CN113331052B

CN113331052B - 一种利用微冻生物科技培育蓝莓优品的工艺

Info

Publication number: CN113331052B
Application number: CN202110337808.9A
Authority: CN
Inventors: 庞俊兰; 李红伟; 许化礼; 李鹏; 李刚; 夏立枫; 刘志浩; 王慧灵; 孙广利; 叶兴国
Original assignee: Suzhou Lanrun Agricultural Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Lanrun Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113331052A

Abstract

本发明涉及一种利用微冻生物科技培育蓝莓优品的工艺。为解决现有蓝莓组织培养中试管苗生根困难、成活率低等问题，本申请创造性的将微冻技术结合蓝莓的组培，在蓝莓组培前对蓝莓外植体进行微冻处理，采用本申请提供的体系和工艺进行蓝莓组培，具有生根速度快、发根数目多、生根率高的特点，解决了蓝莓生产过程中发根难、所需时间长等制约蓝莓产业化发展的问题。

Description

一种利用微冻生物科技培育蓝莓优品的工艺

技术领域

本发明涉及蓝莓培育领域，具体涉及一种利用微冻生物科技培育蓝莓优品的工艺。

背景技术

蓝莓(Blueberry)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)多年生落叶或常绿灌木或小灌木,果实为蓝色浆果，富含花青素、黄酮等多种生理活性成分，具有较高的药用价值和保健作用。嫁接和组培是蓝莓的两种主要繁殖方法，相对于嫁接，组培法具有可以得到无病毒苗木、繁殖速度快、不受季节限制、在短期内可获得大量繁殖体、在阶段发育上比常规发育成苗更加年轻等优点，因而组培技术在蓝莓种苗繁育中应用地越来越广。但是蓝莓组织培养时容易出现试管苗生根困难、生根率低等问题。

微冻技术是应用超低温技术，在微冻液的介导下，将果蔬、肉类等产品直接冻结但产品的细胞膜未被冻裂，处于生物体微冻状态，从而保持了被冻产品的鲜活品质。发明人将微冻技术创造性的应用到农作物育种中，通过微冻生物科技解决农作物育种中存在的问题，在专利CN202110073639.2一种农作物种子微冻方法及其应用中，发明人发现微冻处理后的水稻种子出芽和生长较好。

为解决现有蓝莓组织培养中试管苗生根困难、生根率低、成活率低等问题，本申请创造性的将微冻技术结合蓝莓的组培，在蓝莓组培前对蓝莓外植体进行微冻处理，不仅增强外植体后续组培时的生根能力和增殖能力，还提高外植体的抗病毒特性。

发明内容

本发明披露一种蓝莓外植体的处理方法，具体步骤为：

1)选取蓝莓外植体：取健壮的蓝莓嫩枝或半木质化新梢；

2)微冻处理：在-6～-2℃进行微冻处理30～40分钟；

3)逐渐解冻：每间隔15-30分钟升温1-5℃。

进一步，所述微冻处理为在-4℃进行微冻处理30-40分钟。

进一步，逐渐解冻：每间隔20分钟升温2℃，至常温。

本申请中的常温可以是室外温度或者10-30℃，优选的，常温为15-25℃。

蓝莓外植体还可以为带叶柄或不带叶柄的叶片、当年生绿枝茎段。

本申请中蓝莓外植体可以是健壮的蓝莓嫩枝、半木质化新梢、蓝莓茎段或茎尖、当年生绿枝茎段、带叶柄的叶片、不带叶柄的叶片等。

一种蓝莓外植体，所述外植体是采用上述方法处理得到的外植体。

一种蓝莓组培苗的培养方法，包括上述蓝莓外植体的处理方法。

进一步，所述培养方法还包括：

外植体消毒：将微冻处理后的外植体剪成茎段并洗净后消毒；

诱导培养：接种于诱导培养基中进行诱导分化，得到蓝莓初代组培苗；

生根培养：接种到生根培养基中进行生根培养，得到生根试管苗。

本申请中外植体消毒包括外植体的灭菌，可采用乙醇、升汞、次录酸钠、双氧水等方式进行消毒，消毒之前可用洗衣粉液等浸泡外植体后流水冲洗数分钟。用乙醇对外植体消毒一般采用70-75％的使用浓度，时间为30s-10min；升汞的使用浓度一般采用0.1％，时间为5-10min。外植体消毒也可以是上述几种方式中的两种或多种的组合，例如乙醇和升汞的组合，具体如：先用70％酒精消毒1-2min， 0.1％升汞灭菌6-10min，无菌水冲洗数次。所述数次可以是1-10次不等。

本申请中培养基可选用多种培养基，如WPM、MS、1/2WPM、1/2MS或介于 WPM和MS培养基之间的MW培养基等；

优选的，诱导培养基为MS培养基；

优选的，可以在诱导培养基中添加激素，如ZT、IBA、6-BA、NAA等；更优选的，激素的浓度可选择的范围如ZT0.5～2.0mg/L,6-BA 0.5～5.0mg/L，NAA 0.05～0.3mg/L；

优选的，适宜温度为23-25摄氏度，光照强度1600LX-2500LX。

进一步，诱导培养后先进行继代培养，后进行生根培养，所述继代培养为，取诱导培养得到的蓝莓初代组培苗的茎或叶，在继代培养基中进行继代培养，继代3-7次后，得到蓝莓组培苗；

优选的，将蓝莓初代组培苗的茎尖切割成1-3cm左右或者组培苗的叶置于继代培养基中进行继代培养；

优选的，在继代培养基中添加细胞***素和/或生长素；优选的，继代培养基中添加ZT、IBA、GA或上述几种激素的组合；激素的浓度可选择的范围如ZT0.5～ 4.0mg/L，6-BA0.05～1.0mg/L；

更优选的，继代培养基为WPM+ZT0.5～1.0mg/L。

优选的，在生根培养基中添加激素，如IBA、NAA或上述激素的组合；优选的激素浓度可选择的范围如IBA0.05～3.0mg/L，NAA0.05～2.0mg/L；

更优选的，生根培养基为1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～2.0mg/L。

进一步，得到生根试管苗后，进行瓶外生根，瓶外生根为将生根苗剪成小段，扦插到生根基质中，得到蓝莓种苗。

优选的，生根试管苗置于移栽环境数天后，打开瓶口，进行练苗，练苗3-5天后可移栽到温室大棚进行穴盘培育，移栽到瓶外后植株可陆续长出新根。

进一步，所述外植体消毒为将微冻处理后的外植体切割成0.5-3cm的茎段并洗净，采用包括70-75％酒精、升汞、次氯酸钠、双氧水等方法消毒，消毒后用无菌水冲洗数次；

所述诱导培养为将消毒后的外植体接种于MS诱导培养基上进行诱导分化，得到蓝莓初代组培苗；

所述生根培养为取1cm以上的茎尖接入改良的1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～2.0mg/L生根培养基上进行生根培养。

一种蓝莓组培苗的培养方法，包括如下步骤：

选取蓝莓外植体：取健壮的蓝莓嫩枝、半木质化新梢、叶片或当年生绿枝茎段；

微冻处理：在-6～-2℃进行微冻处理30～40分钟；

外植体消毒：将微冻处理后的外植体剪成茎段并洗净后消毒，所述消毒包括将茎段置于无菌工作台上用70-75％酒精浸泡1-2min，0.1％升汞灭菌6-10min，无菌水冲洗数次；

诱导培养：将消毒后的外植体接种于MS诱导培养基中进行诱导分化，得到蓝莓初代组培苗；

继代培养：取诱导培养得到的蓝莓初代组培苗的茎或叶，茎段切割成1-3cm 左右，在WPM+ZT0.5～1.0mg/L继代培养基中进行继代培养，继代3-7次后，得到蓝莓组培苗；

生根培养：将蓝莓组培苗接种到1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭 +IBA0.5～2.0mg/L生根培养基中进行生根培养，得到生根试管苗。

本发明的优点：

微冻处理后的蓝莓外植体，生根能力更强，生根培养和瓶外生根等阶段的表现远远好于未经微冻处理的蓝莓外植体。

微冻处理后的蓝莓外植体得到的组培苗表现出一定的抗病毒能力，这是因为微冻处理时，细胞在微冻环境的影响下启动抗逆机制。

附图说明

图1位继代培养中的蓝莓苗；

图2为微冻处理和未经微冻处理的蓝莓组培对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例蓝莓外植体微冻处理及组织培养

材料：蓝莓品种为布里吉塔，微冻机和微冻液购自盛林蓝莓集团股份有限公司；

培养基的配置：诱导培养基为MS培养基，继代培养基为WPM+ZT0.5～ 1.0mg/L，生根培养基为1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～ 2.0mg/L，灭菌备用。

蓝莓外植体的处理与组织培养：

(1)选取蓝莓外植体：取健壮的蓝莓嫩枝或半木质化新梢；

(2)微冻处理：零下4度进行微冻处理30-40分钟(对照组不进行此处理)；

(3)外植体消毒：将材料分别切割为1-2cm的茎段，在超净工作台上，先用70％酒精消毒1-2min，0.1％升汞灭菌6-10min，无菌水冲洗3-7次；

(4)诱导培养：将消毒后的布里吉塔茎段，接种于MS诱导培养基中进行培养，温度为23-25摄氏度，光照强度1600LX-2500LX，接种后1周观察外植体萌芽情况，40天后统计外植体的萌芽率；

(5)继代培养：将诱导培养出的丛生芽割为1-2cm茎段，每组接种30个，转接到继代培养基(WPM+ZT0.5～1.0mg/L)进行继代培养，每30-40d 一代，枝高2-7cm，统计蓝莓增殖系数；

(6)生根培养：取2.5cm以上新枝或新梢接入改良的1/2WPM生根培养基 (1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～2.0mg/L)中进行生根培养，每瓶3株，接种后首先进行10天暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度20-25摄氏度，一般2周左右开始生根，40天时统计生根率。

(7)瓶外生根：将生根苗的瓶苗放在光线较好的室内，揭开盖，炼苗3-5天后，除去培养基，移至温室大棚的移栽基质中进行穴盘培育，(移栽基质由草炭土、珍珠岩、苔藓组成)，适当遮阴，注意肥水管理，40天后调查移栽后蓝莓植株的移栽成活率，60天后可移至棚外进行壮苗培育。

萌芽率(％)＝萌芽数/接种芽数

增殖系数＝增殖个数/接种茎段数

生根率(％)＝生根的苗数/接种的苗数

移栽成活率(％)＝成活株数/移栽株数

发明人对继代培养基的组合和浓度进行了反复的摸索和优化，最终确定 WPM+ZT0.5～1.0mg/L为最佳，使用此继代培养基完成了数个蓝莓品种的继代苗的繁育，数量达1.5万株，部分继代苗情况如图1所示，长势良好。移栽40天后结果如图2所示，图2中上图为微冻处理组，下图为未经微冻处理组，具体统计结果见下表，本申请中选用的是幼嫩枝条作为外植体，故而整体的萌芽率较高， 40天时微冻处理组的萌芽率较未对外植体微冻处理的萌芽率高近20％；两组增殖系数差距不大；蓝莓试管内生根较慢，生根率较低，发明人经过反复试验摸索，确定最佳生根培养基为1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～2.0mg/L，即使未经微冻处理组，接种30个新梢，培养40天后，生根株数为20 株，蓝莓生根率为67％，微冻处理组接种30个新梢，培养40天后，生根株数为 28株，蓝莓生根率高达93％。移栽40天后，统计蓝莓植株的成活率，微冻处理组的30棵植株均成活，且长势非常好，未微冻处理组的成活了13棵，但长势不佳。

表1

分组	微冻处理组	未微冻处理组
			萌芽率(％)	93％	73％
增殖系数	8.1	7.6
			生根率(％)	93％	67％
移栽成活率(％)	100％	43.3％

采用本申请提供的体系和工艺进行蓝莓组培，不同品种蓝莓(如蓝丰、都克、美登等)都可以适应，具有生根速度快、发根数目多、生根率高的特点，解决了蓝莓生产过程中发根难、所需时间长等制约蓝莓产业化发展的问题。

60天后移至棚外进行壮苗培育，在蓝莓植株大棚外培育过程中观察到，相对于未微冻处理组的蓝莓植株，经过微冻处理的蓝莓植株抗病毒能力更强，这是因为微冻处理时，细胞在微冻环境的影响下启动了抗逆机制，故而，组培后的蓝莓植株表现出了一定的抗病毒能力。

本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

Claims

1.一种蓝莓外植体的处理方法，所述蓝莓为布里吉塔，具体步骤为：

1)选取蓝莓外植体：取健壮的蓝莓嫩枝或半木质化新梢；

2)微冻处理：在-6～-2℃进行微冻处理30～40分钟；

3)逐渐解冻：每间隔15-30分钟升温1-5℃，至常温，所述常温为10-30℃。

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述微冻处理为在-4℃进行微冻处理30到40分钟。

3.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，逐渐解冻：每间隔20分钟升温2℃。

4.根据权利要求1-2任意一项所述的处理方法，其特征在于，蓝莓外植体替换为带叶柄或不带叶柄的叶片、当年生绿枝茎段。

5.一种蓝莓组培苗的培养方法，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述蓝莓外植体的处理方法。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，培养方法还包括：

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，诱导培养后先进行继代培养，后进行生根培养，所述继代培养为，取诱导培养得到的蓝莓初代组培苗的茎或叶，在继代培养基中进行继代培养，继代3-7次后，得到蓝莓组培苗。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，在继代培养基中添加细胞***素和/或生长素。

9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，继代培养基为WPM+ZT 0.5～1.0mg/L。

10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

微冻处理：在-6～-2℃进行微冻处理30～40分钟；

继代培养：取诱导培养得到的蓝莓初代组培苗的茎或叶，茎段切割成1-3cm，在WPM+ZT0.5～1.0mg/L继代培养基中进行继代培养，继代3-7次后，得到蓝莓组培苗；

生根培养：将蓝莓组培苗接种到1/2WPM+6％琼脂+2％蔗糖+0.2％活性炭+IBA0.5～2.0mg/L生根培养基中进行生根培养，得到生根试管苗。