CN114717251B - 一种用于预防SARS-CoV-2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗 - Google Patents
一种用于预防SARS-CoV-2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于病毒免疫学技术领域,公开了一种用于预防SARS‑CoV‑2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗,将Beta株的S和原始株的RBD基因通过高效自剪切P2A进行连接,其不但可以表达Beta株的S蛋白的抗原蛋白,而且可以表达原始株的RBD蛋白的抗原。免疫机体后可产生针对Beta突变株的SARS‑CoV‑2的中和抗体,而且还可以产生针对原始株SARS‑CoV‑2的中和抗体,从而有效保护机体免受Beta株SARS‑CoV‑2和原始株SARS‑CoV‑2的侵染。
Description
技术领域
本发明属于病毒免疫学技术领域,具体涉及一种用于预防SARS-CoV-2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗。
背景技术
针对新型冠状病毒,做好预防,阻断病毒的传播是控制疫情的关键。疫苗是预防和控制新型冠状病毒感染最经济有效的干预措施。已公布的一百多个SARS-CoV-2病毒基因组比对的结果显示病毒整体突变程度较低,未发生重组现象。因此,如果SARS-CoV-2疫苗研发成功,必将能够保护人群免受新冠病毒的感染,从而抑制新疫情的暴发。
SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中,组成“皇冠”的S-蛋白(Spike蛋白,刺突蛋白)是一个明显的靶点,成为大多数研究团队研究的重点。已有研究团队通过对S蛋白三维结构计算机模拟,成功地揭示了S蛋白与其侵入细胞过程中的受体ACE2的关系。因此,S蛋白在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。根据研究报道,S蛋白存在融合前构象和融合后构象,S蛋白与宿主细胞的ACEII受体结合,通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切割,使蛋白分为S1和S2,促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合实现病毒的感染入侵,融合后产生的抗体多为结合抗体,没有中和作用,所以在疫苗研发设计中如何维持S蛋白保持融合前构象是疫苗研发成功的关键。
根据世界卫生组织报告,出现了一株SARS-CoV-2的突变病毒株,其致病力和传播力均大大的增强,而且可以逃逸现有疫苗中和抗体的中和作用,极大的削弱了目前疫苗的免疫保护作用。根据GISAID数据报道,Beta分离出一株新冠病毒N501Y.V2其Spike蛋白的RBD(Receptor binding domain,受体结合区)结合位点界面发生了三个重要突变,即:K417N,E484K和N501Y。该突变可能使病毒逃逸现有疫苗免疫后产生的中和抗体的中和作用。目前上市疫苗为灭活疫苗、亚单位蛋白疫苗、mRNA疫苗和腺病毒载体疫苗,这些疫苗主要针对的是原始株SARS-CoV-2,其对Beta突变株的保护效果均有下降,都不能做到免疫后对Beta株产生十分理想的免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种用于预防和/或治疗SARS-CoV-2原始株和Beta株感染的新型腺病毒疫苗载体,可以有效保护机体免受Beta株SARS-CoV-2和原始株SARS-CoV-2的侵染。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种核酸分子,所述核酸分子包含以下核酸序列:
a)SEQ ID NO:5所示核酸序列;或
b)与SEQ ID NO:5具有至少90%、95%、98%、或99%序列同一性的核酸序列。
在一些实例中,所述核酸分子用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引发的感染。
在一些实例中,所述核酸分子用于预防和/或治疗SARS-CoV-2原始株和Beta株引发的感染。
在一些实例中,所述核酸分子可在人源细胞或人体内表达蛋白。
在一些实例中,所述蛋白可在人体内:
诱导免疫应答;或
产生生物报告分子;或
产生用于检测的分子;或
能调节基因功能;或
成为治疗性分子。
所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答。
本发明的第二方面,提供一种表达载体,其特征在于,所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸分子。
在一些实例中,所述载体为病毒载体。
在一些实例中,所述载体为腺病毒载体。在一些实例中,所述腺病毒载体为Ad1载体、Ad2载体、Ad3载体、Ad4载体、Ad5载体、Ad6载体、Ad7载体、Ad8载体、Ad9载体、Ad10载体、Ad11载体、Ad12载体、Ad13载体、Ad14载体、Ad15载体、Ad16载体、Ad17载体、Ad18载体、Ad19载体、Ad20载体、Ad21载体、Ad22载体、Ad23载体、Ad24载体、Ad25载体、Ad26载体、Ad27载体、Ad28载体、Ad29载体、Ad30载体、Ad31载体、Ad32载体、Ad33载体、Ad34载体、Ad35载体、Ad36载体、Ad37载体、Ad38载体、Ad39载体、Ad40载体、Ad41载体、Ad42载体、Ad43载体、Ad44载体、Ad45载体、Ad46载体、Ad47载体、Ad48载体、Ad49载体、Ad50载体、Ad51载体、或Ad52载体中的至少一种。在一些实例中,所述载体为Ad5载体。
在一些实例中,所述载体为腺病毒空载体,优选为Ad5空载体。
在一些实例中,所述载体为复制缺陷型腺病毒载体,优选为复制缺陷型Ad5载体。
在一些实例中,所述复制缺陷型腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型腺病毒载体,优选为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad5载体。
本发明的第三方面,提供一种表达细胞,其特征在于,所述表达细胞可基于本发明第一方面所述核酸分子表达蛋白。
在一些实例中,所述表达细胞是采用本发明第二发明所述表达载体转化或转染的宿主细胞。
在一些实例中,所述细胞不包括繁殖材料。
本发明的第四方面,提供一种疫苗,其特征在于,所述疫苗包括a)SEQ ID NO:5所示核酸序列;或b)与SEQ ID NO:5具有至少90%、95%、98%、或99%序列同一性的核酸序列。
在一些实例中,所述疫苗用于预防和/或治疗SRAS-CoV-2的感染。在一些实例中,所述疫苗用于预防/或治疗SRAS-CoV-2的原始株和Beta株的感染。
在一些实例中,所述疫苗的载体为病毒载体。
在一些实例中,所述载体为腺病毒载体。在一些实例中,腺病毒载体为前文所述的Ad1-Ad52中至少一种腺病毒载体。在一些实例中,所述载体为Ad5载体。
在一些实例中,所述载体为腺病毒空载体,优选为Ad5空载体。
在一些实例中,所述载体为复制缺陷型腺病毒载体,优选为复制缺陷型Ad5载体。
在一些实例中,所述复制缺陷型腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型腺病毒载体,优选为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad5载体。
在一些实例中,所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。佐剂、载体、稀释剂或赋形剂根据疫苗的具体剂型进行选择。
在一些实例中,所述疫苗的剂型包括但不限于注射剂、口服剂、吸入剂等常见的疫苗剂型。
在一些实例中,所述疫苗还可以与其他疫苗联用。
在一些实例中,所述疫苗还包括至少一种对COVID-19有预防和/或治疗作用的药物。
本发明的第五方面,提供一种本发明第一方面所述核酸分子、第二方面所述表达载体、或第四方面所述疫苗的应用,所述应用包括:
制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物;
制备COVID-19检测试剂;或
制备基因功能调节剂。
在一些实例中,所述感染是SARS-CoV-2原始株和/或SARS-CoV-2Beta株引发的感染。
本发明的第六方面,提供,一种预防或治疗SARS-CoV-2株引发的感染的方法,包括给予有需要的受试者有效量或治疗有效量的本发明第四方面所述疫苗。
在一些实例中,所述感染是SARS-CoV-2原始株和/或SARS-CoV-2Beta株引发的感染。
根据本发明的前述方面,在一些实例中,本发明所述SARS-CoV-2原始株的刺突蛋白(Spike protein,S)的氨基酸序列如NCBI登录号YP_009724390.1所示。在一些实例中,本发明所述SARS-CoV-2原始株的全基因组序列如NCBI登录号NC_045512.2所示。
本发明的有益效果是:
本专利研发的新型腺病毒疫苗载体Ad5-S33,将SARS-CoV-2原始Beta株的S和Beta株的RBD基因通过高效自剪切P2A进行连接,其不但可以表达Beta株的S蛋白的抗原蛋白,而且可以表达原始株的RBD蛋白的抗原,免疫机体后可产生针对Beta突变株的SARS-CoV-2的中和抗体,而且还可以产生针对原始株SARS-CoV-2的中和抗体,可以有效保护机体免受Beta株SARS-CoV-2和原始株SARS-CoV-2的侵染。
附图说明
图1是Beta突变株的S基因和原始株RBD基因的穿梭质粒pGA1-S33构建的技术流程图。先采用PGA1-NB14b质粒为模板,构建Beta突变株的S基因的穿梭质粒pGA1-S14c;再采用pGA1-S14c和PGA1-tpaRBD质粒为模板,构建Beta突变株的S基因和原始株RBD基因的穿梭质粒pGA1-S33。
图2是Ad5-S33的病毒纯化图。
图3是Ad5-S33病毒侵染A549细胞后Beta株S蛋白和原始株RBD蛋白的表达图。1为A549细胞的空白对照,2为Ad5-S33样品,3为Beta株S蛋白和原始株RBD蛋白的阳性对照,4为Marker(图中其余没有标记名称的5条泳道是其他样品,不涉及本专利内容)。
图4是Ad5-S33免疫小鼠的血清抗体水平。
图5是Ad5-S33免疫小鼠针对SARS-CoV-2原始株的中和抗体。
图6是Ad5-S33免疫小鼠针对SARS-CoV-2Beta株的中和抗体。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料,除特殊说明外,均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
Spike基因的优化方案
SARS-CoV-2的刺突蛋白(Spike protein,S)的氨基酸序列如YP_009724390.1所示。真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程,最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化,同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点,保证了蛋白表达的唯一性,减少了蛋白后续纯化的难度。优化得到的核酸序列记为NB2,如SEQ ID NO.1所示(在发明人的在先授权专利CN110974950B和CN110951756B中被保护)。
实施例1携带Beta突变株的S基因和原始株RBD基因的双抗原载体pAd5-S33构建
1、构建Beta突变株的S基因的穿梭质粒pGA1-S14c
以PGA1-NB14b(英国突变株S基因载体,其因序列是在SEQ ID NO.1原始株序列上进行点突变获,所述突变包含了RBD区域含有N501Y点突变,同时将弗林酶切位点突变,增加了S2区域中986~987位置的氨基酸KV突变为PP而获得的;以上突变促进蛋白质维持融合前构象,从而诱导中和抗体;所述NB14b的序列如SEQ ID NO:2所示;由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)质粒为模板。以S-F和K417N-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段S14C-L。
S14C-L扩增引物序列:
S-F:ggtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtg(SEQ IDNO:6)
K417N-R:gatgttgccggtctgtcctggtgcgatctggcgcacctcgtcgcccctg(SEQ ID NO:7,下划线处引入K417N突变)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
以PGA1-NB14b质粒为模板,以K417N-F和E484K-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段S14C-R。
S14C-R扩增引物序列:
K417N-F:ggacagaccggcaacatcgcagactacaattataagctgcctgacg(SEQ ID NO:8,下划线处引入K417N突变)
E484K-R:acagttaaagcccttcacgccattgcagggtgtagagccggcctggtag(SEQ ID NO:9,下划线处引入E484K突变)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
以PGA1-NB14b(质粒为模板,以CMV-R和E484K-F为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段PGA1-R。
pGA1-R骨架扩增引物序列:
CMV-R:ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg(SEQ ID NO:10);
E484K-F:gtgaagggctttaactgttatttccctctgcagtcctacggcttcc(SEQ ID NO:11,下划线处引入E484K突变)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
将目的片段S14C-L、S14C-R和载体骨架pGA1-R采用同源重组酶(Vazyme)进行重组,得到携带Beta突变株S基因的穿梭质粒pGA1-S14c(所述S14c的序列如SEQ ID NO:3所示)。
2、构建Beta突变株的S基因和原始株RBD基因的穿梭质粒pGA1-S33
以pGA1-S14c质粒为模板,以S-F和S-P2A-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段S14C-P2A。
S14C扩增引物序列:
S-F:ggtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtg(SEQ IDNO:6)
S-P2A-R:attggtagcaccagagccggtgtagtgcagcttcacgcccttcagcacaggctcgg(SEQID NO:12)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
以PGA1-tpaRBD(由广州恩宝生物医药科技有限公司保存,所述tpaRBD的序列如SEQ ID NO:4所示)质粒为模板,以TPA-P2A-F和RBD-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段P2A-tpaRBD。
P2A-tpaRBD扩增引物序列:
TPA-P2A-F:ttctgaaacaagccggtgacgtcgaggaaaacccaggccctatggatgccatgaagagg(SEQ ID NO:13)
RBD-R:agaatagggccctctagactagtttaggagcatggggtgatgtccaggatctcc(SEQ IDNO:14)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
以PGA1-S14c质粒为模板,以CMV-R和BGH-F为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段PGA1。
pGA1骨架扩增引物序列:
CMV-R:ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg(SEQ ID NO:10);
BGH-F:tctagagggccctattctatagtgtc(SEQ ID NO:15)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃30s,28个循环;72℃5min,4℃保存。
将目的片段S14C-P2A、P2A-tpaRBD和载体骨架pGA1采用同源重组酶(Vazyme)进行重组,得到携带Beta突变株S基因和原始株RBD基因穿梭质粒pGA1-S33(所述S33的序列如SEQ ID NO:5所示)。
3、构建Beta突变株的S基因和原始株RBD基因的pAd5-S33
以pGA1-S33质粒为模板,PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV-S33-BGH目的片段,胶回收。
CMV-S33-BGH目的片段扩增引物序列:
Ad5-SB-F:TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG(SEQ ID NO:16);
Ad5-SB-R:GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC(SEQ ID NO:17)。
PCR程序:98℃3min;98℃10s,60℃5s,72℃50s,28个循环;72℃5min,采用胶回收试剂盒回收目的片段,4℃保存。
pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收;将携带同源重组臂的CMV-S33-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183,同源重组得到携带S33基因的pAd5-S33质粒(所述S33的序列如SEQ ID NO:5所示),技术流程如图1所示。
实施例2针对SARS-CoV-2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗
1、Ad5-S33载体的拯救与生产
按照常规方法,Ad5-S33以PacI线性化,乙醇沉淀回收,阳离子脂质体转染法转染293细胞,转染后4小时,加入2毫升含5%胎牛血清的DMEM培养基,孵育7-10天,观察细胞病变;出毒后,收集细胞及培养上清,在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片,上清感染10厘米皿;2-3天后,收集细胞及培养上清,反复冻融3次并离心去除细胞碎片,上清感染3-5个15厘米皿;2-3天后,收集细胞,反复冻融3次并离心去除细胞碎片;上清感染30个15厘米皿2-3天后,收集细胞,反复冻融3次并离心去除细胞碎片;上清加至氯化铯密度梯度离心管;4℃,40000转,离心4小时;吸出病毒条带,脱盐,分装;以OD260吸光度测定病毒粒子滴度,计算公式为:病毒浓度=OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb);病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果参见图2。
2、检测Spike基因表达:
用Ad5-S33病毒侵染A549细胞,24h后收集细胞。按照常规的WesternBlot方法处理样品,并进行蛋白检测。结果如图3所示,可以看出疫苗候选株Ad5-S33样品中能够观察到Beta株S蛋白和原始株RBD蛋白的表达,说明Ad5-S33疫苗候选株构建正确,可以成功表达S抗原蛋白和RBD抗原蛋白。
3、动物免疫原性评价
6-8周龄Balb/c小鼠分为2组,Ad5-empty组和Ad5-S33组,每组5只。第0天,Ad5-empty组肌注免疫Ad5-empty,Ad5-S33组肌注免疫Ad5-S33,剂量均为:1×109vp/只,均采用肌注的接种方式;第28天,眼眶取血并分离血清。采用酶联免疫吸附测定(ELISA),以新冠病毒的S蛋白为抗原检测血清中的抗体水平。具体操作为:
(1)96孔板,每孔加50ng的RBD蛋白,4℃过夜,
(2)吸掉上清,采用PBST洗3次,每孔加入200ul 5%BSA室温封闭2h;
(3)PBST洗3次;每孔加入采用PBS以1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800,1:25600和,1:51200稀释的小鼠血清,37℃孵育2h;
(4)加酶标抗体:加入100ul稀释后HRP标记IgG二抗,37℃孵育2h;
(5)PBST洗6-8次;
(6)加底物液显色:加入100ul TMB显色;
(7)终止反应:加入50ul 1M硫酸终止反应;
(8)结果判定:测OD值,OD值控制在0.1-4。
(9)如图4所示,实验结果表明,Ad5-S33能够诱异小鼠产生针对Beta株新冠病毒和原始株新冠病毒的特异性抗体。
4、中和抗体
6-8周龄Balb/c小鼠分为2组,Ad5-empty组和Ad5-S33组,每组5只。第0天,阴性组肌注免疫Ad5-empty,Ad5-S33组(样品组)肌注免疫Ad5-S33,剂量均为:1×109vp/只,均采用肌注的接种方式;第28天,眼眶取血并分离血清。假病毒中和抗体的测定具体操作为:
(1)将待检测的血清于56℃水浴灭活30min,6000g离心3min。将血清进行30倍梯度稀释。
(2)用DMEM无血清培养基将原始和Beta假病毒(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:DD1502-01/02/03和DD1445-01/02/03)分别稀释至1.3×104TCID50/ml与上述稀释的血清充分混匀,置于细胞培养箱中(37℃,5%CO2)孵育1小时。
(3)将孵育后的血清加入96孔板的ACEII细胞中,放入细胞培养箱中,37℃,5%CO2培养72小时。
(4)72小时后从细胞培养箱中取出96孔板,用多道移液器从每个上样孔中吸弃100μl上清,然后加入100μl荧光素酶检测试剂,室温避光反应2min。
(5)计算中和抑制率:抑制率=[1-(样品组的发光强度均值-空白对照发光强度均值)/(阴性组的发光强度均值-空白对照值发光强度均值)]×100%。所述空白对照指的是96孔细胞背景值。
(6)根据中和抑制率结果,利用Reed-Muench法计算IC50。
结果如图5所示:该疫苗可以刺激小鼠机体产生较高滴度的针对原始株(SARS-CoV-2原始株)的特异性中和抗体。如图6所示:该疫苗可以刺激小鼠机体产生较高滴度的Beta株(SARS-CoV-2-Beta)的特异性中和抗体。
本发明提供了一种预防和/或治疗原始株新冠病毒和Beta株新冠病毒传播感染的疫苗,本发明的关键点是将Beta株的S和原始株的RBD基因通过高效自剪切P2A进行连接,其不但可以表达Beta株的S蛋白的抗原蛋白,而且可以表达原始株的RBD蛋白的抗原,免疫机体后可产生针对Beta突变株的SARS-CoV-2的中和抗体,而且还可以产生针对原始株SARS-CoV-2的中和抗体。是解决目前上市新冠疫苗针对Beta突变株的保护效果下降,免疫逃逸问题,弥补了目前市面上新冠疫苗针对Beta突变株作用降低的薄弱环节。本发明提供的新型腺病毒疫苗载体,可以有效保护机体免受Beta株SARS-CoV-2和原始株SARS-CoV-2的侵染。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司
<120> 一种用于预防SARS-CoV-2原始株和Beta株的腺病毒载体疫苗
<130>
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
aggacccagc tgccacctgc ctataccaat agcttcacac ggggcgtgta ctatcccgac 120
aaggtgttta gatctagcgt gctgcactcc acccaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180
aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240
aatccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg caccacactg gacagcaaga cccagtccct gctgatcgtg 360
aacaatgcca caaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatcccttc 420
ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag tcttggatgg agagcgagtt tagggtgtat 480
tcctctgcca acaattgcac ctttgagtac gtgagccagc ctttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600
ttcaagatct actccaagca cacaccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660
tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgacc ccaggcgaca gctcctctgg atggacagca 780
ggagctgccg cctactatgt gggctatctg cagccccgca ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaatggca ccatcacaga cgcagtggat tgcgccctgg accccctgtc tgagaccaag 900
tgtacactga agagctttac agtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtg 960
cagccaacag agtccatcgt gcgctttccc aatatcacca acctgtgccc ttttggcgag 1020
gtgttcaatg ccacacgctt cgccagcgtg tacgcctgga ataggaagcg catctccaac 1080
tgcgtggccg actattctgt gctgtacaac agcgcctcct tctctacctt taagtgttat 1140
ggcgtgagcc ccaccaagct gaatgatctg tgctttacaa acgtgtacgc cgattccttc 1200
gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agaccggcaa gatcgcagac 1260
tacaattata agctgcctga cgatttcaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 1320
ctggatagca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagtctaat 1380
ctgaagccat tcgagcggga catctccacc gagatctacc aggccggctc tacaccctgc 1440
aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcagt cctacggctt ccagccaacc 1500
aacggcgtgg gctatcagcc ctacagagtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgca 1560
cctgcaaccg tgtgcggccc aaagaagagc acaaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggactgac cggcacaggc gtgctgaccg agagcaacaa gaagttcctg 1680
ccatttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 1740
accctggaga tcctggacat cacaccatgt tccttcggcg gcgtgtctgt gatcacccca 1800
ggcaccaata catccaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg cacagaggtg 1860
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aacgtgttcc agacaagagc cggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caatagctat 1980
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atctgtcacg atggcaaggc ccactttcct agggagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccacaga tcatcaccac agacaatacc 3360
ttcgtgtccg gcaactgcga cgtggtcatc ggcatcgtga acaatacagt gtatgatcct 3420
ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480
agccccgacg tggatctggg cgacatctct ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg acagactgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgatctg 3600
caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccct ggtatatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720
tgttcctgcc tgaagggctg ctgttcttgt ggcagctgct gtaagtttga tgaggacgat 3780
tccgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacaccg gctctggtgc taccaatttc 3840
tcccttctga aacaagccgg tgacgtcgag gaaaacccag gccctatgga tgccatgaag 3900
aggggcctgt gctgtgtgct gctgctgtgt ggcgctgtct ttgtctctgc ccgggtgcag 3960
cccacagagt ccattgtcag gttccccaac atcaccaacc tgtgcccatt tggcgaggtc 4020
ttcaatgcca cacgctttgc ctctgtctat gcctggaaca ggaagaggat ctccaactgt 4080
gtggctgact actctgtgct gtacaactct gcctccttct ccacatttaa gtgctatggc 4140
gtctccccca ccaagctgaa tgacctgtgc ttcaccaatg tctatgctga ctcctttgtg 4200
atccggggcg atgaagttag gcagattgcc cctggccaga caggcaagat tgctgactac 4260
aactacaagc tgcctgatga cttcaccggc tgtgtgattg cctggaactc caacaacctg 4320
gactctaaag ttggcggcaa ctacaactac ctgtacaggc tgttcaggaa gtccaacctg 4380
aagccatttg agagggacat ctccacagag atctaccagg ctggctccac cccatgcaat 4440
ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc ctgcaatcct atggcttcca acccaccaat 4500
ggcgtgggct accagccata cagggtggtg gtgctgtcct ttgagctgct gcatgcccct 4560
gccaccgtct gtggccccaa gaagtccacc aacctcgtga agaacaaatg tgtgaacttc 4620
aacttcaacg gcctgacagg cacaggcgtg ctgacagagt ccaacaagaa gttcctgcca 4680
ttccaacagt ttggcaggga cattgctgac accaccgatg ctgtcaggga cccccagacc 4740
ctggagatcc tggacatcac cccatgctcc taaactag 4778
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtaccgagc tcggatccgc caccatgttc gtgtttctgg tgctgctgcc tctggtg 57
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatgttgccg gtctgtcctg gtgcgatctg gcgcacctcg tcgcccctg 49
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggacagaccg gcaacatcgc agactacaat tataagctgc ctgacg 46
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acagttaaag cccttcacgc cattgcaggg tgtagagccg gcctggtag 49
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggatccgagc tcggtaccaa gcttaagttt aaacgctaga gtccgg 46
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtgaagggct ttaactgtta tttccctctg cagtcctacg gcttcc 46
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attggtagca ccagagccgg tgtagtgcag cttcacgccc ttcagcacag gctcgg 56
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttctgaaaca agccggtgac gtcgaggaaa acccaggccc tatggatgcc atgaagagg 59
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agaatagggc cctctagact agtttaggag catggggtga tgtccaggat ctcc 54
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctagagggc cctattctat agtgtc 26
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttggattgaa gccaatatga taatgagggg gtgg 34
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcatcggtcg aggacaggcc tctcaagtct gtatac 36
Claims (14)
1.一种核酸分子,所述核酸分子包含以下核酸序列:
a)SEQ ID NO:5所示核酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子可在人源细胞或人体内表达蛋白,所述蛋白可在人体内:
诱导免疫应答;或
产生生物报告分子;或
产生用于检测的分子;或
能调节基因功能;或
成为治疗性分子。
3.一种表达载体,其特征在于,所述载体含有权利要求1所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述载体为病毒载体。
5.根据权利要求3所述的表达载体,所述载体为腺病毒载体。
6.根据权利要求3所述的表达载体,所述载体为Ad5载体。
7.一种表达细胞,其特征在于,所述表达细胞基于权利要求1所述核酸分子表达蛋白。
8.一种疫苗,其特征在于,所述疫苗包括:a)SEQ ID NO:5所示核酸序列。
9.根据权利要求8所述疫苗,其特征在于,所述疫苗的载体为病毒载体。
10.根据权利要求9所述疫苗,所述载体为腺病毒载体。
11.根据权利要求9所述疫苗,所述载体为Ad5载体。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的疫苗,其特征在于,所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。
13.根据权利要求8-11中任一项所述疫苗,其特征在于:所述疫苗还包括至少一种对COVID-19有预防和/或治疗作用的药物。
14.权利要求1-2任一项所述核酸分子、权利要求3-6任一项所述表达载体、或权利要求8-13任一项所述疫苗的应用,所述应用包括:
制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物。
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