CN113322523B - Rna快速建库方法及其应用 - Google Patents

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CN113322523B CN202110673954.9A CN202110673954A CN113322523B CN 113322523 B CN113322523 B CN 113322523B CN 202110673954 A CN202110673954 A CN 202110673954A CN 113322523 B CN113322523 B CN 113322523B
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Abstract

本发明提供一种RNA快速建库方法(Easy‑seq)，其步骤包括：提取样本中的total RNA，采用逆转录阻碍探针法去除rRNA，同时逆转录获得一端带有P7序列的cDNA；对多余的随机引物进行消解处理；对cDNA进行多聚腺苷酸化，在cDNA的3’端加上polyA，采用带有3’突出末端的双链DNA接头，在cDNA的另一端接上P5序列；文库扩增及回收。Easy‑seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy‑seq)。相较于已有的scRNA‑seq技术，scEasy‑seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。

Description

RNA快速建库方法及其应用
技术领域
本发明专利涉及一种RNA快速建库方法，属于生物技术领域。
背景技术
RNA二代测序技术(RNA Next-generation sequencing,RNA-seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA-seq的关键步骤。传统的RNA建库方法需要的RNA投入量较大(1ng以上)，因此建库需要的细胞量较多(每个人类细胞中的总RNA量低于10pg)。此外，传统的RNA建库技术获得的RNANGS文库无法区分RNA的具体细胞来源，RNA-seq获得的数据只能分析样本中RNA丰度的平均值，而不能计算出样本中每个细胞的RNA表达丰度。这对于异质性较大的样本如血液样本、肿瘤组织样本、羊水样本、胚胎样本和小型动植物个体等的RNA种类及丰度的检测是极为不利的，在很大程度上影响了疾病的诊断和生长发育进程的分析。
单细胞转录组测序技术(Single cell RNA sequencing,scRNA-seq)的出现，为解决样本异质性问题提供了有效的方案。通过激光捕获显微切割技术、流式细胞仪技术、微滴技术和微流体技术等单细胞分离技术获取独立的单个细胞，并通过逆转录反应为每个细胞的cDNA加上具有独立标识DNA序列(Cell barcode)，在测序数据分析过程中通过这个独立标识的DNA序列鉴别每条RNA序列的细胞来源，从而分析样本中每个细胞中的RNA丰度。scRNA-seq技术大大提高了我们对生物***和细胞病变的了解，使研究者能够以前所未有的分辨率研究基因表达图谱。scRNA-seq为分析和诊断疾病进程、血液细胞分型、产前诊断和生物生长发育提供了更加高效准确的工具与方案，因此受到科学研究和疾病诊治领域的广泛关注。但是，scRNA-seq需要对单个细胞的RNA进行文库构建，这极大地提高了RNA建库的难度。传统的RNA建库技术操作复杂、损失严重，因此无法应用在scRNA-seq的文库构建上。为解决这一问题，研究者们开发了多种单细胞RNA文库构建方法，来提高RNA文库构建的效率，减少建库过程的损失，如Smart-seq、CEL-seq、Quartz-seq、SUPeR-seq和MATQ-seq等。但这些scRNA-seq技术由于建库设计的原因，存在基因检出率低、RNA信息完整度差和操作复杂等缺陷，严重阻碍了scRNA-seq技术的发展和应用。因此，开发一种更加高效的单细胞转录组测序技术，对于疾病诊断和生物生长发育等研究，具有重要的意义。
本发明提供一种高效快速的RNA建库技术，称为Easy-seq(Easy RNAsequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种RNA快速建库方法，具有耗时短、操作简单和损失小的优点。
本发明采取的技术方案为：一种RNA快速建库方法，其特征在于其步骤包括：
(1)提取样本中的total RNA，采用逆转录阻碍探针法去除rRNA，同时逆转录获得一端带有P7序列的cDNA；
(2)对多余的随机引物进行消解处理；
(3)对cDNA进行多聚腺苷酸化，在cDNA的3’端加上polyA，采用带有3’突出末端的双链DNA接头，在cDNA的另一端接上P5序列；
(4)文库扩增及回收。
优选的，步骤(1)中使用的逆转录引物的5’端带有P7序列和识别细胞的独立标识DNA序列。
优选的，步骤(3)中双链DNA接头的3’突出末端为一段多聚胸腺嘧啶的单链DNA序列，与cDNA的多聚腺苷酸配对。
优选的，步骤(3)中多聚胸腺嘧啶的数量为10-15个。
优选的，步骤(2)中消解处理使用的酶为T4 DNA聚合酶、Exonuclease I、Exonuclease T的一种或多种。
优选的，步骤(2)中消解处理的温度为37℃，时间为10-60分钟。
优选的，步骤(3)中多聚腺苷酸化和接头连接同时进行，采用的酶混合物包括TdT，还包括T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶或E.coli DNA连接酶的一种或多种。
优选的，步骤(1)中逆转录引物序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+细胞识别序列+NNNNNNNN；
步骤(3)中的接头序列为：F：/5Phos/分子识别标志+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NH2C6/；
R:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+分子识别标志+poly(dT)/NH2C6/，其中poly(dT)的数量为10-15个。
其中细胞识别序列可用于区分细胞来源，分子识别标志用于区分原始的DNA分子拷贝。
优选的，步骤(3)中反应温度为37℃，时间为10-30分钟。
本发明公开的上述的RNA快速建库方法可应用于单细胞转录组测序。
本发明目的在于提供一种高效快速的RNA建库技术，称为(Easy RNAsequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。
附图说明
图1Easy-seq和scEasy-seq流程。
图2Easy-seq和scEasy-seq建库原理示意图。
图3Easy-seq与传统RNA-seq在文库产量上对比。
图4Easy-seq与传统RNA-seq的文库大小对比。
图5Easy-seq对不同RNA投入量建库的文库大小。
图6scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的原理比较。
图7scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的特点比较。
图8scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的文库大小分布比较。
图9scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的文库产量比较。
图10scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的转录组比对率比较。
图11scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的rRNA残留率比较。
图12scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的基因检出数比较。
图13scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的基因区域覆盖均一性比较。
图14scEasy-seq结合微流控进行scRNA-seq流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基。
表1探针及引物序列
实施例1：Easy-seq流程的建立
在本实施例中，我们组建了Easy-seq的流程，流程和原理示意图见图1。具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：
表2
组分 用量
RNA 1μg
4μM 5.8S/18S/28S rRNA probe mix(202110257924.X) 1μL
0.3mM P7 Random primer 1μL
5×First-Strand Buffer 1.8μL
25mM dNTPs 0.5μL
补DEPC水至 7.3μL
94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。
表3
组分 用量
上述反应体系 7.3μL
0.1M DTT 0.5μL
SuperScriptTMIII RT(200U/μL，ThermoFisher) 1μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
Total 9μL
25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃ 10min，立即置于冰上。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R1溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表4
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa) 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。
37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。
3)文库扩增及回收
表5
98℃ 3min，7cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。
反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。
实施例2：不同外切酶消化对Easy-seq文库产量的影响。
在本实施例中，我们验证了3种不同外切酶消化方法对Easy-seq文库产量的影响。具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：
表6
组分 用量
RNA 1μg
4μM 5.8S/18S/28S rRNA probe mix(202110257924.X) 1μL
0.3mM P7 Random primer 1μL
5×First-Strand Buffer 1.8μL
25mM dNTPs 0.5μL
补DEPC水至 7.3μL
94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。
表7
组分 用量
上述反应体系 7.3μL
0.1M DTT 0.5μL
SuperScriptTM III RT(200U/μL，ThermoFisher) 1μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
Total 9μL
25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。
外切酶条件1：加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。
外切酶条件2：加入0.25μL Exonuclease I(20U/μL，NEB)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。
外切酶条件3：加入1μL Exonuclease T(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。
按照实施例1进行P5接头连接和文库扩增及回收。结果如下表所示：
表8三种外切酶消解方式对Easy-seq文库产量的影响
结果如表8所示，三种外切酶的消化都具有良好的文库产量，其中T4 DNA聚合酶消化未参与逆转录的引物，Easy-seq的文库产量最高。
实施例3：不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。
在本实施例中，我们验证了不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。
具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：
表9
组分 用量
RNA 1μg
4μM 5.8S/18S/28S rRNA probe mix(202110257924.X) 1μL
0.3mM P7 Random primer 1μL
5×First-Strand Buffer 1.8μL
25mM dNTPs 0.5μL
补DEPC水至 7.3μL
94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。
表10
组分 用量
上述反应体系 7.3μL
0.1M DTT 0.5μL
SuperScriptTMIII RT(200U/μL，ThermoFisher) 1μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
Total 9μL
25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。
加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ x min，85℃ 10min，立即置于冰上。(x为10、20、30、40、50、60)
按照实施例1进行P5接头连接和文库扩增及回收。结果如下表所示：
表11不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响
消化时间/min 10 20 30 40 50 60
文库产量/ng 535 517 485 424 389 371
结果如表11所示，T4 DNA聚合酶的消化时间在10-20min时，Easy-seq的文库产量最高。为保证逆转录引物消解充分，选定T4 DNA聚合酶的消化时间为20min。
实施例4：不同连接酶对Easy-seq文库产量的影响。
在本实施例中，我们验证了不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。
具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F分别与100μM P5-R1溶解于1×Annealing buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表12
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
不同的连接酶 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。
连接酶1：E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa)
连接酶2：T4 DNA ligase(400U/μl，NEB)
连接酶3：Taq DNA ligase(40U/μl，NEB)
按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：
表13不同DNA连接酶对Easy-seq文库产量的影响
结果如表13所示，使用E.coli DNA ligase时，Easy-seq的文库产量最高。
实施例5：DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响。
在本实施例中，我们验证了DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响。
具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R(1-6)溶解于1×Annealing buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表14
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa) 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。
按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：
表15 DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响
DNA接头寡聚胸腺苷酸长度/nt 10 12 14 16 18 20
文库产量/ng 549 597 583 529 441 408
结果如表15所示，当DNA接头寡聚胸腺苷酸长度为12nt(P5-R2)时，Easy-seq的文库产量最高。
实施例6：DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响。
在本实施例中，我们验证了DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响。具体方式如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表16
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa) 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
37℃ x min，95℃ 2min，保存于4℃。(x为10，15，20，30，40，60)
按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：
表17 DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响
DNA接头连接时间/min 10 15 20 30 40 60
文库产量/ng 721 749 745 712 653 608
结果如表17所示，当DNA接头连接时间为15min时，Easy-seq的文库产量最高。
实施例7：Easy-seq与传统RNA建立方法的比较
根据实施例1-6，我们组建出最佳的Easy-seq流程。流程和原理示意图见图1和图2，具体流程如下：
1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：
表18
94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。
表19
组分 用量
上述反应体系 7.3μL
0.1M DTT 0.5μL
SuperScriptTMIII RT(200U/μL，ThermoFisher) 1μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
Total 9μL
25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 20min，85℃ 10min，立即置于冰上。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表20
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa) 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。
37℃ 15min，95℃ 2min，保存于4℃。
3)文库扩增及回收
表21
98℃ 3min，7cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。
反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。
在本实施例中，我们将优化好的Easy-seq与传统的RNA建库方法进行了对比。传统RNA建库方法使用UltraTMII Directional RNA Library Prep Kit forIllumina进行文库构建，RNA投入量为1000ug，建库流程按照产品说明书进行。
使用Qubit对构建好的文库进行定量，Qsep 100验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。结果见表22、图3-图4。
表22 1000ng RNA投入量的文库产量
方法 文库产量/ng 比对率(％) rRNA残留率(％) 基因检出数
Easy-seq rep1 953 99.15 0.69 27795
Easy-seq rep2 976 99.24 0.81 27347
传统RNA-seq rep1 311 99.22 0.54 25418
传统RNA-seq rep2 337 99.28 0.63 25052
结果如表22和图3、图4所示，相较于传统RNA-seq方法，Easy-seq能够显著提高文库的产量。在比对率和rRNA去除效率上，Easy-seq和传统RNA-seq都能够高效去除rRNA，并具有很高的比对率。在基因检出数上，Easy-seq要比传统RNA-seq略高。这些结果表明，Easy-seq比传统RNA-seq具有更高的建库效率和产量。
实施例8：Easy-seq对不同RNA投入量的建库效果
在本实施例中，我们验证了Easy-seq在HEK293F 0.01ng-1000ng RNA投入量条件下的建库效果，实验流程见实施例1，PCR循环数和文库产量见表23，文库大小分布见图5。
表23
RNA投入量/ng 循环数 文库产量/ng 比对率(％) rRNA残留率(％) 基因检出数
1000 7 823 99.26 0.52 28429
100 10 629 99.29 0.41 28391
10 14 607 99.05 0.29 27044
1 18 702 98.41 0.26 25884
0.1 21 534 96.72 0.24 23309
0.01 25 423 92.43 0.47 21063
结果如表23和图5所示，Easy-seq可以对投入量为0.01-1000ng的RNA进行转录组建库，且具有较高的文库产量和基因检出率。这说明Easy-seq可以应用于单个细胞RNA起始量(10pg左右)的文库构建。
实施例9：Easy-seq在单细胞转录组建库过程的应用
在本实施例中，我们验证了Easy-seq对单个细胞来源样本的转录组建库效果，流程示意图见图1。具体方式如下：
1)细胞裂解，rRNA去除、逆转录和随机引物消解：
使用流式细胞分离技术分离出单个HEK293F细胞，置于5.5μL细胞裂解液中。
表24
细胞裂解液组分 用量
0.2％Triton X-100 2.7μL
4μM 5.8S/18S/28S rRNA probe mix(202110257924.X) 1μL
10μM P7 Random primer 1μL
25mM dNTPs 0.4μL
0.1M DTT 0.2μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
5×First-Strand Buffer 1.8μL
Total 7.3μL
94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。
表25
组分 用量
上述反应体系 7.3μL
0.1M DTT 0.5μL
SuperScriptTMIII RT(200U/μL，ThermoFisher) 1μL
SUPERase·InTM RNase抑制剂(20U/μL) 0.2μL
Total 9μL
25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃ 10min，立即置于冰上。
2)P5接头连接
P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。
表26
组分 用量
上述反应体系 10μL
10×P5连接缓冲液 1.5μL
100mM dATP 0.5μL
末端脱氧核苷转移酶TdT(20U/μL，ThermoFisher) 0.5μL
E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa) 0.5μL
10μM P5接头 0.5μL
Total 15μL
10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。
37℃ 15min，95℃ 2min，保存于4℃。
3)文库扩增及回收
表27
98℃ 3min，25cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。
反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。
Smart-seq使用TaKaRa的Single Cell PLUS Kit进行建库测序，流程参照其说明书。
MATQ-seq按照Nature Methods(Sheng et al.,2017)的流程进行操作。
SUPeR-seq按照Genome Biology(Fan X.et al.,2015)的流程进行操作。
使用Qubit对构建好的文库进行定量，Qsep 100验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。各类单细胞测序技术示意图和特点见图6和图7。结果见表28和图8-13。
表28
scRNA-seq技术 文库产量/ng 比对率(％) rRNA残留率(％) 基因检出数 覆盖均一性
scEasy-seq(本专利) 519 93.37 0.79 22531 0.94
SUPeR-seq 324 91.26 72.46 10369 0.82
Smart-seq2 141 91.34 8.93 13413 0.81
MATQ-seq 508 89.03 79.85 12597 0.86
如表28和图8-13所示，相较于其他三种单细胞转录组测序技术，scEasy-seq具有文库产量高、比对率高、rRNA残留少、基因检出数高和覆盖均一性好等优点，能够显著单细胞转录组测序文库和数据的质量，简化单细胞转录组测序的操作和降低单细胞转录组测序的成本。
综上，本发明提供一种高效快速的RNA建库技术，称为(Easy RNA sequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq，如图14)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。

Claims (8)

1.一种RNA快速建库方法，其特征在于其步骤包括：
（1）提取样本中的total RNA，采用逆转录阻碍探针法去除rRNA，同时逆转录获得一端带有P7序列的cDNA；
（2）对多余的随机引物进行消解处理；
（3）对cDNA进行多聚腺苷酸化，在cDNA的3’端加上polyA，采用带有3’突出末端的双链DNA接头，在cDNA的另一端接上P5序列，所述双链DNA接头的3’突出末端为一段多聚胸腺嘧啶的单链DNA序列，与cDNA的多聚腺苷酸配对，多聚胸腺嘧啶的数量为12个，polyA的数量与之匹配；
（4）文库扩增及回收。
2.根据权利要求1所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（1）中使用的逆转录引物的5’端带有P7序列和识别细胞的独立标识DNA序列。
3.根据权利要求1所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（2）中消解处理使用的酶为T4 DNA 聚合酶、Exonuclease I、Exonuclease T的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（2）中消解处理的温度为37℃，时间为10-60分钟。
5.根据权利要求1所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（3）中多聚腺苷酸化和接头连接同时进行，采用的酶混合物包括TdT，还包括T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶或E.coliDNA连接酶的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（1）中逆转录引物序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+细胞识别序列+NNNNNNNN；
步骤（3）中的接头序列为：F：/5Phos/分子识别标志+ACACTCTTTCCCTACACGACGC
TCTTCCGATCT/NH2C6/;
R：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+分子识别标志+poly（dT）/NH2C6/。
7.根据权利要求6所述的RNA快速建库方法，其特征在于：步骤（3）中反应温度为37℃，时间为10-30分钟。
8.权利要求1-7中任一项所述的RNA快速建库方法在单细胞转录组测序中的应用。
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