)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的轻链互补决定区(LC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3；或者(b)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；以及(ii)可变轻(VL)链，其包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1；含有氨基酸序列SEQ IDNO:16的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的LC-CDR3。
实施方案3：根据实施方案1或实施方案2所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分免疫特异性结合至MUC16的胞外域。
实施方案4：根据实施方案1-3中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是全长抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、或单链Fv(scFv)。
实施方案5：根据实施方案1-4中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述MUC16是人MUC16。
实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述VH链和所述VL链是人VH链和VL链。
实施方案7：根据实施方案1-6中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分免疫特异性结合至包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的MUC16 c114多肽。
实施方案8：根据实施方案1-6中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体在Matrigel侵袭测定中抑制表达MUC16的肿瘤细胞的体外侵袭。
实施方案9：根据实施方案8所述的抗MUC16构建体，其中所述肿瘤细胞是卵巢肿瘤细胞。
实施方案10：根据实施方案8或实施方案9所述的抗MUC16构建体，其中所述MUC16被糖基化。
实施方案11：根据实施方案10所述的抗MUC16构建体，其中所述MUC16在相对于SEQID NO:25的N24或N30处是N糖基化的。
实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是单克隆抗体。
实施方案13：根据实施方案1-12中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VH。
实施方案14：根据实施方案1-13中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL。
实施方案15：根据实施方案1-12中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH。
实施方案16：根据实施方案1-12或15中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL。
实施方案17：根据实施方案1-12中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL。
实施方案18：根据实施方案1-12中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL。
实施方案19：根据实施方案1-18中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含人来源的重链和轻链恒定区。
实施方案20：根据实施方案19所述的抗MUC16构建体，其中所述重链恒定区具有选自以下的同种型：γl、γ2、γ3和γ4。
实施方案21：根据实施方案19或20所述的抗MUC16构建体，其中所述轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。
实施方案22：根据实施方案1-21中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫球蛋白。
实施方案23：根据实施方案22所述的抗MUC16构建体，其中所述免疫球蛋白是IgG。
实施方案24：根据实施方案1-22中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是单特异性的。
实施方案25：根据实施方案1-22中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是多特异性的。
实施方案26：根据实施方案1-22中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是双特异性的。
实施方案27：根据实施方案1-22中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体、F(ab’)2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异多聚体抗体或异缀合物抗体。
实施方案28：根据实施方案27所述的抗MUC16构建体，其中所述构建体是包含通过肽接头连接的两个scFv的串联scFv。
实施方案29：根据实施方案25-28中任一项所述的抗MUC16构建体，其中免疫特异性识别MUC16的所述抗体部分是第一抗体部分，并且其中所述抗MUC16构建体进一步包含免疫特异性识别第二抗原的第二抗体部分。
实施方案30：根据实施方案29所述的抗MUC16构建体，其中所述第二抗原是T细胞表面上的抗原。
实施方案31：根据实施方案30所述的抗MUC16构建体，其中所述第二抗原是CD3。
实施方案32：根据实施方案31所述的抗MUC16构建体，其中所述第二抗原选自CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。
实施方案33：根据实施方案32所述的抗MUC16构建体，其中所述第二抗原是CD3ε。
实施方案34：根据实施方案1-19或24-26中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案35：根据实施方案34所述的抗MUC16构建体，其中所述CAR包含共刺激结构域。
实施方案36：根据实施方案34或35所述的抗MUC16构建体，其中所述CAR包含CD3zeta(ζ)链细胞质信号传导结构域。
实施方案37：根据实施方案1-36中任一项所述的抗MUC16构建体，其进一步缀合至肽剂、检测剂、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
实施方案38：一种多肽，其包含SEQ ID NO:2-17中的一个或多个的氨基酸序列或根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体的氨基酸。
实施方案39：一种多核苷酸，其包含编码根据实施方案38所述的一种或多种多肽的核酸序列。
实施方案40：一种载体，其包含可操作地连接至启动子的根据实施方案39所述的多核苷酸。
实施方案41：一种细胞，其包含根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体、根据实施方案38所述的多肽、根据实施方案39所述的多核苷酸或根据实施方案40所述的载体。
实施方案42：根据实施方案41所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施方案43：根据实施方案42所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
实施方案44：根据实施方案43所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
实施方案45：根据实施方案44所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或B细胞。
实施方案46：一种药物组合物，其包含：治疗有效量的根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体、根据实施方案39所述的多核苷酸、根据实施方案40所述的载体或根据实施方案41-45中任一项所述的细胞；和药学上可接受的载剂。
实施方案47：一种治疗有需要的患者的MUC16相关疾病或障碍的方法，其包括向所述患者施用根据实施方案46所述的药物组合物。
实施方案48：根据实施方案47所述的方法，其中所述MUC16相关疾病或障碍是癌症。
实施方案49：根据实施方案47所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌或原发性腹膜癌。
实施方案50：根据实施方案47或48所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
实施方案51：根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中所述药物组合物抑制所述患者体内的转移。
实施方案52：根据实施方案47-50中任一项所述的方法，其中所述患者是人患者。
实施方案53：一种产生效应细胞的方法，其包括用编码根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体的一种或多种核酸对细胞进行遗传修饰。
实施方案54：一种治疗方法，其包括将编码根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体的一种或多种核酸引入到从患者分离的一种或多种原代细胞中，并且向所述患者施用包含所述一种或多种核酸的细胞。
实施方案55：根据实施方案52所述的方法，其进一步包括在向所述患者施用所述细胞之前扩增所述细胞。
实施方案56：根据实施方案52或53所述的方法，其中所述原代细胞是淋巴细胞。
实施方案57：根据实施方案54所述的方法，其中所述原代细胞是T细胞。
实施方案58：根据实施方案47-55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用治疗有效量的另外的治疗剂。
实施方案59：根据实施方案53-58中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16构建体是根据实施方案34-36中任一项所述的抗MUC16构建体。
实施方案60：一种检测样品中的MUC16的方法，其包括：(a)使所述样品与根据实施方案1-24和37中任一项所述的抗MUC16构建体接触；并且(b)直接或间接检测在所述抗MUC16构建体与所述样品中的任何MUC16之间的结合。
实施方案61：根据实施方案60所述的方法，其中所述抗MUC16构建体缀合至可检测标记。
实施方案62：根据实施方案61所述的方法，其中所述可检测标记是发色剂、酶促剂、放射性同位素、同位素、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂。
实施方案63：根据实施方案61或62所述的方法，其中在所述抗MUC16构建体与所述样品中的任何MUC16之间的结合是通过检测所述可检测标记来直接检测的。
实施方案64：根据实施方案60所述的方法，其中在所述抗MUC16构建体与所述样品中的任何MUC16之间的结合是使用二抗间接检测的。
实施方案65：一种诊断疑似患有MUC16相关疾病或障碍的个体的方法，其包括：a)向所述个体施用有效量的根据实施方案1-24和37中任一项所述的抗MUC16构建体；并且b)直接或间接确定在所述抗MUC16构建体与所述个体中的任何MUC16之间的结合水平，其中结合水平高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍。
实施方案66：一种诊断疑似患有MUC16相关疾病或障碍的个体的方法，其包括：a)使包含源自所述个体的细胞的样品与根据实施方案1-24和37中任一项所述的抗MUC16构建体接触；并且b)确定所述样品中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目，其中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目的值高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍。
实施方案67：根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体、根据实施方案39所述的多核苷酸、根据实施方案40所述的载体或根据实施方案41-45中任一项所述的细胞用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途。
实施方案68：根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体、根据实施方案39所述的多核苷酸、根据实施方案40所述的载体或根据实施方案41-45中任一项所述的细胞在制造用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的药剂中的用途。
实施方案69：根据实施方案1-37中任一项所述的抗MUC16构建体、根据实施方案39所述的多核苷酸、根据实施方案40所述的载体或根据实施方案41-45中任一项所述的细胞用于诊断与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途。
实施方案70：根据实施方案62-64中任一项所述的用途，其中所述与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍是癌症。
本公开文本不受限于本申请中描述的具体实施方案，所述具体实施方案旨在作为对本公开文本的单独方面的单一说明。本文将不描述本公开文本的所有各种实施方案。如本领域技术人员将清楚的是，可以在不背离本公开文本的精神和范围的情况下，对本公开文本进行多种修改和改变。除在本文列举的那些方法和设备之外，通过前述描述，在本公开文本的范围内的功能上等效的方法和设备对于本领域技术人员将是清楚的。此类修改和改变旨在落入所附权利要求的范围内。本公开文本仅受所附权利要求以及这些权利要求有权要求的等效物的全部范围限制。
应当理解，本公开文本不限于具体用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物***，当然它们可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
另外，当本公开文本的特征或方面按马库什组(Markush group)来描述时，本领域技术人员将认为，本公开文本也从而按马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员可理解，范围包括每一个别成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

Claims (30)

1.一种抗粘蛋白16(MUC16)构建体，其包含免疫特异性识别粘蛋白16(MUC16)多肽的抗体部分，其中所述抗体部分包含：
(a)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:2的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和
(ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:3的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3；
或者
(b)(i)可变重(VH)链，其包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3；和
(ii)可变轻(VL)链，其包含SEQ ID NO:11的轻链可变结构域的轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含：
(a)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的重链互补决定区(HC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的HC-CDR3；和
(ii)可变轻(VL)链，其包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的轻链互补决定区(LC-CDR)1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的LC-CDR3；
或者
(b)(i)可变重(VH)链，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HC-CDR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HC-CDR3；和
(ii)可变轻(VL)链，其包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的LC-CDR1；含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的LC-CDR2；和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的LC-CDR3。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分免疫特异性结合MUC16的胞外域。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是全长抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、或单链Fv(scFv)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述VH链是人VH链，和/或所述VL链是人VL链。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是单克隆抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含：(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VH和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL；或者(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分包含人来源的重链和轻链恒定区。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗体部分是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫球蛋白。
10.根据权利要求9所述的抗MUC16构建体，其中所述免疫球蛋白是IgG。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体、F(ab’)2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼结构(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异多聚体抗体或异缀合物抗体。
13.根据权利要求11或12所述的抗MUC16构建体，其中免疫特异性识别MUC16的所述抗体部分是第一抗体部分，并且其中所述抗MUC16构建体进一步包含免疫特异性识别第二抗原的第二抗体部分。
14.根据权利要求13所述的抗MUC16构建体，其中所述第二抗原是CD3抗原。
15.根据权利要求1-8或11中任一项所述的抗MUC16构建体，其中所述抗MUC16构建体是嵌合抗原受体(CAR)。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗MUC16构建体，其进一步缀合至肽剂、检测剂、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
17.一种多肽，其包含SEQ ID NO:2-17中一个或多个的氨基酸序列或根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体的氨基酸。
18.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求17所述的一种或多种多肽的核酸序列。
19.一种载体，其包含可操作地连接至启动子的根据权利要求18所述的多核苷酸。
20.一种细胞，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体、根据权利要求17所述的多肽、根据权利要求18所述的多核苷酸或根据权利要求19所述的载体。
21.一种药物组合物，其包含：治疗有效量的根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体、根据权利要求17所述的多肽、根据权利要求18所述的多核苷酸或根据权利要求19所述的载体；和药学上可接受的载剂。
22.一种治疗有需要的患者的MUC16相关疾病或障碍的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求21所述的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述MUC16相关疾病或障碍是癌症。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌或原发性腹膜癌。
25.一种产生效应细胞的方法，其包括用编码根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体的一种或多种核酸对细胞进行遗传修饰。
26.一种治疗方法，其包括将编码根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体的一种或多种核酸引入从患者分离的一种或多种原代细胞中，并且向所述患者施用包含所述一种或多种核酸的细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述原代细胞是T细胞。
28.一种检测样品中的MUC16的方法，其包括：(a)使所述样品与根据权利要求1-11和16中任一项所述的抗MUC16构建体接触；并且(b)直接或间接检测在所述抗MUC16构建体与所述样品中的任何MUC16之间的结合。
29.一种诊断疑似患有MUC16相关疾病或障碍的个体的方法，其包括：
a)向所述个体施用有效量的根据权利要求1-11或16中任一项所述的抗MUC16构建体；并且直接或间接确定在所述抗MUC16构建体与所述个体中的任何MUC16之间的结合水平，其中结合水平高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍；或者
b)使包含源自所述个体的细胞的样品与根据权利要求1-11或16中任一项所述的抗MUC16构建体接触；并且确定所述样品中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目，其中与所述抗MUC16构建体结合的细胞数目的值高于阈值水平指示所述个体患有所述MUC16相关疾病或障碍。
30.根据权利要求1-16中任一项所述的抗MUC16构建体、根据权利要求17所述的多肽、根据权利要求18所述的多核苷酸、或根据权利要求19所述的载体或根据权利要求20所述的细胞用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途，在制造用于治疗与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的药剂中的用途，或用于诊断与阳性MUC16表达相关的疾病或障碍的用途。
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